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Biology

का मुंह बंद Published: August 12, 2015 doi: 10.3791/52849
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

Abstract

गाँठ का शमन करने प्रोटीन बीआरसीए 2 और परंपरागत जैव रासायनिक विश्लेषण के द्वारा अपनी पहचान का मुंह बंद मानव बीआरसीए 2 प्रोटीन (लगभग 390 केडीए) के बड़े आकार के कारण एक महान तकनीकी चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं। हम मानव उपकला कोशिका लाइनों में क्रमशः अंतर्जात बीआरसीए 2 प्रोटीन, मानव बीआरसीए 2 चुप्पी और पता लगाने के लिए मानक siRNA अभिकर्मक और immunoblotting के प्रोटोकॉल के संशोधनों की रिपोर्ट। महत्वपूर्ण कदम एक अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपात करने के लिए उच्च siRNA और एक ही प्रयोग के भीतर siRNA अभिकर्मक के दो बाद के दौर में शामिल हैं। विरोधी बीआरसीए 2 एंटीबॉडी के साथ विश्लेषण immunoblotting द्वारा न्याय के रूप में हम लगातार मानव बीआरसीए 2 जीन के 70% से अधिक मुंह बंद करने को प्राप्त मानक प्रोटोकॉल के लिए इन और अन्य संशोधनों का उपयोग करना। इसके अलावा, बजाय पारंपरिक 70-100 डिग्री सेल्सियस और immunoblotting प्रक्रिया के अन्य तकनीकी अनुकूलन के 55 डिग्री सेल्सियस पर सेल lysates का विकृतीकरण बरकरार बीआरसीए 2 प्रोटीन का पता लगाने के भी क की अनुमति देते हैंसामग्री शुरू करने की बहुत कम मात्रा में एन उपलब्ध हैं या बीआरसीए 2 प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर बहुत कम कर रहे हैं। मानव कोशिकाओं में बीआरसीए 2 के कुशल मुंह बंद करने, ट्यूमर कोशिकाओं सहित बरकरार बीआरसीए 2, के साथ कोशिकाओं में बीआरसीए 2 समारोह को बाधित करने के लिए नए आणविक रास्ते और ट्यूमर में रोगजनक बीआरसीए 2 उत्परिवर्तन से प्रभावित हो सकता है कि सेलुलर कार्यों की जांच के लिए एक मूल्यवान रणनीति प्रदान करता है। कुशल मुंह बंद करने और बीआरसीए 2 जैसे अन्य 'बड़े' प्रोटीन के विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन आसानी से प्राप्त होना चाहिए।

Introduction

बीआरसीए 2 (स्तन कैंसर संवेदनशीलता जीन-2) जीन recombinase एंजाइम Rad51 1 के समारोह के विनियमन के द्वारा डीएनए डबल कतरा टूट जाता है की मरम्मत करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि एक गाँठ का शमन करने के लिए प्रोटीन encodes। बीआरसीए 2 भी प्रतिलेखन के मॉडुलन में और सेल चक्र नियंत्रण 2 में फंसा दिया गया है। बीआरसीए 2 जीन में म्यूटेशन जर्मलाइन अन्य प्रकार के कैंसर 3,4 करने के लिए एक ओटोसोमल प्रमुख पुरुषों में स्तन और महिलाओं में डिम्बग्रंथि के कैंसर और प्रोस्टेट कैंसर के लिए खतरा है, साथ ही गड़बड़ी प्रेरित। हालांकि, दबाने या डीएनए की क्षति 5-7 कारण है कि एजेंटों को कैंसर की कोशिकाओं को और अधिक कमजोर प्रस्तुत करना हो सकता है बीआरसीए 2 समारोह को कम कि कैंसर, बीआरसीए 2 उत्परिवर्तन के विकास में वृद्धि की जोखिम के बावजूद। छिटपुट के कैंसर कि बीआरसीए 2 प्रोटीन, सुझाव बीआरसीए 2 प्रोटीन का स्तर कम कुछ प्रकार के कैंसर में पाया गया है, हालांकि बीआरसीए 2 उत्परिवर्तन (<3%) की दर कम दिखा रहे हैंगैर उत्परिवर्तनीय निर्भर तंत्र 7,8 के माध्यम से छिटपुट कैंसर में tumorigenesis के दौरान खो दिया जा सकता है। इस प्रकार, यह पूरी तरह से कैंसर जीव विज्ञान के संदर्भ में और साथ ही अन्य जैविक सेटिंग्स में बीआरसीए 2 कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

