Abstract
종양 억제 단백질 BRCA2와 기존의 생화학 적 분석에 의해 그 검출 침묵은 인간의 BRCA2 단백질 (약 390 kDa의)의 큰 크기 때문에 큰 기술적 도전을 나타냅니다. 우리는 인간의 상피 세포 라인에 각각 내생 BRCA2 단백질을, 인간의 BRCA2를 침묵과 감지 표준 siRNA를 형질 감염 및 면역 프로토콜의 수정 사항을보고한다. 주요 단계는 형질 전환 시약 비율이 높은 siRNA와 같은 실험 내에서 siRNA를 형질의 두 후속 라운드를 포함한다. 안티 BRCA2 항체와 분석을 면역 블 판단으로 우리가 지속적으로 인간 BRCA2 유전자의 70 % 이상 침묵을 달성 표준 프로토콜이 다른 수정을 사용. 또한, 대신에, 종래의 70 ~ 100 °의 C 및 면역 과정의 다른 기술적 최적화 55 ° C에서의 세포 용 해물의 변성은 그대로 BRCA2 단백질의 검출도 가능 WH출발 물질은 매우 낮은 양의 도중에 가능 또는 BRCA2 단백질 발현 수준이 매우 낮은 경우. 인간의 세포에서 BRCA2의 효율적인 침묵은 종양 세포를 포함 그대로 BRCA2와 세포에서 BRCA2 기능을 방해 할 수있는 새로운 분자 경로 및 종양에서 병원성 BRCA2 돌연변이에 의해 영향을받을 수 세포 기능을 조사하기 위해 가치있는 전략을 제공합니다. 효율적인 침묵과 BRCA2와 같은 다른 '큰'단백질의 분석을 위해이 프로토콜의 적응은 쉽게 달성 할 수 있어야합니다.
Introduction
BRCA2 (유방암 감수성 유전자-2)의 유전자 재조합 효소 RAD51 (1)의 기능을 조절하여 DNA 이중 가닥 나누기를 복구하는 데 중요한 역할을하는 종양 억제 단백질을 암호화한다. BRCA2는 또한 전사의 조절 및 세포주기 조절에 관련이있다. BRCA2 유전자의 생식 세포 돌연변이는 다른 암 유형 3,4에 상 염색체 우성 남성의 유방과 여성에서 난소 암과 전립선 암에 대한 감수성뿐만 아니라 경향을 유도한다. 그러나, 억제 나 DNA 손상의 원인 5-7 화학 치료제로 암세포 더욱 취약 할 수있다 BRCA2 렌더링 기능을 줄이고 암, BRCA2 돌연변이 현상의 위험 증가에도 불구. 산발적 암은 BRCA2 단백질을 제안, BRCA2 단백질의 감소 수준은 일부 암 종류에서 발견 된하지만 BRCA2 돌연변이 (<3 %)의 낮은 비율을 나타내비 돌연변이에 의존하는 메커니즘 7,8 통해 산발적 암에서 종양 발생시 손실 될 수 있습니다. 따라서, 완전히 암 생물학의 맥락에서뿐만 아니라 다른 생물학적 설정에서 BRCA2 기능을 이해하는 것이 중요하다.
포유류 세포에서 유전자의 신규 한 기능을 식별하는 강력한 도구는 그 발현을 침묵하는 것이다. 일례로서, 정상 상피 세포의 다양한 사일런 BRCA2 발현은 최근 anoikis 저항성 암세포 침습 및 전이 능력 (9)의 획득 동안 중요한 단계의 레귤레이터 등 BRCA2의 신규 기능의 확인하게되었다. 유전자 침묵은 작은 셀 간섭 (SI) RNA 또는 특정 유전자를 대상으로 짧은 헤어핀 (SH) RNA 분자 중 하나에 도입함으로써 달성 할 수있다. 고의 siRNA의 효능과 사용의 용이성이 중요한 생물학적 과정에 새로운 통찰력을 확보하기위한 실험을 입을 것이에게 특혜 도구를 만들ND 새로운 치료 목표를 식별합니다. 그러나, 유전자 발현을 효율적으로 녹다운 모든 유전자를 쉽게 달성되지 않을 수 있고, 세포의 종류에 따라 매우 가변적 일 수있다. 세포 내 단백질 수준에서의 감소는 조사중인 가장 관련된 표현형이기 때문에, 유전자 생성물의 분석에 의해 면역 블 유전자 침묵을 정량화하는 것이 중요하다. 이와 관련하여, BRCA2 단백질은 더 도전을 제공합니다 : 큰 단백질 (약 390 kDa의를)되고, 기술적 인 문제가 면역을 포함하여 기존의 생화학 적 분석을 위해 존재한다.
