Abstract
Tysta av tumörsuppressorproteinet BRCA2 och dess detektering genom konventionella biokemiska analyser utgör en stor teknisk utmaning på grund av den stora storleken av den mänskliga BRCA2-proteinet (ca 390 kDa). Vi rapporterar ändringar av standard siRNA transfektion och immunoblotting protokoll för att tysta mänsklig BRCA2 och upptäcka endogena BRCA2-proteinet, respektive, i mänskliga epitelcellinjer. Viktiga steg inkluderar en hög siRNA transfektionsreagens förhållandet och två efterföljande omgångar av siRNA transfektion inom samma experiment. Med hjälp av dessa och andra förändringar i standardprotokoll vi konsekvent uppnå mer än 70% tysta mänsklig BRCA2-genen som bedöms av immunanalys med anti-BRCA2 antikroppar. Dessutom, denaturering av cellysaten vid 55 ° C i stället för den konventionella 70-100 ° C och andra tekniska optimeringar av immunoblotting förfarandet tillåter detektion av intakt BRCA2-protein även when mycket små mängder av utgångsmaterialet finns eller när BRCA2-proteinexpressionsnivåerna är mycket låga. Effektiv tysta BRCA2 i mänskliga celler erbjuder en värdefull strategi för att störa BRCA2 funktion i celler med intakt BRCA2, inklusive tumörceller, för att undersöka nya molekylära vägar och cellulära funktioner som kan påverkas av patogena BRCA2 mutationer i tumörer. Anpassning av detta protokoll för effektiv ljuddämpning och analys av andra "stora" proteiner som BRCA2 bör vara lätt att uppnå.
Introduction
BRCA2 (bröstcancer känslighet gen-2) genen kodar för en tumörsuppressor-protein som spelar en avgörande roll i att reparera DNA-dubbelsträngbrott genom att reglera funktionen av rekombinasenzymet RAD51 1. BRCA2 har också varit inblandad i moduleringen av transkription och i cellcykelkontroll 2. Nedärvda mutationer i BRCA2-genen inducerar en autosomalt dominant mottaglighet för bröst- och ovariecancer hos kvinnor och prostatacancer hos män, samt predisposition för andra cancertyper 3,4. Trots den ökade risken för att utveckla cancer, BRCA2 mutationer som hämmar eller minskar BRCA2-funktionen kan göra cancerceller mer sårbara för kemoterapeutiska medel som orsakar DNA-skador 5-7. Sporadiska cancer uppvisar en låg BRCA2 mutationer (<3%) men minskade nivåer av BRCA2-protein har upptäckts i vissa cancertyper, vilket tyder på att BRCA2-proteinkan gå förlorade under tumorigenes i sporadiska cancer genom icke-mutations-beroende mekanismer 7,8. Det är sålunda viktigt att till fullo förstå BRCA2 funktioner i samband med cancerbiologi samt i andra biologiska inställningar.
Ett kraftfullt verktyg som används för att identifiera nya funktioner hos en gen i däggdjursceller är att tysta dess expression. Som ett exempel, har tysta BRCA2 uttryck i en mängd olika normala epitelceller nyligen lett till identifiering av en ny funktion för BRCA2 som regulator av anoikis motstånd, ett viktigt steg under förvärv av cancercell invasiv och metastaserande förmåga 9. Geners uttryck kan uppnås genom införande i cellerna antingen små störande (si) RNA- eller kort hårnål (sh) RNA-molekyler som riktar den specifika genen. Den höga styrkan hos siRNA och dess användarvänlighet gör det förmåns verktyg för att tysta experiment som syftar till att få nya insikter i kritiska biologiska processer ennd att identifiera nya terapeutiska mål. Emellertid kan en effektiv knockdown av genexpression inte vara lätt att uppnå för alla gener och kan vara mycket varierande beroende på celltypen. Eftersom en minskning av intracellulära proteinnivåer är den mest relevanta fenotypen under utredning, är det viktigt att kvantifiera geners uttryck genom immunanalys av genprodukten. Med detta avseende, presenterar BRCA2-proteinet ytterligare en utmaning: att vara ett stort protein (ca 390 kd), existerar tekniska svårigheter för konventionell biokemisk analys, inklusive immunoblotting.