स्तनधारी कोशिकाओं में जीन की उपन्यास कार्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल एक शक्तिशाली उपकरण अपनी अभिव्यक्ति के लिए मौन है। एक उदाहरण के रूप में, सामान्य उपकला कोशिकाओं की एक किस्म में मुंह बंद बीआरसीए 2 अभिव्यक्ति हाल ही में anoikis प्रतिरोध, कैंसर सेल आक्रामक और मेटास्टेटिक क्षमता 9 के अधिग्रहण के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम के नियामक के रूप में बीआरसीए 2 के एक उपन्यास समारोह की पहचान करने के लिए प्रेरित किया है। जीन मुंह बंद करने की कोशिकाओं छोटे दखल (एसआई) आरएनए या विशिष्ट जीन को लक्षित कम बाल के लिये कांटा (एसएच) आरएनए अणुओं में या तो शुरू करने से प्राप्त किया जा सकता है। उच्च siRNA के शक्ति और प्रयोग के अपने आसानी महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में नए अंतर्दृष्टि पाने के उद्देश्य से प्रयोगों के मुंह बंद करने के लिए यह तरजीही उपकरण बनाने के एकएन डी उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए। हालांकि, जीन अभिव्यक्ति के कुशल पछाड़ना सभी जीनों के लिए आसानी से प्राप्त नहीं हो सकता है और सेल प्रकार के आधार पर अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकता है। इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के स्तर में कमी जांच के तहत सबसे अधिक प्रासंगिक फेनोटाइप है, क्योंकि यह जीन उत्पाद का विश्लेषण immunoblotting द्वारा जीन मुंह बंद यों के लिए महत्वपूर्ण है। इस सम्मान के साथ, बीआरसीए 2 प्रोटीन एक और चुनौती प्रस्तुत करता है: एक बड़े प्रोटीन (लगभग 390 केडीए) किया जा रहा है, तकनीकी कठिनाइयों immunoblotting सहित परंपरागत जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए मौजूद है।

हम यहाँ मानव उपकला कोशिका लाइनों में बीआरसीए 2 के कुशल मुंह बंद करने के लिए और विश्लेषण immunoblotting द्वारा पछाड़ना बीआरसीए 2 प्रोटीन का तेजी से और सफल पता लगाने के लिए अनुकूलित एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट।

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Protocol

1. siRNA समाधान तैयार

  1. (: 50 माइक्रोन अंतिम siRNA एकाग्रता) RNase मुक्त पानी के 100 μl में बीआरसीए 2 siRNA सूखे छर्रों के 5 तले में (Ctrl) की nmol और 5 nmol Resuspend। इस siRNA स्टॉक है और 10 μl aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए।
  2. SiRNA स्टॉक से 10 μl के एक विभाज्य लो और 10 माइक्रोन siRNA काम कर समाधान प्राप्त करने के लिए RNase मुक्त पानी के 40 μl जोड़ें। इस कमजोर पड़ने उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए।
    नोट: siRNA काम कर समाधान / ठंड से गुजरना अधिक से अधिक 3 बार विगलन नहीं होना चाहिए।

मानव उपकला कोशिका लाइनों 2. सीडिंग

  1. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में टिशू कल्चर प्लेट में सेल monolayers के रूप में बढ़ रही मानव उपकला कोशिका लाइनों से मध्यम विकास निकालें।
  2. एक बार आर टी पीबीएस के साथ थाली में कोशिकाओं (एक 100 मिमी प्लेट के लिए पीबीएस के 10 मिलीलीटर) को धो लें।
  3. थाली से कोशिकाओं को अलग करने के लिए,0.25% trypsin के 2 मिलीग्राम / 0.53 मिमी EDTA समाधान जोड़ने और सेल प्रकार के आधार पर 3-5 मिनट सेते हैं।
  4. अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करने से पहले, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त पूरा मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बेअसर।
  5. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
  6. एक झूलते बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 320-330 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  7. एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर में सेल छर्रों Resuspend।
  8. एक Burker कक्ष में माइक्रोस्कोप के नीचे या निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक स्वचालित गिनती प्रणाली का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना।
  9. 6 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं को 24 घंटा (अच्छी तरह से 0.5-1 X10 प्रत्येक के लिए मध्यम 2 मिलीलीटर में 6 कोशिकाओं) के बाद के बारे में 80% मिला हुआ हो बीज। इष्टतम सेल नंबर विशेष सेल लाइनों और विकास दर के आधार पर भिन्न हो सकते हैं वरीयता प्राप्त होंगे।
    नोट: एंटीबायोटिक दवाओं को नकारात्मक transfe की दक्षता के साथ हस्तक्षेप करेगा क्योंकि इस बिंदु पर मध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं को न जोड़ेंction है। यह बीआरसीए 2 siRNA अभिकर्मक के उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए कम संस्कृति मार्ग (<10) में कोशिकाओं रहे हैं कि बहुत महत्वपूर्ण है।

