Summary
Coxiella burnetii är en obligat intracellulär gramnegativ bakterie som är ansvarig för den zoonos Q-feber. Här beskriver vi metoder för generering av Coxiella fluorescerande transposonmutanter mutanter samt automatisk identifiering och analys av de resulterande interna, replikering och cytotoxiska fenotyper.
Abstract
Invasion och kolonisering av värdceller från bakteriella patogener beror på aktiviteten hos ett stort antal prokaryota proteiner, definierat som virulensfaktorer, som kan undergräva och manipulera viktiga värdfunktioner. Studiet av värd / patogen interaktioner är därför oerhört viktigt att förstå bakterieinfektioner och utveckla alternativa strategier för att motverka infektionssjukdomar. Detta tillvägagångssätt kräver emellertid utvecklingen av nya hög genomströmning analyser för objektiv, automatiserad identifiering och karakterisering av bakterie virulensdeterminanter. Här beskriver vi en metod för generering av en GFP-märkt mutantbibliotek genom transposon mutagenes och utveckling av hög halt screening metoder för samtidig identifiering av multipla transposoninfogningar associerade fenotyper. Vår arbetsmodell är den intracellulära bakteriell patogen Coxiella burnetii, det etiologiska medlet för zoonos Q-feber, som är associerad med sigVere utbrott med åtföljande hälsa och ekonomisk börda. Den obligat intracellulära naturen hos denna patogen har, tills nyligen, allvarligt försvåras identifieringen av bakteriella faktorer som värd patogen interaktioner, vilket av Coxiella den idealmodell för genomförandet av hög genomströmning / hög innehålls metoder.
Introduction
Den framväxande, endemisk bakterien Coxiella burnetii är ansvarig för stora utbrott av Q-feber, en försvagande influensaliknande zoonos med allvarliga hälso- och ekonomiska konsekvenser 1. De viktigaste reservoarerna Coxiella är husdjur och lantbruksdjur, och man räknar med att mer än 90% av mjölkkor i USA bär C. burnetii 2. Människor är oavsiktliga värdar som är infekterade av inandning av förorenade aerosoler. Human Q-feber manifesterar antingen som en akut eller kronisk sjukdom, som kan få ödesdigra komplikationer med en dödlighet når 65% 1,3. Med en infektiös dos av 1 till 10 organismer, är Coxiella den mest infektiösa patogenen känd och det har undersökts som ett potentiellt biologiskt vapen 4. Den senaste tidens explosiva utbrott av Q-feber i Nederländerna (2007 - 2010), med fall eskalerande från 182 till mer än 2.000 per år, står som ett exempel på den allvarliga virulens hos denna patogen5.
Den anmärkningsvärda effektivitet Coxiella infektioner sannolikt i samband med dess motståndskraft mot miljöstress i kombination med dess unika anpassning till värdceller. Faktum är Coxiella närvarande i miljön i form av metaboliskt inaktiva små cellvarianter (SCV), som är anmärkningsvärt resistenta mot flera svåra förhållanden (uttorkning, temperatur, etc.). SCVs är upp tagen av fagocytiska celler via α V β 3 integriner 6 medan invasion av icke-fagocytiska celler medieras av Coxiella vidhäftning / invasion OmpA 7 och en ännu oidentifierad receptor. Efter upptag, Coxiella bosatt i åtsittande vakuoler, positiva för de tidiga endosomala markörer Rab5 och EEA1 8. Bakterier svarar på endosomal försurning genom att konvertera till metaboliskt aktiva stora cell varianter (lätta nyttofordon) och aktivera en Dot / Icm typ 4 sekretionssystemet (T4SS) 9, Mycket homolog med den av Legionella pneumophila 10. Utsöndringen av Dot / Icm effektorer tillåter Coxiella att generera ett stort, LAMP1 positiva sura fack som innehåller aktiva lysosomala enzymer där bakterier kan frodas och aktivt skydda infekterade celler från apoptos 11. Därför är den intracellulära cykel av Coxiella kontrolleras av Dot / ICM-medierad translokation av bakteriella effektorer 12, dock mikrobiella faktorer i värdcellinvasion, bakteriell replikering och spridning av infektionen fortfarande till stor del okända.
Kombinera transposonmutagenes och fluorescensbaserade analyser, utvecklar vi objektiva metoder för samtidig identifiering av bakteriella faktorer inblandade i de viktigaste stegen av Coxiella infektioner: 1) internalisering inom värdceller, 2) intracellulär replikering, 3) cell till cell sprids och 4) uthållighet. Till dags dato har vi screenas över 1.000 mutations i 500 Coxiella kodande sekvenser, som försett oss med oöverträffade insikter värd-patogen interaktioner som reglerar Coxiella patogenes 7. Notera kan tillämpat denna metod för studier av andra intracellulära patogener som delar cellbiologi funktioner med Coxiella.
Protocol
1. Generering av ett bibliotek av GFP-märkta Coxiella transposonmutanter mutanter
Manipulera Coxiella burnetii RSA439 NMII i en biosäkerhet skyddsnivå 2 (BSL-2) i en mikrobiell säkerhetsbänk (MSC) i enlighet med lokala regler. Om kompatibla med bakterie modell som används för att upprepa steg från 1.4.1 till 1.4.4 öka sannolikheten att erhålla klonala mutanter. En typisk mutantbibliotek är sammansatt (åtminstone) av ett antal mutanter som är lika med tre gånger antalet av kodande sekvenser kommenterade i genomet hos den organism som används.