Vi rapporterar här ett protokoll optimerad för effektiv tysta BRCA2 i humana epitelcellinjer och för snabb och framgångsrik detektering av BRCA2-protein knockdown genom immunanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered siRNA lösningar
- Resuspendera 5 nmol oordning (Ctrl) och 5 nmol BRCA2 siRNA torkade pelletar i 100 ^ il RNas-fritt vatten (slutlig siRNA koncentration: 50 | iM). Detta är siRNA lager och måste lagras vid -20 ° C i 10 pl alikvoter.
- Ta en delmängd av 10 ul från siRNA lager och tillsätt 40 pl RNas-fritt vatten för att erhålla 10 iM siRNA arbetslösning. Denna utspädning måste lagras vid -20 ° C fram till användning.
OBS! SiRNA arbetslösning bör inte genomgå frysning / upptining mer än 3 gånger.
2. Sådd av humant epitelcellinjer
- Avlägsna odlingsmediet från humana epiteliala cellinjer växer som cellmonoskikt i vävnadsodlingsplattor i en fuktad inkubator vid 37 ° C, 5% CO2.
- Tvätta cellerna i plattan en gång med RT PBS (10 ml PBS för en 100 mm platta).
- För att lossa cellerna från plattan,lägg 2 ml 0,25% trypsin / 0,53 mM EDTA-lösning och inkubera 3-5 min beroende på celltypen.
- Innan uppsamling av de lösgjorda celler, neutralisera trypsin genom tillsats 2 ml komplett tillväxtmedium innehållande 10% fetalt bovint serum.
- Överföra celler till en 15 ml tub.
- Centrifugera cellerna vid 320-330 xg under 3 min vid 4 ° C i en svängande hink rötor.
- Resuspendera cellpelletarna i 5 ml av antibiotika-fria mediet.
- Räkna cellerna under mikroskop i en Burker kammare eller genom att använda ett automatiserat räkningssystem enligt tillverkarens instruktioner.
- Seed cellerna i 6-brunnars plattor för att vara ungefär 80% konfluenta efter 24 h (0,5 till 1 x 10 6 celler i 2 ml medium för varje brunn). Optimal cellnummer som ska ympas kan variera beroende på de specifika cellinjer och tillväxthastigheten.
OBS: Inte sätta antibiotika i mediet vid denna punkt eftersom antibiotika kommer att negativt interferera med effektiviteten i överfInsatser. Det är mycket viktigt att cellerna är vid låga odlingspassager (<10) för att uppnå hög effektivitet av BRCA2-siRNA transfektion.
3. transfektera celler med siRNA
- Tjugofyra timmar efter utstrykning av cellerna, vidare med den första omgången av transfektion.
- Späd 6 il lipidbaserad 10 siRNA specifika transfektion reagens i 130 pl minskat serummedium.
- Späd 3 il 10 nM siRNA (30 pmol) i 130 pl minskat serummedium.
- Kombinera den utspädda siRNA med det utspädda transfektionsreagens och inkubera i 5-10 min vid rumstemperatur.
- Under inkubationen, avlägsna mediet från cellerna och tillsätt 2 ml färskt medium förvärmas vid 37 ° C (utan antibiotika).
- Lägg 250 pl av de siRNA-transfektionsreagens komplexen till cellerna (detta belopp är för en enda brunn i en 6-brunnsplatta).
- Inkubera cellerna i en fuktad inkubator vid 3776; C med 5% CO2.
- Efter 24 timmar, gå vidare med den andra omgången av transfektion genom att upprepa steg 3.1.1-3.1.5 med följande modifikation steg 3.1.2: späd 5 il 10 nM siRNA (50 pmol) i 130 pl minskat serummedium.
- Inkubera cellerna under 1-2 dagar vid 37 ° C före analys.