SiRNA साथ 3. transfect कोशिकाओं

  1. चौबीस घंटे कोशिकाओं चढ़ाना के बाद, अभिकर्मक के पहले दौर के साथ आगे बढ़ना।
    1. कम सीरम माध्यम के 130 μl में लिपिड आधारित 10 siRNA विशिष्ट अभिकर्मक अभिकर्मक के 6 μl पतला।
    2. कम सीरम माध्यम के 130 μl में 10 माइक्रोन siRNA (30 pmol) के 3 μl पतला।
    3. पतला अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ पतला siRNA का मिश्रण है और आरटी पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. ऊष्मायन के दौरान, कोशिकाओं से मध्यम हटाने और ताजा मध्यम (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गरम के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. कोशिकाओं को siRNA अभिकर्मक अभिकर्मक परिसरों के 250 μl (इस राशि 6 ​​अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह से करने के लिए है) जोड़ें।
    6. 37 पर एक humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते76, 5% सीओ 2 के साथ सी।
  2. 24 घंटे के बाद, कदम 3.1.2 के लिए निम्न संशोधन के साथ 3.1.1-3.1.5 चरणों का दोहरा द्वारा अभिकर्मक के दूसरे दौर के साथ आगे बढ़ना: कम सीरम माध्यम के 130 μl में 10 माइक्रोन siRNA (50 pmol) के 5 μl पतला।
    1. विश्लेषण से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: transfections के और दूसरे दौर में एक उच्च siRNA / अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपात के उपयोग के दो दौर बीआरसीए 2 मुंह बंद करने के लिए उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं।

Immunoblotting के विश्लेषण के लिए 4. Lyse कोशिकाओं

  1. Nonionic, गैर denaturing डिटर्जेंट octylphenoxypolyethoxyethanol का 1%, 5 मिमी सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 1 मिमी सोडियम orthovanadate, 10 मिमी सोडियम फ्लोराइड, 2 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड, 10 माइक्रोग्राम से युक्त पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ नए सिरे lysis बफर तैयार करें / एमएल leupeptin, 10 माइक्रोग्राम / एमएल aprotinin। बर्फ पर रखें।
  2. कोशिकाओं और w से मध्यम निकालेंथाली में ठंड पीबीएस (2 मिलीग्राम / अच्छी तरह) के साथ उन्हें एक बार राख। किसी भी पीबीएस carryover रोकने के लिए, पूरी तरह से थाली से हटा दें।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए lysis बफर के 200 μl जोड़ें।
    नोट: सेल, अन्य assays के लिए भी इस्तेमाल किया कोशिकाओं trypsinize कदम 2.1-2.6 में वर्णित के रूप में और आवेदन के अनुसार उपयुक्त बफर / मध्यम में कोशिकाओं resuspend किया जाना है तो इस्तेमाल किया जाएगा।
  4. धीरे समान रूप से lysis बफर वितरित करने और एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं थाली बारी बारी से।
  5. एक सेल खुरचनी का उपयोग कर बर्फ पर एक microcentrifuge ट्यूब में सेल lysate लीजिए।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए 17,900 XG पर अपकेंद्रित्र और एक नया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन परख का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता उपाय।