- Framställning av elektrokompetent Coxiella RSA439 NMII:
- Bered 1x ACCM-2 13: 13,4 mM citronsyra, 16,1 mM natriumcitrat, 3,67 mM kaliumfosfat, 1 mM magnesiumklorid, 0,02 mM kalciumklorid, 0,01 mM järnsulfat, 125,4 mM natriumklorid, 1,5 mM L-cystein, 0,1 g / L Bacto Neopeptone, 2,5 g / L kasaminosyror, 1 g / L metyl-beta-cyklodextrin, 125 ml / l RPMI. Justera pH till 4,75 och filtrera sterilisera (inte autoklav). Obs: Vätska ACCM-2 är stabilt vid 4 ° C i ungefär en månad.
- Inokulera 100 ml ACCM-2 med 2 x 10 6 genomet motsvarande (GE) / ml av Coxiella RSA439 NMII (från en bakteriell lager tidigare genererade och kvantifieras som i steg 1,5) från -80 ° C lager och distribuera bakteriesuspensionen i 75 cm 2 cell odlingsflaskor med ventilerade lock (10 - 15 ml av bakteriesuspension per kolv). Växa under 7 dagar vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 och 2,5% O 2.
- Pool den erhållna bakteriesuspension i 50 ml rör och centrifugera vid 3900 xg under 1 h vid 4 ° C.
- Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 30 ml av 10% glycerol. Centrifugera vid 3900 xg under 1 h vid 4 ° C.
- Resuspendera pelleten i en tillräcklig volym av 10% glycerol (typiskt 2 ml) och delprov 50 ^ i 500 mikroliter rör. Håll återsuspenderade bacteria på is under hela processen. Obs: I det här skedet, bakterier är elektrokompetent och en portion är tillräckligt för att utföra en elektroporering. De bakteriella suspensionema kan lagras vid -80 ° C under 6 månader eller användas direkt för elektroporering av plasmid-DNA.
- Elektroporering av kompetent Coxiella med transposon- och transposas-kodande plasmider:
Obs: för följande protokoll, är det transponerbara elementet och transposaset kodas av två olika plasmider (pITR-CAT-GFP och pUC19-Himar1C9 respektive) 7. Båda plasmiderna saknar en Coxiella specifik replikationsursprung, vilket gör dem självmords plasmider när elektro i Coxiella. Detta säkerställer stabila transposoninsättningar. Den transponerbara ämnet innehåller en kloramfenikolresistens kassett under reglering av Coxiella promotor p1169 för urval och GFP-genen under reglering av Coxiella promotorn P311 för att märka de genererade mutanter med GFP.- Pre-kyla en 0,1 cm elektroporeringskyvett under 10 min på is. Blanda 50 il elektrokompetent Coxiella med 10 ug transposon plasmid och 10 mikrogram av transposas plasmid 7. Säkerställa att plasmiden koncentrationen är högre än 500 | ig / ml för att minimera utspädning av glycerolen.
- Elektroporera med följande inställning: 18 kV, 500 Ω, 25 iF. Se till att den resulterande tidskonstanten ligger mellan 9 och 13 msek.
- Omedelbart lägga 950 pl RPMI, resuspendera elektroporerade bakterier och överför till en skruvkork rör och hålla rumstemperatur.
- Ta 200 pl av electroporated bakterier och lägg till 3 ml ACCM-2 kompletterat med 1% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) i 6-brunnars plattor. Lägg 88 pl DMSO till den återstående volymen av electroporated bakterier (för att nå en slutlig koncentration av 10% DMSO) och förvara vid -80 ° C.
- Urval av mutanterna transposonmutanter:
- Incubate de sex-brunnars plattor inokulerade såsom beskrivits ovan (1.2.4) över natten vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 och 2,5% O 2. Lägga till lämpliga antibiotika (375 | ig / ml kanamycin eller 3 | ig / ml kloramfenikol). Inkubera bakteriekulturen under ytterligare 3 dagar i de ovan beskrivna betingelserna.
- Isolering av enskilda mutanter:
- Framställning av fasta ACCM-2 plattor och plätering av Coxiella transposonmutanter mutanter
Obs: Följande instruktioner är för 1 petriskål, flera utspädningar av bakteriekulturer måste testas för att bedöma den optimala ympning volymen för koloniisolering.- Värm 10,5 ml 0,5% agaros i en mikrovågsugn och låt den svalna i en 55 ° C vattenbad. Värm 11,25 ml 2x ACCM-2 (pH 4,75) vid 37 ° C.
- Förbered botten agaros:
- Blanda 10 ml av smält 0,5% agaros med 10 ml 2x ACCM-2 och lägga till lämpliga antibiotika (375 | ig / ml kanamycin eller 3pg / ml kloramfenikol).
- Häll omedelbart i petriskål. Håll petriskålens unlidded, låt mediet svalna i 30 min och lufttorka i 20 minuter.
- Förbered toppagaros:
- Blanda 1,25 ml 2x ACCM-2 med 0,75 ml vatten i en 5 ml polystyrenrör, lägga till lämpliga antibiotika (375 | ig / ml kanamycin eller 3 | ig / ml kloramfenikol) och inkubera vid 37 ° C.
- Lägg bakteriekulturen (typiskt 1 till 100 | j, l) och vortexblanda i 5 sek.
- Lägg 0,5 ml smält agaros, blanda och häll på botten agaros.
- Låt svalna i 20 minuter, byt ut locket på petriskål och inkubera vid 4 ° C under 20 minuter för att underlätta agaros stelning.
- Lufttorka 20 minuter unlidded i en MSC. Odla plattorna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 och 2,5% O 2 under 6 till 7 dagar.