우리는 여기서 인간 상피 세포 라인에 BRCA2의 효율적인 침묵과 분석을 면역 블에 의해 넉다운 BRCA2 단백질의 신속하고 성공적으로 감지에 최적화 된 프로토콜을보고합니다.
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Protocol
1. siRNA의 솔루션을 준비
- (50 μm의 최종 siRNA의 농도)의 RNA 분해 효소가없는 물을 100 ㎕에 BRCA2 siRNA를 건조 펠렛의 5 스크램블 (CTRL)의 nmol의 5 nmol의를 재현 탁. 이는 siRNA를 스톡하고 10 ㎕의 분취 액으로 -20 ℃에 보관해야한다.
- siRNA를 재고 10 μL의 나누어지는을 타고 10 μm의 siRNA를 작업 솔루션을 얻을 수의 RNase가없는 물을 40 μl를 추가합니다. 이 희석 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장해야합니다.
참고 : siRNA의 작업 솔루션 / 냉동을 거쳐 3 번 이상 해동 안된다.
인간 상피 세포주 2. 시드
- 37 ° C, 5 % CO 2의 가습 된 배양기에서 조직 배양 플레이트에서 세포 단층으로 성장하는 인간 상피 세포주에서 성장 배지를 제거한다.
- 한 번 RT PBS로 접시에 세포 (100mm 판 PBS로 10 ml)에 씻으십시오.
- 판에서 세포를 분리,0.25 % 트립신 2 ㎖ / 0.53 mM의 EDTA 용액을 추가하고 세포 유형에 따라 3-5 분 동안 배양한다.
- 분리 된 세포를 수집하기 전에, 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 완전 성장 배지 2 ㎖를 첨가하여 트립신을 중화.
- 15 ML 튜브에 세포를 전송합니다.
- 스윙 버킷 회 전자에 4 ℃에서 3 분 동안 320-330 XG에서 세포를 원심 분리기.
- 항생제 배지 5ml에 세포 펠렛을 재현 탁.
- BURKER 챔버 현미경 또는 제조업체의 지시에 따라 자동 카운팅 시스템을 사용하여 세포를 카운트.
- 6- 웰 플레이트에 세포가 24 시간 (도 0.5-1 X10 각 배지 2 ㎖로 106 세포) 후 약 80 % 컨 플루 언트 될 시드. 최적의 세포 수는 특정 세포주 및 성장률에 따라 변할 수있다 시딩한다.
참고 : 항생제에 부정적인 transfe의 효율성을 방해하기 때문에이 시점에서 매체에 항생제를 추가하지 마십시오ction의. 그것은 BRCA2 siRNA를 형질의 고효율을 달성하기 위해 낮은 배양 통로 (<10)에서의 셀은 매우 중요하다.
siRNA를 3. 형질 세포
- 24 시간 세포를 도금 한 후, 형질 전환의 첫 번째 라운드를 진행합니다.
- 감소 된 혈청 배지 130 μL 지질 계 10 siRNA를 형질 특정 시약 6 μL 희석.
- 감소 된 혈청 배지 130 ㎕를 10 μM의 siRNA (30 pmol의) 3 μl를 희석.
- 희석 된 형질 전환 시약 희석 된 siRNA를 결합하고 실온에서 5 ~ 10 분 동안 품어.
- 배양하는 동안, 세포로부터 배지를 제거하고 새로운 배지 (항생제없이), 37 ℃에서 예열 된 2 ㎖를 추가한다.
- 세포에 siRNA를 형질 감염 시약 착물 250 μL (이 양은 6- 웰 플레이트의 웰에 대해 하나의 경우)에 추가.
- (37)에서 가습 된 배양기에서 세포를 부화76; 5 % CO 2 C.
- 24 시간 후, 단계 3.1.2에 대해 다음 수정과 3.1.1-3.1.5 단계를 반복하여 형질 전환의 두 번째 라운드를 진행 : 감소 혈청 배지 130 ㎕를 10 μM의 siRNA (50 pmol의)의 5 μl를 희석.
- 분석하기 전에 37 ℃에서 1~2 일 동안 세포를 품어.