5. बीआरसीए 2 immunoblotting के विश्लेषण

  1. 20x Tris- एसीटेट एसडीएस चल रहे बी के 50 मिलीलीटर गिराए द्वारा चल बफर तैयारuffer (50 मिमी Tricine, 50 मिमी Tris बेस, 0.1% एसडीएस, पीएच 8.24) आसुत पानी की 950 मिलीलीटर के साथ।
  2. इस प्रकार के रूप नमूना तैयार: 20 के अंतिम मात्रा करने के लिए 15 कुल सेल lysate के माइक्रोग्राम, 4x नमूना बफर के 5 μl पीएच 8.4 में लिथियम dodecyl सल्फेट युक्त, 10x नमूना एजेंट को कम करने (0.5 एम डीटीटी) के 2 μl, और lysis बफर जोड़ने μl।
    नोट: इस प्रोटोकॉल (5 माइक्रोग्राम के लिए नीचे) भी कुल प्रोटीन की एक कम राशि का उपयोग करते समय सामान्य कोशिका लाइनों में बीआरसीए 2 का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।
  3. 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर नमूने denature।
    नोट: यह 55 डिग्री सेल्सियस उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। बीआरसीए 2 प्रोटीन thermosensitive 11 के बाद से, उच्च denaturing तापमान बरकरार पूर्ण लंबाई (390 केडीए) बीआरसीए 2 प्रोटीन की लगातार नुकसान में परिणाम।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार electrophoretic कक्ष स्थापित करें।
  5. नमूनों और एक precasted जेल पर उच्च आणविक भार पूर्व दाग प्रोटीन मानक के 10 μl (Tris- एसीटेट 3-8%) लोड और अटल बिहारी के लिए 120 वी पर चलानेबाहर 2 घंटा 12। 55 केडीए नीले मार्कर precasted जेल के पत्तों से पहले electrophoretic रन बंद करो।
  6. 20x स्थानांतरण बफर के 50 मिलीलीटर, 100% मेथनॉल के 100 मिलीलीटर और 850 मिलीलीटर पानी के साथ स्थानांतरण बफर तैयार करें।
  7. 5 मिनट के लिए 100% मेथनॉल में भिगोने से PVDF झिल्ली (0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार) को सक्रिय आसुत पानी से कुल्ला और कम से कम 5 मिनट के लिए स्थानांतरण बफर में संतुलित। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरण बफर में स्थानांतरण तंत्र के स्पंज भिगोएँ।
  8. Electrophoretic समय से अधिक है, तो निम्न आदेश (बॉटम-अप) में स्थानांतरण ढेर में सैंडविच इकट्ठा: स्थानांतरण बफर में संतृप्त तीन स्पंज, एक 3mm ग्रेड कागज पत्र स्थानांतरण बफर, जेल, सक्रिय PVDF झिल्ली, एक 3mm में संतृप्त स्थानांतरण बफर में संतृप्त ग्रेड कागज पत्र, तीन स्पंज स्थानांतरण बफर 13,14 में संतृप्त। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात मा 4 डिग्री सेल्सियस पर या 180 में 4 घंटे के लिए 350 मा उपकरण और स्थानांतरण प्रोटीन में स्टैक रखें।
    नोट: उच्च आणविक भार प्रोटीन का पूरा हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए 4 घंटे या रात भर के लिए (निर्माता और सबसे स्थानांतरण प्रोटोकॉल ने सुझाव दिया है के रूप में) होने के नाते बीआरसीए 2 एक बहुत बड़ी प्रोटीन, यह 1 घंटा से स्थानांतरण के समय का विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, के कारण लंबे समय से हस्तांतरण के समय के लिए, यह overheating कम करने और सैंडविच disassembling की सुविधा के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडे कमरे में सोख्ता प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। अर्द्ध शुष्क हस्तांतरण प्रणाली बड़े प्रोटीन स्थानांतरित करने के लिए अच्छा नहीं कर रहे हैं।
  9. स्थानांतरण के बाद, (30 μl विरोधी बीआरसीए 2 खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 5% नोनफेट शुष्क दूध और जांच युक्त टीबीएस-बीच में 0.25% में आरटी पर 1 घंटे (टीबीएस-टी) के लिए यह ब्लॉक, टीबीएस के साथ झिल्ली धोने [: 300 (वी / वी) के कमजोर पड़ने 1] 9 मिलीलीटर टीबीएस-टी + 5% नोनफेट शुष्क दूध में पतला 200 माइक्रोग्राम / एमएल)।
  10. फिर टीबीएस के 10 एमएल में पतला हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के 1 μl के साथ 1 घंटे के लिए फिल्टर सेते हैं, टीबीएस टी के साथ झिल्ली तीन बार (10 मिनट प्रत्येक) धोने-टी + 5% नोनफेट शुष्क दूध। इसके बाद, टीबीएस टी के साथ झिल्ली तीन बार (10 मिनट प्रत्येक) धो लें।
  11. बढ़ाया chemiluminescence (ईसीएल) पश्चिमी सोख्ता पता लगाने अभिकर्मक का उपयोग कर निर्माता के निर्देशों का पालन बीआरसीए 2 प्रोटीन प्रकट करने के लिए ईसीएल द्वारा immunodetection के प्रदर्शन करना। उच्च संकल्प ईसीएल फिल्मों पर immunochemiluminescent बैंड कल्पना।
  12. 10 में विरोधी ट्यूबिलिन एंटीबॉडी की 1000 (10 μl: β ट्यूबिलिन के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग 1 पर पतला द्वारा लोडिंग नियंत्रण के रूप में एक ही फिल्टर पर, β ट्यूबिलिन (55 केडीए) की तरह, एक गृह व्यवस्था जीन के लिए एक एंटीबॉडी के साथ immunodetection सम्पन्न आरटी पर 1 घंटे के लिए मिलीलीटर टीबीएस-टी + 5% गैर वसा शुष्क दूध)। हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित विरोधी माउस के बजाय विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग के लिए छोड़कर, धोने और बीआरसीए 2 (5.10-5.11) के लिए वर्णित के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हैं।
  13. (Immunochemiluminescent बैंड के साथ प्रभावित फिल्मों की एक डिजिटल छवि मोल और समर्पित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के द्वारा बैंड तीव्रता का विश्लेषण जैसे।, ImageJ)।