OBS: Två omgångar av transfektion och användning av en hög siRNA / transfektionsreagens förhållande i den andra omgången är viktigt att få hög effektivitet BRCA2 tysta.
- Inkubera cellerna under 1-2 dagar vid 37 ° C före analys.
4. Lyse celler för immunblotanalys
- Framställ färsk lysbuffert med PBS (pH 7,4) innehållande 1% av den nonjoniska, icke-denaturerande detergenten oktylfenoxipolyetoxietanol, 5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM natriumortovanadat, 10 mM natriumfluorid, 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 pg / ml leupeptin, 10 ^ g / ml aprotinin. Håll det på is.
- Ta ut mediet från cellerna och waska dem en gång med kall PBS (2 ml / brunn) i plattan. För att undvika PBS överföring, helt ta bort den från plattan.
- Lägg 200 | il lysbuffert till varje brunn.
OBS: Om cellerna måste användas även för andra analyser, trypsinize cellerna som beskrivs i steg 2,1-2,6 och suspendera cellerna i lämplig buffert / medium enligt programmet som ska användas. - Rotera försiktigt plattan att likformigt fördela den lyseringsbuffert och inkubera under 15 minuter vid 4 ° C på en rotator.
- Samla cellysatet i ett mikrocentrifugrör på is med användning av en cellskrapa.
- Centrifugera vid 17.900 xg under 25 minuter vid 4 ° C och samla supernatanten i ett nytt rör.
- Mät proteinkoncentration med användning av ett kommersiellt tillgängligt proteinanalys enligt tillverkarens instruktioner.
5. BRCA2 immunblotanalys
- Förbered kömingsbuffert genom att späda 50 ml 20x Tris-acetat SDS kör bUffer (50 mM tricin, 50 mM Tris-bas, 0,1% SDS, pH 8,24) med 950 ml destillerat vatten.
- Förbered provet på följande sätt: tillsätt 15 | j, g av totalt cellysat, 5 il 4x provbuffert som innehåller litium-dodecylsulfat vid pH 8,4, 2 ^ il 10 x prov reduktionsmedel (0,5 M DTT), och lyseringsbuffert till en slutlig volym av 20 il.
OBS: Detta protokoll möjliggör detektion av BRCA2 i normala cellinjer även när du använder en mindre mängd av den totala proteiner (ner till 5 mikrogram). - Denaturera prover vid 55 ° C under 10 minuter.
OBS: Det är viktigt att använda 55 ° C. Eftersom BRCA2-proteinet är värmekänsliga 11, högre denatureringstemperaturer resulterar i en konsekvent förlust av intakt full längd (390 kDa) BRCA2-proteinet. - Ställ in den elektroforetiska kammaren enligt tillverkarens instruktioner.
- Ladda de prover och 10 pl av hög molekylvikt för-färgade proteinstandard på en precasted gel (Tris-Acetat 3-8%) och kördes vid 120 V för abut 2 timmar 12. Stoppa elektro springa före 55 kDa blå markör lämnar precasted gel.
- Förbered överföringsbuffert med 50 ml av 20x överföringsbuffert, 100 ml 100% metanol och 850 ml vatten.
- Aktivera PVDF-membran (0,45 ^ m porstorlek) genom blötläggning i 100% metanol under 5 minuter, sköljdes med destillerat vatten och jämvikt i överföringsbuffert åtminstone för 5 minuter. Blöt svamparna enligt överföringsanordningen i överföringsbuffert vid 4 ° C fram till användning.
- När elektro körningen är över, montera smörgås i överförings stack i följande ordning (bottom-up): tre svampar mättade i överföringsbuffert, en 3MM kvalitet pappersark mättat i överföringsbuffert, gelen, aktiverade PVDF-membran, en 3MM kvalitet pappersark mättat i överföringsbuffert, tre svampar mättad i överföringsbuffert 13,14. Placera bunten in i anordningen och överföra proteiner vid 350 mA under 4 timmar vid 4 ° C eller vid 180 mA över natten vid 4 ° C.