참고 : 형질과 두 번째 라운드에서 높은 siRNA를 / 형질 시약 비율의 사용의 두 라운드 BRCA2 침묵의 높은 효율을 얻을 필수적이다.
- 분석하기 전에 37 ℃에서 1~2 일 동안 세포를 품어.
면역 분석 4.를 Lyse 세포
- 비이 온성, 비 변성 세제 octylphenoxypolyethoxyethanol의 1 %, 5 mM의 피로 인산 나트륨, 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트, 10 mM의 불소화 나트륨, 2 mM 페닐 메틸 술 포닐 플루오 리드, 10 μg의 함유 PBS (PH 7.4)로 신선한 용해 버퍼를 준비 / ㎖ 류 펩틴, 10 μg의 / ㎖ 아프로 티닌. 얼음에 보관하십시오.
- 세포 및 W에서 매체를 제거접시에 차가운 PBS (2 ㎖ /도)로 한 번에 화산재. 어떤 PBS 이월을 방지하기 위해, 완전히 판에서 제거합니다.
- 각 웰에 용해 버퍼 200 μl를 추가합니다.
주 : 세포가, 다른 분석을 위해 사용될 세포를 Trypsinize 2.1-2.6 단계에서 설명한 바와 같이 용도에 따라 적절한 버퍼 / 배지에서 세포를 재현 탁 될 수있는 경우에 사용된다. - 조심스럽게 균일하게 용해 버퍼를 배포하고 회 전자에 4 ° C에서 15 분 동안 배양 접시를 회전 할 수 있습니다.
- 셀 스크레이퍼를 사용하여 얼음 마이크로 원심 튜브에 세포 용 해물을 수집.
- 4 ° C에서 25 분 동안 17,900 XG에 원심 분리기와 새로운 튜브에 뜨는를 수집합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 시판중인 단백질 분석법을 이용하여 단백질 농도를 측정한다.
5. BRCA2의 면역 분석
- 20 배 트리스 - 아세테이트 SDS 실행 B의 50 mL로 희석하여 런닝 버퍼를 준비uffer (50 mM의 트리 신, 50 mM 트리스 자료, 0.1 % SDS, pH가 8.24) 증류수 950 mL를.
- 다음과 같은 샘플을 준비한다 (20)의 최종 부피 15 총 세포 용 해물의 μg의, 4X 샘플 완충액 5 ㎕의 pH를 8.4에서 리튬 도데 실 설페이트를 함유하는, 10 배 샘플 환원제 (0.5 M DTT) 2 μL 및 용해 완충액을 추가 μL.
참고 :이 프로토콜은 (5 μg의 아래로) 또한 총 단백질의 낮은 금액을 사용하여 정상 세포 라인에 BRCA2의 검출 할 수있다. - 10 분 동안 55 ° C에서 샘플 변성.
주 : 55 ° C를 사용하는 것이 중요하다. BRCA2 단백질이 열성 (11)이기 때문에, 더 높은 변성 온도는 그대로 전체 길이 (390 kDa의) BRCA2 단백질의 일관된 손실이 발생할. - 제조업체의 지시에 따라 전기 영동 챔버를 설정한다.
- 샘플 및 precasted 젤에 고 분자량 사전 묻은 단백질 표준의 10 μl를 (트리스 - 아세테이트 3~8%)로드 및 AB 120 V에서 실행밖으로 2 시간 12. 55 kDa의 파란색 마커가 precasted 젤을 떠나기 전에 전기 실행을 중지합니다.
- 20 배 전사 완충액 50 ㎖, 100 % 메탄올 100㎖ 및 850 ml의 물을 전송 버퍼를 준비한다.
- 5 분 동안 100 % 메탄올에 침지하여 PVDF 막 (0.45 ㎛의 공극 크기)을 활성화하고 증류수로 헹구고, 적어도 5 분 동안 전송 버퍼로 평형화. 사용까지 4 ° C에서 전송 버퍼의 전송 장치의 스폰지를 적시 게.
- 전기 영동 실행이 종료되면, 다음 순서 (상향식)에 전송 스택에 샌드위치 조립 : 전송 버퍼 포화 세 스폰지 번 3MM 급 용지는 전사 완충액, 겔, 활성 PVDF 멤브레인 번 3MM 포화 전송 버퍼에서 포화 고급 종이 시트는, 세 스폰지는 전송 버퍼 (13, 14)에서 포화. 4 ℃에서 하룻밤 mA의 4 ° C에서 180에서 4 시간 동안 350mA의 장치 및 전송 단백질에 스택을 놓습니다.
