Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إسكات Published: August 12, 2015 doi: 10.3791/52849
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

Abstract

إسكات الكابتة للورم البروتين BRCA2 وكشف من خلال التحليلات الكيميائية الحيوية التقليدية تمثل تحديا تقنيا كبيرا نظرا لحجم كبير من البروتين البشري BRCA2 (حوالي 390 كيلو دالتون). نفيدكم التعديلات ترنسفكأيشن وimmunoblotting بروتوكولات سيرنا القياسية لإسكات BRCA2 البشري وكشف الذاتية البروتين BRCA2، على التوالي، في خطوط الخلايا الظهارية الإنسان. وتشمل الخطوات الرئيسية لسيرنا ارتفاع نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لواثنين من الجولات اللاحقة من سيرنا ترنسفكأيشن داخل نفس التجربة. باستخدام هذه وغيرها من التعديلات على بروتوكول قياسي نحن باستمرار تحقيق أكثر من 70٪ إسكات الجينات BRCA2 البشري كما تقرره immunoblotting التحليل مع أضداد BRCA2. بالإضافة إلى ذلك، تمسخ من الخلية لست] في 55 ° C بدلا من التقليدية 70-100 ° C والتحسينات التقنية الأخرى من الإجراء immunoblotting السماح الكشف عن البروتين BRCA2 سليمة حتى WHأون كميات قليلة جدا من بدء المواد المتاحة أو عندما تكون مستويات بروتين تعبير BRCA2 منخفضة جدا. إسكات الفعال للBRCA2 في الخلايا البشرية يقدم استراتيجية ثمينة لتعطيل وظيفة BRCA2 في الخلايا مع BRCA2 سليمة، بما في ذلك الخلايا السرطانية، لدراسة المسارات الجزيئية الجديدة والوظائف الخلوية التي قد تتأثر طفرات BRCA2 المسببة للأمراض في الأورام. وينبغي أن يكون التكيف هذا البروتوكول لإسكات وتحليل البروتينات الأخرى كبيرة "مثل BRCA2 كفاءة تحقيقه بسهولة.

Introduction

بترميز الجين BRCA2 (سرطان الثدي قابلية الجينات 2) لبروتين القامع الورم الذي يلعب دورا حاسما في إصلاح DNA فواصل مزدوج الجديلة من خلال تنظيم وظيفة الانزيم recombinase Rad51 1. كما تم المتورطين BRCA2 في التشكيل النسخ والسيطرة في الخلية دورة 2. الطفرات سلالة الجرثومية في الجين BRCA2 تحفز الحساسية جسمية مهيمنة لسرطان الثدي وسرطان المبيض لدى النساء وسرطان البروستاتا لدى الرجال، فضلا عن الاستعداد لأنواع السرطان الأخرى 3،4. ومع ذلك، على الرغم من زيادة خطر في الاصابة بسرطان، والطفرات BRCA2 التي تقمع أو الحد من وظيفة BRCA2 قد تجعل الخلايا السرطانية أكثر عرضة لعوامل العلاج الكيميائي الذي يسبب التلف في الحمض النووي 07/05. السرطان متفرقة يحمل انخفاض معدل الطفرات BRCA2 (<3٪) على الرغم من انخفاض مستويات البروتين BRCA2 قد تم الكشف عنها في بعض أنواع السرطان، مما يشير إلى أن البروتين BRCA2قد يتم فقدان أثناء تكون الأورام في أمراض السرطان متفرقة خلال آليات غير طفري ​​التي تعتمد على 7،8. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم بشكل كامل وظائف BRCA2 في سياق بيولوجيا السرطان وكذلك في إعدادات البيولوجية الأخرى.