- Lägg DMSO till de återstående bakteriernal kulturer i syfte att nå en slutlig koncentration av 10% DMSO och förvara vid -80 ° C.
- Utvärdera den optimala spädningen på följande sätt: att kolonier är 0,5 till 1 mm i diameter och är ordentligt isolerade för att undvika korskontaminering. Tina återstående bakteriekulturer från punkt 1.4.2 och platta vid lämplig utspädning på ACCM-2 agar som beskrivs i 1.4.1.2 och 1.4.1.3. Inkubera under 6 till 7 dagar enligt 1.4.1.3.5.
- När kolonier är detekterbara, samla ihop dem genom att skära i slutet av en 1 ml spets, plocka pluggen innehållande isolerade kolonier och dispergering kolonin genom pipettering i 1,5 ml ACCM-2 innehållande lämpliga antibiotika (375 | ig / ml kanamycin eller 3 | ig / ml kloramfenikol) i en 24-brunnsplatta. Förstärk enskilda kolonier i 6 dagar i de förhållanden som beskrivs i 1.3.1. På dag 3 av inkubation skingra bakterie klumpar genom att pipettera varje kultur.
- Lagra varje mutant suspension i 2D streckkods screwcap rör i 96-brunnsplattor i 10% DMSO vid -80 ° C.
- Framställning av fasta ACCM-2 plattor och plätering av Coxiella transposonmutanter mutanter
- Utvärdering av bakteriell koncentration:
Obs: Följande protokoll kan tillämpas för att erhålla de tillväxtkurvor av bakteriella mutanter repliker i axenisk mediet (se 1.4.4).- Standardkurva preparatet:
- Bered en 2 | ig / ml förrådslösning av dsDNA (typiskt en slumpmässig plasmid med känd storlek och koncentration) i 1x Tris-EDTA (TE). Förbered 10-faldiga seriespädningar från stamlösningen för att erhålla koncentrationer varierande från 2 | ig / ml till 2 ng / ml. Fördela 50 pl av varje koncentration till enskilda brunnar i en 96-håls mikro med svarta väggar och botten (se tabell av material).
- Späd dsDNA kvantifiering reagens 1: 200 i 1 x TE-buffert och tillsätt 55 pl av den utspädda reagens till varje prov i 96-brunnars mikroplatta. Blanda väl med användning av en plattskakanordning och inkubera i 2 till 5 minuter vid rumstemperatur, i mörker.
- Mät prover fluorescens med hjälp av en fluorescerariou mikroläsare och filter för standard fluorescein våglängder (excitation ~ 480 nm, emission ~ 520 nm).
- Plotta plasmiden koncentrationsområdet mot de fluorescensintensitetsavläsningar.
- Bakteriesuspension kvantifiering:
- Fördela 5 pl 10% Triton X-100 per brunn i en 96-brunnsmikro med svarta väggar och botten (se tabell av material). Lägg 50 pl av de bakteriella suspension till varje brunn och inkubera 10 minuter vid rumstemperatur, på en plattskakanordning.
- Späd dsDNA kvantifiering reagens 1: 200 i 1 x TE-buffert och tillsätt 55 pl av den utspädda reagens till varje prov i 96-brunnars mikroplatta. Blanda väl med användning av en plattskakanordning och inkubera i 2 till 5 minuter vid rumstemperatur, i mörker.
- Mät prover fluorescens med hjälp av en fluorescensmikroplattläsare och filter för standard fluorescein våglängder (excitation ~ 480 nm, emission ~ 520 nm).
- För att få den bakteriella DNEn koncentration, plotta fluorescens avläsningar i diagrammet som erhållits i punkt 1.5.1.4. Dividera DNA-koncentrationen genom massan av Coxiella genomet (2,2 fg) för erhållande av bakteriekoncentrationer. Uttryck resultat i Genome Ekvivalenta / ml.
- Släng mutanter som uppvisar en betydande tillväxt defekt i ACCM-2.
- Standardkurva preparatet:
2. Single Primer Colony PCR, sekvensering, och Notering
Obs: Följande protokoll är för DNA förstärkning av 96 prover, är en flerkanalspipett rekommenderas för följande steg. Kolumn rening av PCR-produkter med hjälp av magnetiska pärlor och DNA-sekvensering med en transposon-specifik primer (2,3) läggs ut på entreprenad till ett externt företag.
- Kontrollera att amplifieringsprimem är utformad för att hybridisera mellan 100 och 200 baspar uppströms om den inverterade tandemupprepning (ITR), för att erhålla PCR-produkter som omfattar transposonen insättningsstället på Coxiellett genom. Förbered 3 ml PCR-blandning (1x hifi-buffert, 200 ^ M dNTP, 1 pM amplifieringsprimer, 20 U / ml high fidelity-DNA-polymeras) och dispensera 29 ul per brunn i en 96-brunnars PCR-platta inställd på is. Överföring 1 | il av varje mutant i stationär fas i ACCM-2 till PCR-blandningen.
- Kör PCR med initial denaturering (98 ° C, 1 min), 20 med hög stringens cykler (98 ° C, 10 sek; 50 ° C, 30 sek; 72 ° C, 90 sek), 30 låg stringens cykler (98 ° C, 10 sek; 30 ° C, 30 sekunder; 72 ° C, 90 sek) och 30 hög stringens cykler (98 ° C, 10sec; 50 ° C, 30 sek; 72 ° C, 90 sek) följt av en slutlig förlängning vid 72 ° C under 7 min.