OBS: Being BRCA2 ett mycket stort protein, är det viktigt att förlänga överföringstiden från 1 timme (som föreslås av tillverkaren och de flesta överföringsprotokoll) till 4 timmar eller över natten för att säkerställa fullständig överföring av hög molekylvikt proteiner. På grund av den långa överföringstiden, är det viktigt att utföra blotting i ett kylrum vid 4 ° C för att minimera överhettning och underlätta smörgås demontering. Halvtorra transfereringssystemen är inte bra för överföring av stora proteiner. - Efter överföring, tvätta membranet med TBS, blockera det under 1 h vid RT i TBS-Tween 0,25% (TBS-T) innehållande 5% fettfri torrmjölk och sond över natten vid 4 ° C med 30 | il anti-BRCA2-kanin-polyklonal antikropp ( 200 | ig / ml), späddes i 9 ml TBS-T + 5% fettfri torrmjölk [1: 300 (volym / volym) utspädning].
- Tvätta membranet tre gånger (10 min vardera) med TBS-T, sedan inkubera filtret under 1 h med 1 | il pepparrotsperoxidas-konjugerat anti-kanin sekundär antikropp utspädd i 10 ml TBS-T + 5% fettfri torrmjölk. Därefter tvättas membranet tre gånger (10 min vardera) med TBS-T.
- Utför immundetektering genom ECL att avslöja BRCA2-proteinet med användning av förstärkt kemiluminescens (ECL) Western Blotting Detection Reagent, enligt tillverkarens instruktioner. Visualisera immunochemiluminescent band på högupplösta ECL filmer.
- Utför immunodetektion med en antikropp för en housekeeping-gen, som β-tubulin (55 kDa), på samma filter som lastkontroll genom användning av en monoklonal antikropp mot β-tubulin späddes vid en: 1000 (10 | il av anti-tubulin-antikropp i 10 ml TBS-T + 5% icke-fet torrmjölk) under 1 h vid RT. Tvätta och inkubera sekundär antikropp såsom beskrivits för BRCA2 (5,10-5,11), med undantag för användning av pepparrotsperoxidas-konjugerad anti-mus istället för anti-kanin sekundär antikropp.
- Skaffa en digital bild av filmerna imponerade med immunochemiluminescent band och analysera bandintensiteten med dedikerade bildanalys mjukvara (t.ex.., ImageJ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan en biologisk / biokemisk analys för att undersöka effekten av BRCA2 tysta på cellfunktioner, är det första steget för att bekräfta specificiteten av tysta med en kodad siRNA (icke-inriktning siRNA) sida vid sida med BRCA2 siRNA (Figur 1A ). Det är viktigt att utföra en andra omgång av siRNA transfektion med en hög siRNA / transfektion förhållande för att få en hög effektivitet av BRCA2-tystande. Faktum är att endast utför en omgång av siRNA transfektion eller använda en lägre siRNA transfektion förhållande i den andra omgången (25 pmol siRNA och 6 pl transfektionsreagens) skulle leda till lägre knockdown verkningsgrad (Figur 1B). Det andra steget är att bedöma den optimala minsta tid för att få den högsta nivån av geners uttryck. Beroende på celltypen, kan detta variera mellan 24 och 48 timmar efter den andra omgången av siRNA transfektion. Till exempel, 24 timmar är tillräckliga för Nthy sköldkörtelceller men upp till 48h behövs för effektiv BRCA2 knockdown i PNT1A prostataceller (Figur 2A). BRCA2 ljuddämpning är ganska stabil fram till dag 7 efter den andra transfektion cykeln (Figur 2B). Notera denaturera cellysaten vid en temperatur över 55 ° C (100 ° C under 5 min), resulterar i upp till 50% förlust av BRCA2-proteinet (fig 2C), på grund av thermosensitivity av BRCA2 11.