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Representative Results

सेल कार्यों पर बीआरसीए 2 मुंह बंद करने के प्रभाव की जांच करने के लिए एक जैविक / जैव रासायनिक परख के साथ आगे बढ़ने से पहले, पहला कदम एक तले siRNA (siRNA गैर लक्षित कर) बीआरसीए 2 siRNA के साथ कंधे से कंधा मिलाकर (चित्रा 1 ए का उपयोग करके मुंह बंद करने की विशिष्टता पुष्टि करने के लिए है )। यह बीआरसीए 2 मुंह बंद करने के लिए एक उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए एक उच्च siRNA / अभिकर्मक अनुपात के साथ siRNA अभिकर्मक के दूसरे दौर में प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है। दरअसल, siRNA अभिकर्मक का केवल एक दौर के प्रदर्शन या कम पछाड़ना दक्षता (चित्रा 1 बी) में नतीजा होगा दूसरा दौर (siRNA के 25 pmol और अभिकर्मक अभिकर्मक के 6 μl) में अभिकर्मक अनुपात करने के लिए एक कम siRNA इस्तेमाल करते हैं। दूसरे चरण के लिए जीन मुंह बंद करने के उच्चतम स्तर को प्राप्त करने के लिए इष्टतम कम से कम समय का आकलन करना है। सेल के प्रकार पर निर्भर करता है, इस siRNA अभिकर्मक के दूसरे दौर के बाद 24 और 48 के बीच घंटा भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, 24 घंटा Nthy थायराइड की कोशिकाओं के लिए पर्याप्त हैं लेकिन अप करने के लिए 48घंटा PNT1A प्रोस्टेट कोशिकाओं में कुशल बीआरसीए 2 पछाड़ना (2A चित्रा) के लिए आवश्यक हैं। बीआरसीए 2 मुंह बंद दूसरा अभिकर्मक चक्र (चित्रा 2 बी) के बाद 7 दिन तक काफी स्थिर है। ध्यान से, 55 डिग्री सेल्सियस (5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस) से ऊपर तापमान पर सेल lysates denaturing, कारण बीआरसीए 2 11 की thermosensitivity को बीआरसीए 2 प्रोटीन (चित्रा -2) के 50% तक नुकसान में परिणाम है।

इष्टतम मुंह बंद करने के लिए समय की स्थापना की है, एक बार बीआरसीए 2 प्रोटीन की हानि के प्रभाव को कई assays में शोषण किया जा सकता है। डीएनए की क्षति 15-18 कारण है कि अन्य chemotherapeutic दवाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से PARP अवरोधकों के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि हुई बढ़ावा देने बीआरसीए 2 के समारोह के नुकसान का कारण यह है कि इन विवो म्यूटेशन के बाद से, एक आम परख PARP अवरोध करनेवाला rucaparib को बीआरसीए 2 -silenced कोशिकाओं की संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए है या oloparib। चित्रा 3 में सूचना दी प्रयोग में, PNT1A कोशिकाओं ओ समाप्त होsiRNA के माध्यम से च बीआरसीए 2 प्रोटीन सेल प्रसार एक MTT आधारित सेल प्रसार परख द्वारा मूल्यांकन किया गया है, जिसके बाद 24 घंटे के लिए 10 माइक्रोन rucaparib, के साथ इलाज किया गया है। Rucaparib उपचार (चित्रा 3) के बाद सेल प्रसार में एक समय पर निर्भर कमी में बीआरसीए 2 प्रोटीन परिणामों की कमी।