- Rena PCR-produkter med hjälp av magnetiska pärlor och sekvens DNA med en transposon-specifik primer. Plan transposonen-specifik primer med en förutsagd smälttemperatur som ligger mellan 50 ° C och 75 ° C, ett innehåll GC mellan 40% och 60%, en längd mellan 18 och 25 nukleotider och en glödgning site nedströms amplifieringsprimern hybridiseringsstället och minst 100 baspar uppströms om den första basen paret av transposonen ITR.
- Använda mjukvara för sekvensanalys, ladda hela, kommenterade genomet av Coxiella burnetii 493 NMI. Använd "align till referens" funktion för att lasta och rikta (BLASTN) sekvense resultaten och bestämma platsen för genomförandet. Kasta mutanter med icke-matchande och / eller visning av dubbel reads.To övervaka mättnad av mutantbibliotek, föra ett register över förekomsten av flera transposoninsättningar på samma plats.
3. eukaryota celler Utmana med Coxiella mutanter och övervakning av intracellulära tillväxt
Obs: En multikanalpipett rekommenderas för följande steg. Infektioner utfördes i triplikat i steril 96-brunnars mikroplattor med svarta väggar och platt transparent botten. vikt- Coxiella burnetii uttrycker GFP 14 wsom tillhandahålls av Dr Robert Heinzen.
- Väx Veroceller i RPMI utan fenolrött kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) i frånvaro av antibiotika (fullständigt RPMI-medium).
- Dagen före infektion, tvätta Vero-celler från en konfluent eller subkonfluent cellkultur-kolv med 10 ml PBS.
- Drag av Vero-celler genom att tillsätta 1 ml trypsin-EDTA-lösning till cellodlingskolv och inkubera under 3 till 5 min vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2.
- Resuspendera cellerna i 10 ml av fullständigt RPMI media. Räkna celler och framställning av en cellsuspension av 10 5 celler per ml.
- Dispensera 100 pl av cellsuspensionen i varje brunn i en svart 96-brunnar med platt transparent botten.
- Centrifugera i 5 min vid 400 xg vid rumstemperatur för att underlätta cellvidhäftning vid botten av brunnarna och inkubera över natten vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2.
- Tina 96-brunnars plattor innehållande Coxiella mutanter vid RT och späd 150 | il av bakteriesuspension i 300 | il RPMI utan fenolrött och FBS i en djup brunn 96-brunnar.
- Ta bort materialet från mikro innehållande Vero-celler och fördela 100 ul / brunn av de utspädda Coxiella mutanter (MOI av 100). Använd väl A1 som negativa (icke-infekterade celler) kontroll- och brunnar A2 och A3 som positiva kontroller (celler som infekterats med wt Coxiella uttrycker GFP 14 vid multipliciteter av infektioner (MOI) av 100 och 200).
- Centrifugera plattan i 10 minuter vid 400 xg vid rumstemperatur med användning av en aerosol tätt centrifug hållare.
- Inkubera vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 under 2 h sedan ersätta bakterier innehållande medium med 100 | il / brunn av färskt, komplett RPMI-medium.
- Mät GFP fluorescens varje dag i 7 dagar med en fluorescensmikroplattläsare och filter för standard fluorescein våglängder (excitation ~ 480 nm, emission ~ 520 nm). Att undvikastörningar på grund av kondens och signalspridning i odlingsmediet, använd botten excitation och inspelnings utsläpp på mikroplattläsare.
4. Framställning av prover för automatiserad Image Acquisition
Obs: Proceduren är en 96-brunnar, skala upp volymerna i enlighet därmed. Steg från 4,2 kan dra nytta av en plattvättare.
- På den 7: e dagen efter infektion, ta bort mediet från plattan och ersätta det med 50 | il / brunn av färskt, komplett medium innehållande en cellpermeabla fluorescerande färgämne vid lämplig utspädning (vanligtvis 1: 1000, kan optimeras i enlighet med den använda cellinjen ). Inkubera cellerna för 30-60 min vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2.
- Byt medium med 50 | j, l / brunn av 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, inkubera under 30 min vid rumstemperatur (RT) sedan bort PFA-innehållande buffert och tvätta tre gånger med PBS.
- Ta bort PBS och dispense 50 | il / brunn av blockeringslösning (0,5% bovint serumalbumin, 50 mM NH4CI i PBS, pH 7,4) kompletterad med 0,05% saponin. Inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter.
- Ersätt blockerande lösningen med 40 | il / brunn av färskt blockeringslösning kompletterad med saponin (enligt ovan) och med en anti-LAMP1 antikropp vid en 1: 500 utspädning. Inkubera plattan i 30 minuter vid RT.
- Avlägsna blockeringslösning och tvätta 96-brunnar 5 gånger med 100 | il / brunn PBS.
- Dispensera 40 | il / brunn av blockeringslösning kompletterad med saponin (såsom ovan), den lämpliga fluorescensmärkt sekundär antikropp (vid en utspädning av 1: 1000) för att avslöja den anti LAMP1 antikropp appliceras vid steg 4,4, och med Hoechst 33258 vid 5 ^ g / ml. Inkubera plattan i 30 minuter vid RT.
- Avlägsna blockeringslösning och tvätta 96-brunnar 5 gånger med 100 | il / brunn PBS. Låt volym PBS som motsvarar den sista tvättningen i 96-brunnar, eftersom de fixerade cellerna inte bör torka ut.
- Bild plattan omedelbart eller förvara plattan vid 4 ° C, skyddad från ljus, för efterföljande analys.