أداة قوية تستخدم لتحديد وظائف جديدة من الجينات في خلايا الثدييات هي لإسكات تعبيرها. وكمثال على ذلك، فقد أدت إسكات التعبير BRCA2 في مجموعة متنوعة من الخلايا الظهارية الطبيعية مؤخرا إلى تحديد وظيفة جديدة للBRCA2 كمنظم للمقاومة anoikis، خطوة هامة خلال الاستحواذ على الخلايا السرطانية الغازية والمتنقل قدرة 9. لا يمكن أن يتحقق الجينات إسكات عن طريق إدخال في الخلايا إما صغير التدخل (سي) RNA أو دبوس الشعر القصير (ش) جزيئات الحمض النووي الريبي استهداف جين معين. رجولية عالية من سيرنا وسهولة الاستخدام جعله أداة تفضيلية لإسكات التجارب التي تهدف إلى اكتساب رؤى جديدة في العمليات البيولوجية الهامة لالثانية لتحديد أهداف علاجية جديدة. ومع ذلك، ضربة قاضية كفاءة في التعبير الجيني قد لا تكون قابلة للتحقيق بسهولة لجميع الجينات وربما يكون متغير بدرجة كبيرة اعتمادا على نوع من الخلايا. بسبب انخفاض في مستويات البروتين داخل الخلايا هو النمط الظاهري الأكثر ملاءمة قيد التحقيق، لا بد من تحديد إسكات الجينات التي immunoblotting تحليل للمنتج الجين. مع هذا الصدد، يقدم البروتين BRCA2 تحديا آخر: كونه بروتين كبير (حوالي 390 كيلو دالتون)، والصعوبات التقنية موجودة لتحليل الكيمياء الحيوية التقليدية، بما في ذلك immunoblotting.

نحن هنا التقرير بروتوكول الأمثل لإسكات الفعال للBRCA2 في خطوط الخلايا الظهارية الإنسان وللكشف السريع والناجح من البروتين BRCA2 ضربة قاضية من قبل immunoblotting التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحلول سيرنا

  1. و resuspend 5 نانومول من مخلوط (السيطرة) و 5 نانومول من BRCA2 سيرنا الكريات المجففة في 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه (تركيز سيرنا النهائي: 50 ميكرومتر). هذا هو مخزون سيرنا ويجب تخزينها في -20 درجة مئوية في 10 مكل.
  2. اتخاذ قسامة من 10 ميكرولتر من الأسهم سيرنا وإضافة 40 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه للحصول على حل العاملة 10 ميكرومتر سيرنا. يجب أن يتم تخزين هذا التخفيف في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: الحل العمل سيرنا لا ينبغي أن تخضع لتجميد / الذوبان أكثر من 3 مرات.

2. البذر من الظهارية الإنسان خطوط الخلايا

  1. إزالة المتوسطة النمو من خطوط الخلايا الظهارية الإنسان متنامية مع الطبقات الوحيدة الخلية في لوحات زراعة الأنسجة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  2. غسل الخلايا في لوحة واحدة مع RT PBS (10 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 100 ملم لوحة).
  3. لفصل الخلايا من لوحة،إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين / 0.53 ملي EDTA الحل واحتضان 3-5 دقائق اعتمادا على نوع من الخلايا.
  4. قبل جمع خلايا منفصلة، ​​تحييد التربسين بإضافة 2 مل من وسط النمو تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني.
  5. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل.
  6. الطرد المركزي الخلايا في 320-330 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية في الدوار الدلو المتأرجح.
  7. Resuspend وكريات خلية في 5 مل من المضادات الحيوية مجانا المتوسطة.
  8. عد الخلايا تحت المجهر في غرفة Burker أو باستخدام نظام العد الآلي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  9. البذور الخلايا في 6 لوحات جيدا لتكون حوالي 80٪ متموجة بعد 24 ساعة (0.5-1 X10 6 الخلايا في 2 مل من المتوسط ​​لكل بئر). عدد الخلايا الأمثل ليكون المصنف قد تختلف اعتمادا على خطوط معينة من الخلايا ومعدل النمو.
    ملاحظة: لا تقم بإضافة المضادات الحيوية على المدى المتوسط ​​عند هذه النقطة لأن المضادات الحيوية سوف تتداخل سلبيا مع كفاءة حوالةction. من المهم جدا أن الخلايا هي في الممرات ثقافة منخفضة (<10) لتحقيق كفاءة عالية من BRCA2 سيرنا ترنسفكأيشن.