चित्र 1
चित्रा 1. अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपात करने के लिए अभिकर्मक और उच्च siRNA के दो दौर बीआरसीए 2 मुंह बंद करने में सुधार होगा। (ए) बीआरसीए 2 मुंह बंद करने की विशिष्टता बीआरसीए 2 प्रोटीन के स्तर की तुलना के लिए नियंत्रण के रूप में तले हुए siRNA (Ctrl) का उपयोग कर, अभिकर्मक के दूसरे दौर के बाद विश्लेषण 24 घंटा immunoblotting द्वारा Nthy कोशिकाओं में पुष्टि की गई। आण्विक वजन मार्करों छोड़ दिया पर रिपोर्ट कर रहे हैं। (बी) PNT1A कोशिकाओं बीआरसीए 2 एस के 1 या 2 चक्रों के अधीन थेप्रोटोकॉल में वर्णित [साइकिल (#) 1 और 2] और बीआरसीए 2 प्रोटीन की कमी immunoblotting के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था के रूप में IRNA अभिकर्मक। तले हुए siRNA साथ अभिकर्मक के दो चक्रों नियंत्रण (Ctrl) के रूप में इस्तेमाल किया गया। 2 बी में, PNT1A कोशिकाओं को एक संशोधन (25 pmol siRNA / 6 μl अभिकर्मक अभिकर्मक) के रूप में दूसरे चक्र में अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपात करने के लिए एक कम siRNA का उपयोग कर बीआरसीए 2 siRNA अभिकर्मक के दो चक्रों के अधीन थे। सभी मामलों में, बीआरसीए 2 प्रोटीन का स्तर दूसरे चक्र के बाद 48 घंटा विश्लेषण किया गया। तल में, बीआरसीए 2 प्रोटीन के स्तर की मात्रा का ठहराव बीआरसीए 2 / ट्यूबिलिन अनुपात के रूप में सूचना दी है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
बीआरसीए 2 पछाड़ना 2. अनुकूलन चित्रा। (ए) Optimअल बीआरसीए 2 पछाड़ना दूसरा siRNA अभिकर्मक चक्र के बाद 24 से 48 घंटा आवश्यकता हो सकती है। दो अलग अलग सेल लाइनों (PNT1A और Nthy) बीआरसीए 2 पछाड़ना 24 घंटा और विश्लेषण immunoblotting द्वारा दूसरे siRNA अभिकर्मक चक्र के बाद 48 घंटे के लिए मूल्यांकन किया गया। तल में, बीआरसीए 2 प्रोटीन का स्तर 100 डाटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसई मतलब ± का प्रतिनिधित्व करते हैं पर सेट, समय 0 घंटा में स्तरों के प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं। (बी) बीआरसीए 2 पछाड़ना 7 दिनों के लिए स्थिर है। PNT1A कोशिकाओं immunoblotting के द्वारा दूसरे siRNA अभिकर्मक चक्र के बाद 196 घंटे तक बीआरसीए 2 पछाड़ना के लिए मूल्यांकन किया गया। ट्यूबिलिन संकेत करने के लिए बीआरसीए 2 के अनुपात तल पर सूचना दी है। (सी) बीआरसीए 2 प्रोटीन thermosensitive है। गैर ट्रांसफ़ेक्ट PNT1A कोशिकाओं प्रोटोकॉल के अनुसार (लगभग 70 confluency%) चढ़ाना के बाद 24 घंटा एकत्र की है और lysed रहे थे। एक ही सेल lysate (15 माइक्रोग्राम कुल प्रोटीन) के दो aliquots के 10 मिनट के लिए या 100 & # 55 डिग्री सेल्सियस पर या तो विकृत किया गया176, 5 मिनट और बीआरसीए 2 प्रोटीन के स्तर के लिए सी immunoblotting के द्वारा मूल्यांकन किया गया। तल में, ट्यूबिलिन संकेत करने के लिए बीआरसीए 2 के अनुपात सूचना दी है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. बीआरसीए 2 मुंह बंद PARP अवरोध करनेवाला rucaparib करने के लिए सेल संवेदनशीलता बढ़ जाती है। PNT1A कोशिकाओं या तो नियंत्रण (Ctrl) या बीआरसीए 2 siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट अभिकर्मक के बाद 48 घंटा एकत्र की है और 96 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया गया (2000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से)। 24 घंटे के बाद, 10 माइक्रोन rucaparib कोशिकाओं 96 घंटा अप करने के लिए दवा के अभाव में रखा गया था, जिसके बाद 24 घंटा, के लिए कोशिकाओं को जोड़ा गया है। 690 एनएम - सेल प्रसार 550 पर absorbance को मापने के द्वारा MTT परख का उपयोग संकेत समय पर मूल्यांकन किया गया था। पूर्वी वायु कमानएच समय बिंदु एक प्रतिनिधि प्रयोग से तीन कुओं का मतलब ± एसडी प्रतिनिधित्व करता है। Ctrl siRNA, नीली रेखा; बीआरसीए 2 siRNA, लाल रेखा। शीर्ष पर, बीआरसीए 2 siRNA ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में बीआरसीए 2 प्रोटीन प्रोफाइल की सूचना दी है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