5. Image Acquisition
- Förvärva bilder i GFP (488 nm, bakterier), Hoechst 33258 (350 nm, värdcell kärnor), röd (~ 555 nm, cellmembranet markör) och långt rött (~ 615 nm, LAMP1) kanaler med hjälp av en epifluorescens automatiserat mikroskop utrustade med en 20X mål. Förvärva 21 oberoende fält per brunn för att avbilda ett minimum av 5000 celler per prov. Applicera autofokusering med användning värdcellen kärnor kanal som en referens. När man arbetar med bakteriella patogener infekterar en låg andel av värdceller, kan användare justera antalet oberoende fält avbildas per brunn, för att erhålla ett minimum av 500 infekterade celler för att analysera.
6. Bildbehandling
Obs: Följande steg är specifika för användning av bildanalysmjukvara CellProfiler. I samtliga fall den optimala algorithm indelnings måste definieras experimentellt och föremålen vidrör gränsen till bilden bör undanröjas med motsvarande funktion.
- Läs in alla bilder i CellProfiler.
- Använd modulen "ImageMath" att subtrahera GFP kanalen från Hoechst-kanalen, för att undvika upptäckt av Coxiella kolonier (också märkta med Hoechst) som värdcellkärnor i följande steg.
- Använd modulen "IdentifyPrimaryObjects" till segment värdcellkärnor från den resulterande bilden av steg 6.2. Namnge segmente objekt "Nuclei".
- Använd modulen "IdentifySecondaryObjects" till segment värdceller från 555 nm bilder med hjälp av kärnan upptäckts vid steg 6.3 som frön. Namnge segmente objekt "celler".
- (Tillval) Använd modulen "IdentifyTertiaryObjects" att subtrahera kärnor som identifierats i steg 6,3 från celler som identifierats i steg 6,4. Namnge segmente objekt "Cytoplasm221 ;.
- Använd modulen "EnhanceOrSuppressFeatures" på 615 nm bilderna för att ta bort bakgrunden och underlätta följande identifiering av LAMP1-positiva fack.
- Använd modulen "IdentifyPrimaryObjects" på bilden som erhållits vid steg 6,6 för att identifiera LAMP1 positiva fack. Namnge segmente objekt "Lysosomer".
- Använd modulen "IdentifyPrimaryObjects" på 488 nm bilden för att identifiera Coxiella kolonier. Namnge segmente objekt "kolonier".
- Använd modulen "IdentifySecondaryObjects" på 615 nm bilderna för att identifiera Coxiella innehåller vakuoler med hjälp av Coxiella kolonier detekteras i steg 6,8 som frön. Namnge segmente objekt "CCVS".
- Använd modulen "MaskObjects" för att välja CCVS upptäckts på celler (som celler vidrör gränsen till bilden har eliminerats, kan vissa CCVS upptäckas "utanför" celler). Namnge resulting objects "Filtrerad CCVS".
- Använd modulen "MaskObjects" för att välja Kolonier upptäckts på celler (som celler vidrör gränsen till bilden har eliminerats, kan vissa kolonier upptäckas "utanför" celler). Namnge de resulterande objekten "filtrerad Colonies".
- Använd modulen "MaskObjects" att associera Lysosomer till celler. Namnge de resulterande objekten "filtrerad Lysosomer".
- Använd modulen "MaskObjects" för att välja celler som innehåller Coxiella kolonier. Namnge de resulterande objekt "infekterade celler".
- Använd modulen "Relatera objekt" för att ställa in objekt "filtrerad CCVS" som barn moder objekt "celler". Detta gör det möjligt att räkna antalet CCVS / Cell.
- Använd modulen "Relatera objekt" för att ställa in objekt "filtrerad Colonies" som barn moder objekt "celler". Det här kommer atttillåta att räkna antalet kolonier / Cell.
- Använd modulen "Relatera objekt" för att ställa in objekt "filtrerad Lysosomer" som barn moder objekt "celler". Detta gör det möjligt att räkna antalet Lysosomer / Cell.
- Använd modulen "MeasureObjectSizeShape" för att få en morfologisk analys av kärnor, celler, filtrerat CCVS, filtrerat Kolonier och filtreras Lysosomer
- Använd modulen "MeasureObjectIntensity" att kvantifiera GFP fluorescens i samband med filtrerad CCVS och uppskatta effektiviteten av Coxiella replikering inom CCVS.
- Använda modulerna "OverlayOutlines" och "SaveImages" overlay segmente resultat och den ursprungliga bilden för kvalitetskontroll.
- Använd modulen "ExportToSpreadsheet" för att exportera alla eller ett urval av bildanalysresultat.
- (Tillval) Använd modulen "ExportToDatabase" för att analysera resultatanvända programvaran CellProfiler analytiker.
7. Data Analysis
- För varje parameter som erhållits, identifiera och eliminera extremvärden (på grund av felaktigheter i bildsegmentering) sedan beräkna medelvärden per mutant.
- Använd Z-poäng för att identifiera viktiga fenotyper. Tänk fenotyper med en Z-score> -2 som icke signifikant, fenotyper med en Z-poäng mellan -2 och -4 som milda och fenotyper med en Z-score ≤ -4 lika stark.
- Handling kombinationer av parametrar enligt experimentella behov.