3. خلايا Transfect مع سيرنا

  1. بعد أربع وعشرين ساعة طلاء الخلايا، المضي قدما في الجولة الأولى من ترنسفكأيشن.
    1. تمييع 6 ميكرولتر من الدهون على أساس 10 سيرنا كاشف ترنسفكأيشن محدد في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل.
    2. تمييع 3 ميكرولتر من 10 ميكرومتر سيرنا (30 بمول) في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل.
    3. الجمع بين سيرنا المخفف مع كاشف ترنسفكأيشن المخفف واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في RT.
    4. أثناء الحضانة، وإزالة المتوسطة من الخلايا وإضافة 2 مل من متوسطة جديدة قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية (من دون مضادات حيوية).
    5. إضافة 250 ميكرولتر من المجمعات كاشف سيرنا ترنسفكأيشن إلى الخلايا (هذا المبلغ هو بئر واحدة من لوحة 6 أيضا).
    6. احتضان الخلايا في حاضنة ترطيب عند 3776؛ C مع 5٪ CO 2.
  2. بعد 24 ساعة، المضي قدما في الدور الثاني من ترنسفكأيشن بتكرار الخطوات 3.1.1-3.1.5 مع التعديلات التالية لخطوة 3.1.2: تمييع 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر سيرنا (50 بمول) في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل.
    1. احتضان الخلايا لمدة 1-2 أيام عند 37 درجة مئوية قبل التحليل.
      ملاحظة: جولتان من transfections واستخدام نسبة عالية كاشف سيرنا / ترنسفكأيشن في الجولة الثانية ضرورية للحصول على كفاءة عالية من BRCA2 إسكات.

4. الخلايا ليز لتحليل immunoblotting

  1. إعداد العازلة تحلل جديدة مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) تحتوي على 1٪ من غير أيوني، غير تغيير طبيعة المنظفات octylphenoxypolyethoxyethanol، 5 ملي بيروفسفات الصوديوم، 1 ملم orthovanadate الصوديوم، و 10 ملي فلوريد الصوديوم، 2 مم phenylmethylsulfonyl الفلوريد، 10 ميكروغرام / مل leupeptin، 10 ميكروغرام / مل أبروتينين. يبقيه على الجليد.
  2. إزالة متوسطة من الخلايا وثرماد لهم مرة واحدة مع PBS الباردة (2 مل / جيد) في لوحة. لمنع أي المرحل PBS، إزالة ذلك من لوحة.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من تحلل العازلة على كل جانب.
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا يجب أن تستخدم أيضا لفحوصات أخرى، يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2،1-2،6 وresuspend الخلايا غير مناسب العازلة / متوسطة وفقا للتطبيق لاستخدامها.
  4. تناوب بلطف لوحة لتوزيع موحد للتحلل العازلة واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية على محور دوار.
  5. جمع المحللة خلية في أنبوب microcentrifuge على الجليد باستخدام مكشطة الخلية.
  6. الطرد المركزي في 17900 x ج لمدة 25 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع طاف في أنبوب جديد.
  7. قياس تركيز البروتين باستخدام فحص البروتين المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