När optimal ljuddämpande tid etableras, kan effekterna av förlust av BRCA2-protein utnyttjas i flera analyser. Eftersom in vivo mutationer som orsakar förlust av funktion av BRCA2 främja ökad känslighet för PARP-hämmare samt andra kemoterapeutiska läkemedel som orsakar DNA-skador 15-18, är en gemensam analys för att bestämma känsligheten hos BRCA2 -silenced celler till PARP-hämmare rucaparib den eller oloparib. I experimentet rapporterade i fig 3, PNT1A celler utarmade of BRCA2-protein genom siRNA har behandlats med 10 iM rucaparib under 24 timmar, varefter celltillväxt har bedömts av en MTT-baserad cellprolifereringsanalys. Utarmning av BRCA2-protein resulterar i en tidsberoende minskning i cellproliferation efter rucaparib behandling (figur 3).
Figur 1. Två omgångar av transfektion och hög siRNA transfektionsreagens förhållande till förbättra BRCA2 tysta. (A) specificitet BRCA2 tyst bekräftades i Nthy celler genom immunanalys 24 timmar efter den andra omgången av transfektion, med hjälp av oordning siRNA (Ctrl) som kontroll för jämförelse av BRCA2-proteinnivåer. Molekylviktmarkörer redovisas till vänster. (B) PNT1A celler utsattes för 1 eller 2 cykler av BRCA2 sIRNA transfektion såsom beskrivits i protokollet [Cycles (#) 1 och 2] och BRCA2-protein utarmning kvantifierades genom immunoblotting. Två cykler av transfektion med scrambled siRNA användes som kontroll (Ctrl). I 2b, var PNT1A celler utsattes för två cykler av BRCA2 siRNA transfektion med hjälp av en lägre siRNA transfektionsreagens förhållande i den andra cykeln som en modifiering (25 pmol siRNA / 6 pl transfektionsreagens). I samtliga fall var BRCA2-proteinnivåer analyseras 48 timmar efter den andra cykeln. Längst ner är kvantifiering av BRCA2-proteinnivåer rapporteras som BRCA2 / tubulin förhållande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Optimering av BRCA2 knockdown. (A) Optimal BRCA2 knockdown kan kräva 24 till 48 timmar efter den andra siRNA transfektion cykel. Två olika cellinjer (PNT1A och Nthy) bedömdes med avseende på BRCA2 knockdown 24 h och 48 h efter den andra siRNA transfektion cykel genom immunoblotting-analys. Längst ner är BRCA2-proteinnivåer rapporteras i procent av nivåerna vid tidpunkten 0 timmar, inställd på 100. Data representerar medelvärdet ± SE av tre oberoende experiment. (B) BRCA2 knockdown är stabilt i 7 dagar. PNT1A celler bedömdes för BRCA2 knockdown förrän 196 timmar efter den andra siRNA transfektion cykeln genom immunoblotting. Förhållandet mellan BRCA2 till tubulin signal redovisas till botten. (C) BRCA2-proteinet är värmekänslig. Icke-transfekterade PNT1A celler uppsamlades 24 timmar efter plätering (ca 70% konfluens) och lyserades i enlighet med protokollet. Två alikvoter av samma cellysat (15 ^ g total mängd protein) denaturerades antingen vid 55 ° C under 10 min eller vid 100 & #176; C under 5 min och BRCA2-proteinnivåer bestämdes genom immunoblotting. Längst ner, förhållandet mellan BRCA2 till tubulin signal rapporteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. BRCA2 ljuddämpning ökar cellernas känslighet för PARP-hämmare rucaparib den. PNT1A celler antingen transfekterade med kontroll (Ctrl) eller BRCA2 siRNA uppsamlades 48 h efter transfektion och ströks ut i 96-brunnar (2000 celler / brunn). Efter 24 h tillfördes 10 ^ M rucaparib sattes till cellerna under 24 h, varefter cellerna hölls i frånvaro av läkemedlet upp till 96 timmar. Cellproliferation utvärderades vid den angivna tiden med användning av MTT-analysen genom att mäta absorbansen vid 550 till 690 nm. Each tidpunkt representerar medelvärdet ± standardavvikelse för tre brunnar från ett representativt experiment. Ctrl siRNA, blå linje, BRCA2 siRNA, röda linjen. På toppen, BRCA2-protein profil i BRCA2 siRNA-transfekterade celler har rapporterats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom nedärvda mutationer i BRCA2-genen leder till ökad risk för flera cancertyper, inklusive kvinnor och män bröstcancer, äggstockscancer, prostatacancer, cancer i bukspottkörteln, och melanom 3,4 har ett antal studier gjorts för att