Representative Results
Vid isolering av transposonmutanter mutanter, är enda primer koloni-PCR en robust, hög genomströmning metod för att identifiera platsen för transposoninfogning för varje mutant. Detta tillvägagångssätt härrör från en typisk innesluten PCR-protokollet men här en enkel primer hybridiserar specifikt och / eller icke-specifikt till mall-DNA beroende på stringensen av glödgningstemperatur (Figur 1A). De typiska PCR-produkterna består av flera DNA-fragment, varav de flesta är specifika (Figur 1B). Användningen av en annan sekvenseringsprimer som hybridiserar just uppströms om transposonen ITR, och nedströms om den sekvens som känns igen av amplifieringsprimern ger specificitet för sekvensesteget (Figur 1C). Automatiserad mjukvara för sekvensanalys anpassar de erhållna sekvenserna till Coxiella genomet ger den exakta platsen för transposoninsättningar (Figur 1C). Alla transposoninsättningar kan vara sedan annotated på Coxiella genomet (figur 1D).
Varje Coxiella mutanten isoleras och amplifieras axeniskt i ACCM-2 medium före antingen lagring eller sållning. Figur 2 illustrerar ett exempel på 38 transposonmutanter mutanter i 16 punkter / icm Coxiella gener (Figur 2A). För att bedöma lönsamheten för Coxiella mutanter är axenisk tillväxtkurvor som erhållits genom provtagning bakteriekulturer i 7 dagar efter ympning och tillämpa analysen bakteriekoncentrationen som beskrivs i 1.5 (Figurie 2B). Amplifierade mutanter inkuberas sedan med epitelceller, i tredubbla 96-brunnsplattor för 7 dagar. Alla Coxiella mutanter genererade varvid GFP-märkta, är intracellulära tillväxtkurvor som erhållits genom mätning av GFP-fluorescensintensiteten hos varje brunn, varje 24 h, och plottning av de uppmätta värdena som en funktion av tiden (figur 2C).
Intracellulära tillväxtkurvor ger kvantitativ analys av de fenotyper som är förknippade med varje transposoninfogning i Coxiella genomet. Om du vill lägga kvalitativ information om samma mutanter transposonmutanter, valde vi för automatiserad insamling och analys. Sju dagar efter infektion, plattor är fasta, behandlas för immunofluorescens som beskrivs i 4 och analyseras med hjälp av en automatiserad, epifluorescensmikroskop som beskrivs i 5. Automatiserad bildanalys program som CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.com ) behandlar de förvärvade kanaler självständigt och segment identifieras föremål för jämförande analys (Figur 3). Detta gör det möjligt att identifiera och morfologiska karakterisering av värdcellkärnor, cell konturer, lysosomer och Coxiella kolonier (Figur 3 toppanelerna). Korrelering Coxiella kolonier med celler och lysosomer tillåter identifiering tapå och specifik morfologisk analys av Coxiella-innehållande vakuoler (som är LAMP1 positivt, Figur 3 nedre vänstra panelen). Korrelering Coxiella kolonier med värdcell konturer möjliggör identifiering och specifik morfologisk analys av infekterade celler (Figur 3 längst ner i mitten panel). Slutligen är de fyra kanalerna fusione som illustration och kvalitetskontrolländamål (fig 3 nedre högra panelen).
Data som erhållits från automatiserad bildanalys kan plottas mot varandra för att få "multi-fenotypiska scatter tomter". Som ett exempel, i figur 4A den genomsnittliga arean (i ^ m 2) av Coxiella kolonier är avsatt mot antalet kolonier per cell (fig 4A), för att identifiera mutationer som påverkar intracellulär replikation av Coxiella (replikationsfenotyp) och / eller kapaciteten hos bakterier att invadera värdceller (internatiosering fenotyp). Statistisk analys användes för att definiera regionerna i den resulterande punktdiagram motsvarande milda (-4 <Z-score ≤ -2) och svår (Z-score ≤ -4) fenotyper. Mutanter observerades i 3 huvudområden: mutationer som resulterade i en defekt intracellulär tillväxt Coxiella grupperades i vänstra delen av tomten (Figur 4A, rosa och röda prickar); mutationer som påverkade Coxiella interna i celler grupperades i den nedre delen av tomten (Figur 4A, ljust och mörkt blå prickar) och slutligen, gröna prickar i längst till höger regionen av tomten motsvarar mutationer som resulterar i icke-signifikanta fenotyper ( Z-score> -2). Viktigt är mutanter som inte replikera men som fortfarande är i stånd att invadera värdceller, detekteras efter 7 dagar av infektion som enkla bakterier, eller små kolonier, som gränsar till värdcellkärnor (fig 4C, andra panel). Således, storleken av Coxiella "cologen "kommer att påverkas i hög grad, men antalet infekterade celler kommer inte att variera jämfört med WT Coxiella infekterade celler. Tvärtom, mutationer som påverkar förmågan av Coxiella att invadera värdceller resulterar i en minskning av antalet kolonier / cell. När detta antal är betydligt under 1, betyder det att, i genomsnitt, det finns en minskning av det totala antalet infekterade celler. Alternativt kan den genomsnittliga område (i pm 2) av Coxiella kolonier ritas mot antalet värdceller som överlever infektion (Figur 4B), för att identifiera mutationer som ger cytotoxicitet till Coxiella (cytotoxiska fenotyp). Som ovan, var statistisk analys som används för att definiera regionerna i den resulterande punktdiagram motsvarande milda (-4 <Z-score ≤ -2) och svår (Z-score ≤ -4) fenotyper. Mest skärmad mutationer påverkade inte signifikant cellöverlevnad, oavsett bakteriell replikering inom värdceller (Figur 3B gröna prickar). 37 mutationer milt påverkade värdcellöverlevnad (Figur 3B, ljusröd punkter), och 7 mutationer var särskilt skadligt för värdcellöverlevnad (Figur 3B, mörka röda prickar). Observera att ytterligare parametrar som erhållits genom den automatiserade bildanalysförfarande kan användas för att härleda andra diagram, enligt experimentella behov.