تحليل immunoblotting 5. BRCA2

  1. إعداد المخزن المؤقت تشغيل عن طريق تمييع 50 مل من 20X تريس، خلات SDS تشغيل بuffer (50 ملي Tricine، 50 ملي تريس قاعدة، 0.1٪ SDS، ودرجة الحموضة 8.24) مع 950 مل من الماء المقطر.
  2. تحضير العينة على النحو التالي: إضافة 15 ميكروغرام من إجمالي المحللة الخلية، 5 ميكرولتر من 4X عينة العازلة التي تحتوي على ليثيوم دوديسيل كبريتات في الرقم الهيدروجيني 8.4، 2 ميكرولتر من 10X عينة الحد من وكيل (0.5 M DTT)، وتحلل العازلة إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
    ملاحظة: يسمح هذا البروتوكول الكشف عن BRCA2 في خطوط الخلايا العادية أيضا عند استخدام كمية أقل من البروتين الكلي (وصولا الى 5 ميكروغرام).
  3. تفسد العينات عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: ومن الأهمية بمكان استخدام 55 ° C. منذ البروتين BRCA2 هو حساس للحرارة 11 ودرجات الحرارة أعلى تغيير طبيعة يسبب خسارة ثابتة للسليما كامل طول (390 كيلو دالتون) البروتين BRCA2.
  4. إعداد غرفة الكهربي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  5. تحميل العينات و 10 ميكرولتر من ارتفاع الوزن الجزيئي قبل الملطخة البروتين القياسية على هلام precasted (تريس، خلات 3-8٪) وتعمل في 120 V لABخارج 2 ساعة 12. إيقاف تشغيل الكهربي قبل يترك 55 كيلو دالتون علامة زرقاء هلام precasted.
  6. إعداد المخزن المؤقت نقل مع 50 مل من 20x ونقل العازلة، 100 مل من الميثانول بنسبة 100٪ و 850 مل من الماء.
  7. تنشيط الغشاء PVDF (0.45 ميكرون حجم المسام) عن طريق نقع في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق ثم يشطف بالماء المقطر وتتوازن في المخزن نقل على الأقل لمدة 5 دقائق. نقع الإسفنج لجهاز نقل في المخزن نقل في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  8. عندما المدى الكهربي هو أكثر، وتجميع شطيرة في كومة نقل بالترتيب التالي (من أسفل إلى أعلى): ثلاثة الإسفنج مشبعة في المخزن نقل، 3MM واحد ورقة ورقة الصف المشبعة في المخزن نقل، وهلام، غشاء PVDF تفعيلها، واحدة 3MM ورقة ورقة الصف المشبعة في المخزن نقل، ثلاثة الإسفنج مشبعة في نقل العازلة 13،14. وضع كومة في جهاز ونقل البروتينات في 350 مللي أمبير لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية أو 180 مللي أمبير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجري BRCA2 بروتين كبير جدا، لا بد من تمديد الوقت نقل من 1 ساعة (كما اقترح من قبل الشركة المصنعة ومعظم بروتوكولات نقل) إلى 4 ساعات أو طوال الليل لضمان نقل كامل من البروتينات عالية الوزن الجزيئي. وبالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى وقت طويل نقل، فمن الضروري لأداء النشاف في غرفة باردة في 4 درجات مئوية للحد من ارتفاع درجة الحرارة وتسهيل تفكيك شطيرة. أنظمة نقل شبه الجافة ليست جيدة لنقل البروتينات الكبيرة.
  9. بعد نقل، ويغسل الغشاء مع TBS، منعه لمدة 1 ساعة على RT في TBS-توين 0.25٪ (TBS-T) التي تحتوي على 5٪ غير دهن الحليب الجاف والتحقيق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 30 ميكرولتر مكافحة BRCA2 الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ( 200 ميكروغرام / مل)، مخففة في 9 مل TBS-T + 5٪ غير دهن الحليب الجاف [1: 300 (V / V) التخفيف].