주 : 고 분자량 단백질의 완전한 전송을 보장하기 위해 4 시간 또는 밤새 행 (제조 및 가장 전송 프로토콜에 의해 제안 된 바와 같이) 존재 BRCA2 매우 큰 단백질,이를 1 시간에서 전송 시간을 연장하는 것이 중요하다. 또한, 인해 긴 전송 시간에, 그 과열을 최소화하고 샌드위치 분해를 촉진하기 위해 4 ℃에서 냉장실에 블 롯팅을 수행하는 것이 필수적이다. 세미 드라이 전송 시스템은 큰 단백질을 전송하기위한 좋은하지 않습니다. - 전송 한 후 (30 μL 방지 BRCA2 토끼 폴리 클로 날 항체로 4 ℃에서 하룻밤 5 % 탈지 분유와 프로브를 포함하는 TBS-트윈 0.25 %에서 실온에서 1 시간 (TBS-T)를 위해 그것을 차단, TBS로 막을 세척 [: 300 (v / v)로 희석 한] 9 mL를 TBS-T + 5 % 탈지 분유로 희석 μg의 200 / ㎖).
- 다음 TBS 10ml에 희석 한 서양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 접합 된 항 - 토끼 이차 항체에 1 μL로 1 시간 동안 필터를 부화, TBS-T로 세 번 막 (각 10 분)을 씻어-T + 5 % 탈지 분유. 그 후, TBS-T로 막 세 번 (10 분마다)을 씻는다.
- 강화 된 화학 발광 (ECL) 웨스턴 블로 팅 검출 시약을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 BRCA2 단백질을 공개 ECL에 의해 면역을 수행합니다. 높은 해상도 ECL 필름에 immunochemiluminescent 밴드를 시각화.
- 10 항 튜 불린 항체의 1,000 (10 μL : β-tubulin에하는 단일 클론 항체를 이용하여 1 희석을하여 부하 제어와 같은 필터에, β - 튜 불린 (55 kDa의)처럼, 하우스 키핑 유전자에 대한 항체와 면역을 수행 실온에서 1 시간 동안 ml의 TBS-T + 5 % 무 지방 분유). 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 복합 항 마우스 대신 항 - 토끼 차 항체의 사용을 제외하고, 세척 및 BRCA2 (5.10-5.11)에 기재 한 바와 같이 차 항체를 품어.
- (immunochemiluminescent 밴드 감동 필름의 디지털 이미지를 획득 전용 이미지 분석 소프트웨어에 의한 밴드 강도를 분석 예., ImageJ에).
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Representative Results
세포 기능에 BRCA2 사일런의 효과를 조사하기 위해 생물학적 / 생화학 적 분석을 진행하기 전에 첫 번째 단계는 스크램블링 된 siRNA (siRNA의 비는 타겟팅) BRCA2의 siRNA와 나란히 (도 1a를 이용하여 소음의 특이성을 확인하는 것이다 ). 그것은 BRCA2 사일런의 높은 효율을 얻기 위해 높은 siRNA의 / 형질 비율의 siRNA 형질 감염의 두 번째 라운드를 수행하는 것이 중요하다. 실제로, siRNA를 형질의 한 라운드를 수행하거나 낮은 최저 효율 (그림 1B) 초래 두 번째 라운드 (siRNA를 25 pmol의와 형질 전환 시약의 6 μL)에 형질 전환 비율이 낮은의 siRNA를 사용하여. 두 번째 단계는 유전자 침묵의 최고 수준을 얻기 위해 최적의 최소 시간을 평가하는 것이다. 세포 유형에 따라, 이는 siRNA를 형질 번째 라운드 후 24 내지 48 시간이 변할 수있다. 예를 들어, 24 시간은 Nthy 갑상선 세포에 충분하지만 최대 48HR은 PNT1A 전립선 세포에서 효율적 BRCA2 녹다운 (도 2A)에 대해 필요하다. BRCA2 사일런 번째 형질 사이클 (도 2B) 후 7 일째까지 상당히 안정적이다. 참고로, 55 ° C (5 분 동안 100 ° C) 이상의 온도에서 세포 용 해물을 변성 인해 BRCA2 (11)의 온도 감응성에 BRCA2 단백질 (도 2C)의 최대 50 %의 손실을 초래한다.