Figur 1:. Sekvensering och annotering av Coxiella transposonmutanter mutanter (A) Single primer koloni-PCR används för att förstärka DNA-fragment som innehåller platsen för transposoninfogning. En amplifieringsprimer (Amp) används både som en specifik och icke-specifik primer beroende på stringensen av glödgningstemperaturen. (B) Typiska resultat av enkel primer koloni-PCR. Varje Reactipå producerar ett antal fragment av varierande storlek, varav en del innehåller transposonen insättningsstället; några andra är slumpvis amplifierade som biprodukter av låg stringens PCR-cykeln. (C) Användningen av en sekvenseringsprimer (Seq) som hybridiserar till transposon sekvensen tillåter sekvensering av fragment av intresse. (D) mjukvara för sekvensanalys möjliggör automatisk annotering av transposoninsättningar på det bakteriella genomet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Axenisk och intracellulär tillväxt Coxiella transposonmutanter mutanter (A) I pilot skärmen, har vi isolerat, sekvenserades och screenades 38 transposonmutanter mutanter i 16 kärn genes av Coxiella prick / ICM sekretionssystemet (markerade med rött). (B) För att bedöma lönsamheten för varje transposon mutant, tillväxten av varje isolat i axenisk odlingsmedium övervakas under 8 dagar med en fluorescerande taggade DNA interkalerande medel. (C) Varje mutant används därefter för att infektera epitelceller. Som transposon har en GFP kassett, är intracellulär bakterietillväxt övervakades under 7 dagar av infektion genom att följa variationer av GFP fluorescens i samband med Coxiella replikering, med hjälp av en mikroplattläsare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Automatiserad bildanalys av Coxiella infektioner En automatisk.Mated epifluorescensmikroskop används för att bilden 21 positioner per brunn av tredubbla 96-brunnsplattor. Bildanalysmjukvarusegment objekt i varje förvärvade kanaler för kvantifiering och analys. I samtliga fall är föremål vidrör gränsen av bilderna uteslutas. (A) Hoechst-kanalen används för att identifiera värdcellkärnor (inringade i grönt). (B) Dessa används som frön för att identifiera värdcell konturer i Cy3 kanalen (positionen för kärnor är inringat i blått, cell konturer är i grönt). (C) Den Cy5-kanalen används för att identifiera LAMP1 positiva fack (inringade i grönt); bara de objekt som ingår i de tidigare identifierade cell konturer (i rött) behålls för bildanalys. (D) GFP-kanalen används för att identifiera Coxiella kolonier (inringade i grönt). (E) Korrelering Coxiella kolonier med LAMP1 positiva fack möjliggör identifiering av Coxiella (F) Korrelering Coxiella kolonier med cell konturer möjliggör identifiering av infekterade celler (pseudocolored). (G) Bilder som förvärvats i 4 fluorescenskanalerna (motsvarande Coxiella kolonier (grön), värdcellkärnor (blå), värdcell plasmamembranet (grå), LAMP1-positiva fack (röd)) slås ihop och används för att illustrera och kvalitet kontroll. Skala barer 10 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Storskalig identifiering av Coxiella faktorer som värd / patogen samverkarjoner. (A) Den genomsnittliga område (i pm 2) av Coxiella kolonier plottas mot det relativa antalet kolonier per cell, för att identifiera replikering och internalise fenotyper av intresse. Gröna prickar representerar fenotyper som avviker från WT Coxiella av en Z-score> -2 (ej signifikant). Rosa och ljusblå prickar representerar replikering och internalise fenotyper respektive med en Z-poäng mellan -2 och -4 (milda fenotyper). Röd och mörkblå prickar representerar fenotyper med Z-score ≤ -4 (starka fenotyper). (B) Den genomsnittliga område (i pm 2) av Coxiella kolonier avsattes mot det totala antalet celler (infekterade och inte infekterade) som överlevde 7 dagar på infektion för att uppskatta den cytotoxiska effekten till följd av transposoninsättningar. Gröna prickar representerar fenotyper som avviker från WT Coxiella av en Z-score> -2 (ej signifikant). Rosa prickar representerar cytotoxiska phenotypes med Z-poäng mellan -2 och -4 (milda fenotyper). Röda prickar representerar cytotoxiska fenotyper med Z-score ≤ -4 (starka fenotyper). Pilar indikerar mutanter illustreras av motsvarande gemena bokstaven i C. (C) Representativa bilder av replikering, internalisering och cytotoxiska fenotyper. I samtliga fall, värdcellkärnor är i rött, Coxiella kolonier är i grönt. Skala barer 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Studiet av värd / patogen interaktioner har visat sig vara en märklig metod för att förstå bakterieinfektioner och utveckla alternativa strategier för att motverka infektionssjukdomar. Men på grund av den mångfald av strategier som utarbetats av olika bakteriella patogener, identifiering och karakterisering av bakteriella virulensfaktorer och värd signalvägar som är riktade vid infektioner utgör en verklig utmaning. Detta kräver utveckling av nya metoder för storskalig kartläggning av viktiga värden / patogen interaktion nav. Den senaste tidens utveckling av innovativa, hög genomströmning och hög-innehåll screeningmetoder utgör en ovärderlig resurs som kan anpassas till studiet av intracellulära bakteriella patogener 15. Här har vi använt zoonotiska bakteriell patogen Coxiella burnetii som en modell för att utveckla screening strategier som kombinerar transposonmutagenes och fluorescensbaserade analyser. Importantly denna screeningmetod medger samtidig övervakning av flera steg i Coxiella intracellulära cykeln, vilket ger en helhetsbild av de strategier som utvecklats av denna bakterie att invadera, replikera och kvarstå inom infekterade celler.