  10. يغسل الغشاء ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع TBS-T، ثم احتضان مرشح لمدة 1 ساعة مع 1 ميكرولتر من الفجل-البيروكسيديز مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية مخففة في 10 مل من TBS-T + 5٪ غير دهن الحليب الجاف. بعد ذلك، ويغسل الغشاء ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع TBS-T.
  11. أداء مناعي من قبل ECL للكشف عن البروتين BRCA2 باستخدام تعزيز التوهج (ECL) الغربية التنشيف كشف الكاشف، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تصور العصابات immunochemiluminescent على ارتفاع القرار الأفلام ECL.
  12. أداء مناعي مع الأجسام المضادة للجين التدبير المنزلي، مثل β تويولين (55 كيلو دالتون)، على مرشح واحد عن السيطرة التحميل باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إلى β تويولين المخفف في 1: 1000 (10 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة تويولين في 10 مل TBS-T + 5٪ الحليب المجفف منزوع الدسم) لمدة 1 ساعة على RT. غسل واحتضان الضد الثانوية كما هو موضح BRCA2 (5،10-5،11)، باستثناء استخدام الفجل-البيروكسيديز مترافق مكافحة الفأر بدلا من المضادة للأرنب الضد الثانوية.
  13. الحصول على صورة رقمية للأفلام أعجب مع عصابات immunochemiluminescent وتحليل كثافة الفرقة التي كتبها صورة مخصصة برامج التحليل (على سبيل المثال.، يماغيج).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قبل الشروع في / الفحص البيولوجي والكيمياء الحيوية لدراسة تأثير BRCA2 إسكات على وظائف الخلية، فإن الخطوة الأولى هي لتأكيد خصوصية إسكات باستخدام سيرنا المخفوق (عدم استهداف سيرنا) جنبا إلى جنب مع BRCA2 سيرنا (الشكل 1A ). من المهم إجراء الجولة الثانية من سيرنا ترنسفكأيشن مع نسبة عالية سيرنا / ترنسفكأيشن للحصول على كفاءة عالية من BRCA2 إسكات. في الواقع، وأداء جولة واحدة فقط من سيرنا ترنسفكأيشن أو باستخدام سيرنا أدنى لنسبة ترنسفكأيشن في الجولة الثانية (25 بمول سيرنا و 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن) من شأنه أن يؤدي إلى انخفاض كفاءة ضربة قاضية (الشكل 1B). والخطوة الثانية هي لتقييم الحد الأدنى من الوقت الأمثل للحصول على أعلى مستوى من إسكات الجينات. اعتمادا على نوع من الخلايا، و يمكن أن يختلف بين 24 و 48 ساعة بعد الجولة الثانية من سيرنا ترنسفكأيشن. على سبيل المثال، 24 ساعة كافية لخلايا الغدة الدرقية Nthy لكن ما يصل الى 48وهناك حاجة إلى ساعة لكفاءة ضربة قاضية BRCA2 في خلايا البروستاتا PNT1A (الشكل 2A). BRCA2 إسكات غير مستقر تماما حتى يوم 7 بعد دورة ترنسفكأيشن الثانية (الشكل 2B). من المذكرة، وتغيير طبيعة ولست] خلية في درجة الحرارة فوق 55 درجة مئوية (100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق)، والنتائج في ما يصل إلى 50٪ خسارة من البروتين BRCA2 (الشكل 2C)، وذلك بسبب thermosensitivity من BRCA2 11.