महिला और पुरुष स्तन कैंसर, डिम्बग्रंथि के कैंसर, प्रोस्टेट कैंसर, अग्नाशय के कैंसर, और मेलेनोमा 3,4 सहित कई प्रकार के कैंसर का खतरा बढ़ बीआरसीए 2 जीन नेतृत्व के germline म्यूटेशन, अध्ययन के लिए कई जैविक समारोह को समझने के लिए शुरू किए गए हैं क्योंकि बीआरसीए 2 प्रोटीन की। इन अध्ययनों में से अधिकांश के कारण बीआरसीए 2 की तरह एक विशाल प्रोटीन का विश्लेषण करने में तकनीकी कठिनाइयों के आनुवंशिक आधारित मुख्य रूप से कर रहे हैं। बीआरसीए 2 प्रोटीन अभिव्यक्ति मुंह बंद करने और विश्लेषण करने के लिए यहाँ वर्णित विधि जैविक assays के एक व्यापक स्पेक्ट्रम में बीआरसीए 2 ट्यूमर शमन करने वाले जीन के कार्यों की जांच के लिए एक कुशल उपकरण प्रदान करता है। मुंह बंद प्रोटोकॉल अभी तक बीआरसीए 2 का सफल और लगातार पछाड़ना के लिए कई महत्वपूर्ण संशोधनों के साथ ही सुझाव शामिल मानक siRNA अभिकर्मक प्रक्रियाओं पर आधारित है। siRNA अभिकर्मक प्रोटोकॉल आमतौर पर लेन का इस्तेमाल करता है जो shRNA, से अलग, सुरक्षित, तेजी से और कुशल है औरtiviral वैक्टर, विशिष्ट जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं की जरूरत नहीं है और आसानी से एक सेल संस्कृति सुविधा से लैस किसी भी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है। इसी तरह, immunoblotting के प्रोटोकॉल बीआरसीए 2 की तरह एक बड़े प्रोटीन की कुशल पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है। immunoblotting के प्रोटोकॉल भी heterologously खमीर कोशिकाओं 9 में व्यक्त पुनः संयोजक मानव बीआरसीए 2 प्रोटीन का पता लगाने के लिए मान्य किया गया है।