최적의 침묵 시간이 확립되면, BRCA2 단백질의 손실의 영향은 여러 분석에서 이용 될 수있다. DNA 손상 15-18 원인 다른 화학 요법 약물뿐만 아니라 PARP 억제제에 대한 민감도를 증가 촉진 BRCA2의 기능 상실의 원인이 생체 내 돌연변이 때문에, 일반적인 분석은 PARP 억제제 rucaparib에 BRCA2 -silenced 세포의 감도를 결정하는 것이다 또는 oloparib. 도 3에보고 된 실험에서, 세포는 PNT1A O 고갈siRNA를 통해 F의 BRCA2 단백질은 세포 증식을 기반 MTT 세포 증식 분석에 의해 평가 된 후 24 시간 동안 10 μM rucaparib로 처리되었다. rucaparib 처리 (도 3) 후 세포 증식에서 시간 의존적 감소 BRCA2 단백질 결과 고갈.
그림 1. 형질 전환 시약 비 형질 전환과 높은 siRNA를 두 차례는 BRCA2 침묵을 향상시킬 수 있습니다. () BRCA2 침묵의 특이성 BRCA2 단백질 레벨의 비교를위한 대조군으로서 스크램블 된 siRNA (CTRL)을 사용하여, 형질 감염의 두 번째 라운드 후에 24 시간을 분석하여 면역 블 Nthy 세포에서 확인되었다. 분자량 마커가 왼쪽에보고된다. (B) PNT1A 세포 BRCA2 (S)의 1 또는 2 사이클을 실시프로토콜에 기재된 [사이클 (# 1) 및 (2)] 및 BRCA2 단백질은 면역 결핍에 의해 정량화 된 바와 같이 IRNA 형질. 스크램블 siRNA 로의 형질 감염은 2 사이클 제어 (CTRL)을 사용 하였다. 도 2b에서, PNT1A 셀 변경 (25 pmol의 siRNA를 / 6 μL 형질 감염 시약)으로서 제 2 사이클에서 형질 전환 시약 비율 하부의 siRNA를 사용하여 siRNA를 형질 BRCA2의 2 사이클을 실시 하였다. 모든 경우에, BRCA2 단백질 수준은 제 2 사이클 이후에 48 시간을 분석 하였다. 아래쪽에, BRCA2 단백질 수준의 정량화가 BRCA2 / 튜 불린 비율로보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
BRCA2의 최저 2. 최적화 그림. (A) Optim을알 BRCA2 최저 두 번째 siRNA를 형질주기 후 24 ~ 48 시간이 필요할 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 세포 라인 (PNT1A 및 Nthy)는 BRCA2 넉다운 24 시간 및 분석을 면역 블에 의해 제 2 siRNA를 형질 전환 사이클 후 48 시간 동안 평가 하였다. 아래쪽에, BRCA2 단백질 수준 (100) 데이터 3 개의 독립적 인 실험 SE ± 평균을 나타내는 설정, 시간 0 시간에 수준의 백분율로보고됩니다. (B) BRCA2 최저 7 일 동안 안정하다. PNT1A 세포는 면역에 의해 제 2 siRNA를 형질주기 후 196 시간까지 BRCA2 최저에 대해 평가 하였다. 튜 불린 신호 BRCA2의 비율은 아래쪽에보고된다. (C) BRCA2 단백질 감온이다. 비 형질 PNT1A 세포는 프로토콜에 따라 (약 70 % 전면 생장)을 도금 한 후 24 시간을 수거하고, 용해시켰다. 동일한 세포 용 해물 (15 μg의 총 단백질)의 두 개의 분취 량을 10 분 동안 또는 100 # 55 ° C에서 하나 변성 된(176) 5 분, BRCA2 단백질 레벨 C는 면역에 의해 평가되었다. 아래쪽에, 튜 불린 신호에 BRCA2의 비율은보고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. BRCA2 침묵은 PARP 억제제 rucaparib에 셀 감도를 증가시킨다. PNT1A 세포 중 하나를 컨트롤 (CTRL) 또는 BRCA2 siRNA를 형질 전환 된 형질 전환 후 48 시간을 수집하여 96 웰 플레이트에 도금 된 (2000 세포 / 웰). 24 시간 후, 10 μM의 rucaparib은 세포가 96 시간까지 약물의 부재 하에서 유지 된 후에 24 시간에 대한 세포에 첨가 하였다. 690 나노 미터 - 세포 증식은 550에서의 흡광도를 측정하여 MTT 분석법을 이용하여 지시 된 시간에 평가 하였다. EACH 시점은 대표적인 실험에서 세 개의 웰의 평균 ± SD를 나타낸다. Ctrl 키 siRNA를, 블루 라인, BRCA2의 siRNA, 레드 라인. 상단에, BRCA2 siRNA를 형질 세포에서 BRCA2 단백질 프로파일이보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