مرة واحدة يتم تأسيس الوقت الأمثل إسكات، يمكن استغلالها من آثار فقدان البروتين BRCA2 في عدة فحوصات. منذ المجراة الطفرات التي تسبب فقدان وظيفة BRCA2 تشجيع زيادة الحساسية للمثبطات PARP فضلا عن أدوية العلاج الكيميائي الأخرى التي تسبب التلف في الحمض النووي 15-18، مقايسة شيوعا هو لتحديد حساسية الخلايا -silenced BRCA2 إلى rucaparib PARP المانع أو oloparib. في التجربة التي أعلن عنها في الشكل (3)، وخلايا PNT1A المنضب سو BRCA2 البروتين من خلال سيرنا تم التعامل مع 10 ميكرومتر rucaparib لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك تم تقييم انتشار الخلايا عن طريق تكاثر الخلايا مقايسة على أساس MTT. استنزاف النتائج البروتين BRCA2 في انخفاض تعتمد على الوقت في تكاثر الخلايا بعد العلاج rucaparib (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. جولتان من ترنسفكأيشن سيرنا وارتفاع نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لتحسين BRCA2 إسكات. (A) خصوصية BRCA2 إسكات وأكد في الخلايا Nthy التي كتبها immunoblotting تحليل 24 ساعة بعد الجولة الثانية من ترنسفكأيشن، وذلك باستخدام سارعت سيرنا (السيطرة)، والسيطرة للمقارنة بين مستويات البروتين BRCA2. وذكرت علامات الوزن الجزيئي على اليسار، وتعرض (B) خلايا PNT1A إلى 1 أو 2 دورات BRCA2 الصورةترنسفكأيشن الجمهورية الاسلامية الايرانية كما هو موضح في البروتوكول [دورات (#) 1 و 2] وكان كميا والبروتين BRCA2 استنزاف من قبل immunoblotting. واستخدمت دورتين من ترنسفكأيشن مع سيرنا سارعت عن التحكم (السيطرة). في 2B، تعرض خلايا PNT1A لدورتين من BRCA2 سيرنا ترنسفكأيشن باستخدام سيرنا انخفاض نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لفي الدورة الثانية بمثابة تعديل (25 بمول سيرنا / 6 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن). في جميع الحالات، تم تحليل مستويات البروتين BRCA2 48 ساعة بعد الدورة الثانية. في الجزء السفلي، وتفيد التقارير الكمي لمستويات البروتين BRCA2 كنسبة BRCA2 / تويولين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. الأمثل من BRCA2 ضربة قاضية. (A) OPTIMقد تتطلب آل BRCA2 ضربة قاضية 24-48 ساعة بعد دورة سيرنا ترنسفكأيشن الثانية. تم تقييم اثنين من خطوط مختلفة من الخلايا (PNT1A وNthy) لBRCA2 ضربة قاضية 24 ساعة و 48 ساعة بعد دورة سيرنا ترنسفكأيشن الثانية immunoblotting التحليل. في الجزء السفلي، يتم الإبلاغ عن مستويات البروتين BRCA2 كنسبة مئوية من مستويات في وقت و0 ساعة، وضعت في تمثل 100. بيانات متوسط ​​± SE من ثلاث تجارب مستقلة. (B) BRCA2 ضربة قاضية مستقرة لمدة 7 أيام. تم تقييم الخلايا PNT1A لBRCA2 ضربة قاضية حتى 196 ساعة بعد دورة ترنسفكأيشن سيرنا الثانية immunoblotting. وتفيد التقارير أن نسبة BRCA2 إلى إشارة تويولين في الأسفل. (C) البروتين BRCA2 هو حساس للحرارة. وقد تم جمع الخلايا PNT1A غير transfected 24 ساعة بعد الطلاء (حوالي 70٪ confluency) وهي lysed وفقا للبروتوكول. تم التشويه والتحريف اثنين قسامات من المحللة خلية نفسه (15 ميكروغرام البروتين الكلي) إما عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أو 100 & #تم تقييم C لمدة 5 دقائق والبروتين BRCA2 المستويات immunoblotting، 176. في الجزء السفلي، وذكرت نسبة BRCA2 إلى إشارة تويولين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. BRCA2 إسكات يزيد من حساسية الخلايا للrucaparib PARP المانع. PNT1A الخلايا إما مع transfected التحكم (السيطرة) أو BRCA2 سيرنا تم جمع 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن ومطلي في 96-جيدا لوحة (خلايا 2000 / جيد). بعد 24 ساعة، تم إضافة 10 ميكرومتر rucaparib إلى الخلايا لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك تم الاحتفاظ بها الخلايا في غياب الدواء تصل إلى 96 ساعة. تم تقييم تكاثر الخلايا في الوقت المشار إليه باستخدام فحص MTT عن طريق قياس الامتصاصية في 550-690 نانومتر. EACنقطة و الزمن التقريبي تمثل يعني ± SD من ثلاثة آبار من تجربة تمثيلية. السيطرة سيرنا، الخط الأزرق، BRCA2 سيرنا، خط أحمر. في الجزء العلوي، وذكرت BRCA2 الشخصي البروتين في الخلايا BRCA2 سيرنا transfected. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بسبب الطفرات سلالة الجرثومية من الرصاص BRCA2 الجينات إلى زيادة خطر عدة أنواع من السرطان، بما في ذلك الذكور والإناث سرطان الثدي وسرطان المبيض وسرطان البروستاتا، وسرطان البنكرياس، وسرطان الجلد 3،4، وقد أجريت العديد من الدراسات لفهم الوظيفة البيولوجية من البروتين BRCA2. معظم هذه الدراسات أساسا تستند الجينية بسبب الصعوبات التقنية في تحليل البروتين العملاقة مثل BRCA2. الطريقة الموضحة هنا لإسكات وتحليل البروتين BRCA2 التعبير يوفر أداة فعالة لتحقيق وظائف الورم BRCA2 القامع الجينات في طيف واسع من المقايسات البيولوجية. ويستند البروتوكول إسكات بشأن الإجراءات ترنسفكأيشن سيرنا القياسية بعد يحتوي على العديد من التعديلات الهامة وكذلك نصائح لضربة قاضية ناجحة وثابتة من BRCA2. بروتوكول ترنسفكأيشن سيرنا آمن وسريع وفعال وبطريقة مختلفة عن shRNA، الأمر الذي يجعل عادة استخدام يونناقلات tiviral، لا تحتاج إجراءات محددة للسلامة الأحيائية، ويمكن أن يؤديها بسهولة في أي مختبر مجهز منشأة ثقافة الخلية. وبالمثل، فقد تم تحسين بروتوكول immunoblotting للكشف الفعال للبروتين كبير مثل BRCA2. تم التحقق من صحة بروتوكول immunoblotting أيضا للكشف عن المؤتلف البروتين البشري BRCA2 أعرب heterologously في خلايا الخميرة 9.