SiRNA के कुशल प्रसव के लिए कई महत्वपूर्ण कारकों यहाँ रिपोर्ट कर रहे हैं। उन्होंने विशेष रूप से दूसरे चक्र में दो transfections के चक्र और अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपात करने के लिए एक उच्च siRNA, शामिल हैं। अभिकर्मक प्रक्रिया से पहले एंटीबायोटिक दवाओं के दौरान अनुपस्थिति एक अन्य महत्वपूर्ण कारक है। हालांकि, इस प्रक्रिया जीवाणु संक्रमण का खतरा बढ़ संस्कृति में कोशिकाओं को उजागर करता है; इस प्रकार अतिरिक्त सावधानी सभी चरणों में बाँझपन के एक उच्च स्तर की गारंटी करने के लिए लिया जाना चाहिए। यह ध्यान दिया जाना चाहिए, सेल प्रकार पर निर्भर करता है, कुशल जीन knockdo किWN आम तौर पर दूसरे चक्र के बाद 24-48 घंटे की आवश्यकता होगी। वर्तमान पद्धति में कम से कम 7 दिन दूसरा अभिकर्मक चक्र के बाद जब तक काफी स्थिर मुंह बंद जीन रखने का फायदा है। यह अलग chemotherapeutic दवाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया सहित जैविक assays के, की एक किस्म में पछाड़ना बीआरसीए 2 के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है। हालांकि, वर्तमान तकनीक की एक सीमा बहिर्जात siRNA अणुओं जीनोम में एकीकृत नहीं कर रहे हैं कि इस तथ्य से प्रतिनिधित्व किया है, जीन अभिव्यक्ति के इस प्रकार स्थिर पछाड़ना हासिल नहीं किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, स्थिर पछाड़ना प्राप्त करने के लिए, shRNA lentiviral संक्रमण प्रयोगशाला अतिरिक्त जैव सुरक्षा आवश्यकताओं (बीएसएल -2 मानकों एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुसार) के लिए तैयार किया जाता है, कि प्रदान किया जा सकता है। अभिकर्मक एक विशिष्ट प्रकार की कोशिका में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए (उदाहरण के लिए।, टी lymphocytes) एक लागू दृष्टिकोण नहीं है जब इसके अलावा, सेल विशिष्ट सशर्त बीआरसीए 2 पीटा चूहों का उपयोग केवल altern बनी हुई है19 ative।

इस विधि को भी रिपोर्ट immunoblotting के द्वारा एक उच्च आणविक भार प्रोटीन के सफल पता लगाने के लिए कई सुझाव दिए गए हैं और यह उच्च और निम्न बहुतायत प्रोटीन दोनों के लिए उपयुक्त है। कारण बीआरसीए 2 प्रोटीन की thermosensitivity करने के लिए, विशेष रूप से, एक कम denaturing तापमान पिछले एक अध्ययन में 11 के साथ समझौते में, अपने इष्टतम का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है। इस तकनीकी 'चाल' भी मानक immunoblotting के प्रोटोकॉल के द्वारा पता लगाने असफल साबित हो गया है जिसके लिए अन्य प्रोटीन के लिए उपयोगी हो सकता है। हम इस पद्धति का मुंह बंद करने और कई अन्य को चुनौती देने के लिए प्रोटीन का पता लगाने की सुविधा हो सकती है, इस प्रकार सामान्य वैधता के सुझाव शामिल हैं और आशा करते हैं कि।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BRCA2 siRNA Dharmacon L-003462-00 SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNA Dharmacon  D-001810-10-05 ON-TARGETplus Non-targeting Pool
Lipofectamine RNAiMAX Reagent  Life Technologies 13778075 Transfection Reagent
OPTI-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Medium for transfection procedure
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast Life Technologies EA0378 Gel for protein electrophoresis
NuPAGE LDS Sample buffer  Life Technologies NP0007 Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing agent (10x) Life Technologies NP0004 Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Antioxidant Life Technologies NP0005 Reagent for protein electrophoresis
HiMark Pre-stained protein standard Life Technologies LC5699 Prestained marker for gel electrophoresis
XCell SureLoc Mini-Cell  System Life Technologies EI0002 Equipment for protein electrophoresis/transfer
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer Life Technologies LA0041 Reagent for Western blotting
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Reagent for Western blotting
NuPAGE Transfer Buffer Life Technologies NP0006-1 Reagent for Western blotting
BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8326 1:300 dilution
Beta-tubulin monoclonal antibody Sigma Aldrich T4026-100UL 1:1,000 dilution
Skim Milk powder Sigma Aldrich 70166 Reagent for Western blotting
Tween-20 Sigma Aldrich P1379 Reagent for Western blotting
SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate Pierce Thermo Scientific 34080/34096 Chemiluminescence system
PNT1A cells SIGMA Aldrich (for ECACC) 95012614 PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40
Nthy cells SIGMA Aldrich (for ECACC) 90011609 Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells
Cell Proliferation Kit I (MTT) Roche 11465007001 Kit for cell proliferation assays

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 102 बीआरसीए 2 siRNA मानव कोशिका लाइनों जीन मुंह बंद करने अभिकर्मक immunoblotting
का मुंह बंद<em&gt; बीआरसीए 2</em&gt; सभ्य मानव कोशिकाओं में उपन्यास बीआरसीए 2 विनियमित जैविक कार्यों को पहचानें
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Moro, L., Guaragnella, N.,… More

Moro, L., Guaragnella, N., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells. J. Vis. Exp. (102), e52849, doi:10.3791/52849 (2015).

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