암수 유방암, 난소 암, 전립선 암, 췌장암 및 흑색 종 3,4- 포함한 여러 암 종류의 위험 증가 BRCA2 유전자 납 생식계 돌연변이는, 다수의 연구는 생물학적 기능을 이해하고 수행 되었기 때문에 BRCA2 단백질의. 이러한 연구의 대부분은 인해 BRCA2 같은 거대한 단백질을 분석하는 기술적 인 문제에 유전 적 기반 주로. BRCA2 단백질 발현을 침묵하고 분석하기위한 여기에 설명 된 방법은 생물학적 분석법의 광범위한 스펙트럼에 BRCA2 종양 억제 유전자의 기능을 연구하기위한 효율적인 수단을 제공한다. 침묵 프로토콜은 아직 BRCA2의 성공적이고 일관성있는 최저에 대한 몇 가지 중요한 변경뿐만 아니라 팁을 표준 siRNA를 형질 전환 절차를 기반으로합니다. siRNA의 형질 전환 프로토콜은 보통 LEN 이용한다 shRNA를, 다르게, 안전하고 신속하고 효율적이며tiviral 벡터는, 특정 바이오 절차를 필요로하지 않고 간편하게 세포 배양 설비가 갖추어져있는 실험실에서 수행 될 수있다. 마찬가지로, 면역 프로토콜 BRCA2 같은 큰 단백질의 효율적인 검출을 위해 최적화되었다. 면역 프로토콜은 또한 이종 9 효모 세포에서 발현 된 재조합 인간 BRCA2 단백질의 검출을 위해 검증되었습니다.
siRNA를 효율적으로 전달하기위한 몇 가지 중요한 요소는 여기에보고됩니다. 이들은 특히, 제 2 사이클에서 두 개의 형질의 사이클과 형질 전환 시약 비율이 높은 siRNA를 포함. 형질 전환 절차 이전에 항생제와시 부재는 또 다른 중요한 요소입니다. 그러나,이 절차는 박테리아 오염의 위험 증가와 배양 세포를 노출; 따라서 별도의주의 사항은 모든 단계에서 불임의 높은 수준을 보장하기 위해주의해야한다. 유의할, 세포 유형에 따라 효율적으로 유전자 knockdo 그WN 일반적으로 두 번째주기 후 24 ~ 48 시간이 필요합니다. 현재의 방법은 적어도 하루에 7 번째 형질 사이클이 끝날 때까지 매우 안정적인 침묵 유전자를 유지하는 장점이있다. 이것은 다른 화학 요법 약물에 대한 세포 반응을 포함한 생물학적 어 세이, 다양한 BRCA2 녹다운의 효과를 연구 할 수있다. 그러나, 본 기술의 한계가 외래의 siRNA 분자는 게놈에 통합되지 않는다는 사실에 의해 표현되는, 유전자 발현의 넉다운 따라서 안정을 도모 할 수 없다. 또한, 안정적인 최저를 얻기 위해, shRNA를 렌티 바이러스 감염은 실험실이 추가로 바이오 안전성 요구 사항 (BSL-2 표준 NIH의 지침에 따라)에 대한 준비가되어 있음을 제공, 수행 될 수있다. 형질 감염은 특정한 세포 유형으로 유전자 기능을 연구하는 (예., T 림프구)를 적용 방식이 아닌 경우뿐만 아니라, 셀 고유 조건부 BRCA2 녹아웃 마우스의 사용은 단지 altern 남아19 의안.
이 메소드는 또한 면역 리포트 의해 고 분자량 단백질의 성공적인 검출을위한 여러 팁과 높고 낮은 풍부 단백질 모두에 적합하다. 인해 BRCA2 단백질의 온도 감응성에, 특히, 낮은 변성 온도는 이전 연구와 일치한다 (11), 최적 검출을 위해 중요하다. 이 기술 '트릭'도 표준 면역 프로토콜에 의해 감지에 실패 입증되었습니다하는 다른 단백질에 유용 할 수있다. 우리는이 방법은 침묵과 다른 많은 도전 단백질의 검출을 용이하게 할 수있다, 따라서 일반적으로 유효 팁을 포함하고 있음을 기대하고 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1,000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
References
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
- Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
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