وذكرت عدة عوامل هامة للتسليم الفعال للسيرنا هنا. وهي تشمل دورتين من transfections وسيرنا ارتفاع نسبة ترنسفكأيشن الكاشف ل، وخاصة في المرحلة الثانية. غياب بالمضادات الحيوية قبل وأثناء إجراء ترنسفكأيشن هو عامل حاسم آخر. ومع ذلك، هذا الإجراء يعرض الخلايا في الثقافة إلى زيادة خطر التلوث البكتيري. وبالتالي ينبغي اتخاذ احتياطات اضافية لضمان مستوى عال من العقم في جميع الخطوات. وتجدر الإشارة إلى أنه، اعتمادا على نوع من الخلايا، knockdo الجين الفعالسفل سوف تتطلب عادة 24-48 ساعة بعد الدورة الثانية. الأسلوب الحالي لديه ميزة حفظ الجينات إسكات مستقرة تماما على الأقل حتى يوم 7 بعد دورة ترنسفكأيشن الثانية. وهذا يسمح للدراسة آثار BRCA2 ضربة قاضية في مجموعة متنوعة من المقايسات البيولوجية، بما في ذلك الاستجابة الخلوية للأدوية العلاج الكيميائي مختلفة. ومع ذلك، يتم تمثيل الحد من التقنية الحالية من خلال حقيقة أن جزيئات سيرنا الخارجية لم تدرج في الجينوم، لا يمكن أن يتحقق ضربة قاضية بذلك مستقرة في التعبير الجيني. بدلا من ذلك، للحصول على ضربة قاضية مستقرة، shRNA عدوى lentiviral يمكن القيام بها، شريطة أن يتم إعداد المختبر لمتطلبات السلامة الأحيائية إضافية (BSL 2 المعايير وفقا للمبادئ التوجيهية NIH). بالإضافة إلى ذلك، عندما ترنسفكأيشن ليس نهجا ينطبق على دراسة وظيفة الجين في نوع خلية معينة (على سبيل المثال، الخلايا اللمفية تي)، واستخدام الفئران المشروط BRCA2 خروج المغلوب خلية محددة يبقى altern الوحيدative 19.