förstå den biologiska funktionen av BRCA2-proteinet. De flesta av dessa studier är genetisk baserade främst på grund av tekniska svårigheter i att analysera en gigantisk protein som BRCA2. Den här beskrivna metoden för ljuddämpning och analysera BRCA2-proteinexpression erbjuder ett effektivt verktyg för att undersöka funktionerna hos BRCA2-tumörsuppressorgenen i ett brett spektrum av biologiska analyser. Den tysta Protokollet är baserat på standard siRNA transfektion förfaranden ännu innehåller flera viktiga ändringar samt tips för en lyckad och konsekvent knockdown av BRCA2. Den siRNA transfektion protokollet är säker, snabb och effektiv och, till skillnad från shRNA, som vanligtvis använder sig av lentiviral vektorer, inte behöver särskilda biosäkerhet förfaranden och kan lätt utföras i vilket laboratorium utrustat med ett cellodlingsanläggning. På liknande sätt har immunblotprotokoll optimerats för effektiv detektering av ett stort protein som BRCA2. Den immunoblotting protokollet har också godkänts för detektion av rekombinant human BRCA2-protein heterologt uttryckt i jästceller 9.
Flera viktiga faktorer för en effektiv leverans av siRNA redovisas här. De omfattar två cykler av transfektioner och en hög siRNA transfektionsreagens förhållande till, särskilt på avancerad nivå. Frånvaro transfektion förfarandet av antibiotika före och under är en annan avgörande faktor. Emellertid exponerar detta förfarande celler i odling till den ökade risken för bakteriekontaminering; därför extra försiktighetsåtgärder bör vidtas för att garantera en hög standard på sterilitet i alla steg. Det bör noteras att, beroende på celltypen, effektiv gen knockdown kommer vanligtvis att kräva 24-48 timmar efter den andra cykeln. Den nuvarande metoden har fördelen att hålla gen tysta ganska stabil åtminstone fram till dag 7 efter den andra transfektion cykeln. Detta möjliggör studier av effekterna av BRCA2 Knockdown i en mängd olika biologiska analyser, inbegripet den cellulära responsen till olika kemoterapeutiska läkemedel. Emellertid är en begränsning av föreliggande teknik som representeras av det faktum att exogena siRNA-molekyler inte integreras i genomet, inte kan uppnås sålunda stabil knockdown av genuttryck. Alternativt, för att få en stabil knockdown, shRNA Lentiviral infektion kan utföras, förutsatt att labbet är förberedd för ytterligare biosäkerhet krav (BSL-2 standarder enligt NIH riktlinjer). Dessutom, när transfektion är inte en tillämplig metod för att studera genfunktion i en typ specifik cell (t.ex.., T-lymfocyter), användning av cellspecifika villkorade BRCA2 knockoutmöss fortfarande det enda alterntivt 19.
Denna metod rapporterar också flera tips för framgångsrik detektering av en hög molekylvikt protein genom immunoblotting och det är lämpligt för både höga och låga överflöd proteiner. Framför allt på grund av thermosensitivity av BRCA2-proteinet, är en lägre denatureringstemperatur kritisk för optimal detektion, i samförstånd med en tidigare studie 11. Denna tekniska "trick" kan också vara till nytta för andra proteiner som detektion av standard immunoblotting protokoll har visat misslyckas. Vi räknar med att denna metod innehåller tips av allmän giltighet och därmed kan underlätta tysta och detektering av många andra utmanande proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1,000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
References
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
- Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
- Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
- Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
- Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82 (2013).
- Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
- Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
- Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
- Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
- Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
- Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
- Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).