Den strategi som beskrivs här bygger på två väletablerade tekniker, transposonmutagenes och fluorescensbaserade analyser, som med framgång har tillämpats till studiet av bakteriella patogener. Kombinera dessa tekniker i samband med hög genomströmning / high-innehåll skärmar ger oss möjlighet att utvärdera effekterna av ett stort antal bakteriella mutationer genom att analysera ett mycket stort antal händelser (typiskt 15.000 infekterade celler per bakterie mutationer avbildade och analyseras). Detta ger en viktig statistisk analys av händelser såsom bakteriell invasion av värdceller och intracellulär replikering, som är till sin natur, med förbehåll för hög variabilitet. Det är viktigt att notera att andra än ep cellinjerithelial kan användas för denna typ av screening. Emellertid platta och stora epitelceller är optimala för bildanalys som värdcellorganeller är lättare att upptäcka. Eftersom majoriteten av automatiserade mikroskop kan automatiskt hantera ett stort antal plattor, det finns nästan inga gränser för antalet mutanter som kan screenas samtidigt. Beroende på den patogen, kan användaren förmånen att använda en epifluorescens eller ett konfokalt mikroskop. Tidpunkten för bildtagning kommer främst att bero på känsligheten hos mikroskopkamera, på antalet fält som förvärvats per brunn och på antalet kanaler som köps per synfält. Användaren kan bestämma hur man justera dessa faktorer för att optimera screening protokollet. Som ett exempel, avbildas vi en 96-brunnsplatta / h med användning av de betingelser som anges i punkt 5.1. Bildanalys beror till stor del på maskinen (eller kluster av maskiner) används. Vi använder en 12-core (2 x 3,06 GHz 6 kärnor), 48 GB RAM arbetsstation. Denna maskin kräver approxifär 40 minuter för att analysera bilder som förvärvats från en platta.
En viktig aspekt som skall tas med i beräkningen vid utveckling av dessa analyser är inrättandet av nya (eller optimering av befintliga) protokoll för att tillåta manipulation och bearbetning av ett stort antal prover. Ett typiskt exempel är utvecklingen av den inre primer koloni-PCR metod, som tillät oss att snabbt förstärka och sekvens Coxiella DNA-fragment innehållande platsen för insättning av varje transposon, från mycket små prover. Baserat på vår erfarenhet, har hifi-polymeras noga utvalda och testade för att få reproducerbara resultat. Den enda begränsningen av denna metod kan gömma sig i observationen att, i de flesta fall, ca 30% av de behandlade proverna inte utnyttjas, antingen på grund av PCR eller sekvense steg. Men med tanke på att isoleringen av nya transposonmutanter mutanter Coxiella inte är ett hastighetsbegränsande steg, detta inte represkickade en viktig fråga. På samma sätt har utvecklingen av en tillförlitlig analys för att kvantifiera bakteriell koncentration av muterade bestånd varit avgörande för denna strategi. På grund av tendensen hos Coxiella att aggregera när i suspension, är användningen av optiska densitetsavläsningarna inte är tillämpliga för att beräkna koncentrationen av Coxiella kulturer och den enda existerande alternativet var kvantitativ PCR (qPCR). Här är användningen av ett fluorescensmärkta DNA-inskjutande medlet signifikant påskyndas bakterier kvantifiering.
Detta tillvägagångssätt kan också dra nytta av användningen av stabila cellinjer som uttrycker fluorescerande markörer för flera intracellulära avdelningar beroende på patogenen används. En annan viktig aspekt är användningen av cellodlingsmedier som saknar fenolrött. Vi observerade att denna pH-indikator har en naturlig fluorescens spänner de röda och gröna spektrum som mättar signal som är inspelad på den automatiserade fluorescensläsare.
THan strategi som presenteras här bygger på slumpmässigt transposonmutagenes. För mutanter av intresse, rekommenderar vi att validera unika införlivande (och clonality) med hjälp av Southern blot och PCR-amplifieringar av transposonen insättningsstället.
Förutom den utrustning som beskrivs i protokollet avsnittet lag intresserade av att använda metoden screening presenteras här kommer att ta stor fördel i inrättandet av en relationsdatabas för datainsamling, en server för lagring av data och en arbetsstation för snabb bildanalys.
Viktigt är att metoden beskrivs här är lämpad för studier av andra intracellulära bakteriella patogener som en slumpmässig mutagenes metod existerar för patogenen kan cellinjer infekteras av patogenen och detta visar en specifik fenotyp under infektion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
| Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
| Fetal bovine serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
| Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
| Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
| Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
| 96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
| 96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
| 96-well plate, deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
| PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
| Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
| Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
| Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
| Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
| Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |
References
- Maurin, M., Raoult, D. Q fever. Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).
- Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States. Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).
- Kazar, J. Coxiella burnetii. infection. Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).
- Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).
- Der Hoek, W. V. an, et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).
- Capo, C., et al. Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3. Journal of immunology. 163 (11), Baltimore, Md. 6078-6085 (1999).
- Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell. Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Newton, H. J., Mcdonough, J. a, Roy, C. R. Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole. PloS one. 8 (1), e54566 (2013).
- Vogel, J. P. Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii. Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).
- Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii. Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).
- Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. mBio. 2, (2011).
- Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium. Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).
- Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).
- Brodin, P., Christophe, T. High-content screening in infectious diseases. Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).