طريقة هذه التقارير أيضا العديد من النصائح للكشف الناجح لنسبة عالية من البروتين الجزيئي الوزن عن طريق immunoblotting وأنه من المناسب لكل من البروتينات العالية والمنخفضة وفرة. على وجه الخصوص، نظرا لthermosensitivity من البروتين BRCA2، ودرجة حرارة أقل تغيير طبيعة أمر بالغ الأهمية للكشف عن الأمثل، وذلك بالاتفاق مع دراسة سابقة 11. هذا 'خدعة' التقنية قد تكون مفيدة للبروتينات الأخرى التي الكشف عن طريق بروتوكولات immunoblotting القياسية وقد ثبت ناجحة أيضا. نحن نتوقع أن هذا الأسلوب يتضمن نصائح للصحة العامة، وبالتالي قد يسهل إسكات والكشف عن العديد من البروتينات تحدي الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BRCA2 siRNA Dharmacon L-003462-00 SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNA Dharmacon  D-001810-10-05 ON-TARGETplus Non-targeting Pool
Lipofectamine RNAiMAX Reagent  Life Technologies 13778075 Transfection Reagent
OPTI-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Medium for transfection procedure
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast Life Technologies EA0378 Gel for protein electrophoresis
NuPAGE LDS Sample buffer  Life Technologies NP0007 Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing agent (10x) Life Technologies NP0004 Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Antioxidant Life Technologies NP0005 Reagent for protein electrophoresis
HiMark Pre-stained protein standard Life Technologies LC5699 Prestained marker for gel electrophoresis
XCell SureLoc Mini-Cell  System Life Technologies EI0002 Equipment for protein electrophoresis/transfer
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer Life Technologies LA0041 Reagent for Western blotting
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Reagent for Western blotting
NuPAGE Transfer Buffer Life Technologies NP0006-1 Reagent for Western blotting
BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8326 1:300 dilution
Beta-tubulin monoclonal antibody Sigma Aldrich T4026-100UL 1:1,000 dilution
Skim Milk powder Sigma Aldrich 70166 Reagent for Western blotting
Tween-20 Sigma Aldrich P1379 Reagent for Western blotting
SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate Pierce Thermo Scientific 34080/34096 Chemiluminescence system
PNT1A cells SIGMA Aldrich (for ECACC) 95012614 PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40
Nthy cells SIGMA Aldrich (for ECACC) 90011609 Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells
Cell Proliferation Kit I (MTT) Roche 11465007001 Kit for cell proliferation assays

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
  2. Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
  3. Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
  4. Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
  5. Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
  6. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
  7. Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82 (2013).
  8. Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
  9. Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
  10. Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
  11. Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
  12. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  13. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
  14. Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
  15. Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
  16. Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
  17. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
  18. Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
  19. Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 102، BRCA2، سيرنا، خطوط الخلايا البشرية، إسكات الجينات، ترنسفكأيشن، immunoblotting
إسكات<em&gt; BRCA2</em&gt; من التعرف على رواية الوظائف البيولوجية التنظيم BRCA2 في الخلايا البشرية المستزرعة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moro, L., Guaragnella, N.,… More

Moro, L., Guaragnella, N., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells. J. Vis. Exp. (102), e52849, doi:10.3791/52849 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter