Summary
Coxiella burnetii er en obligat intracellulær Gram-negativ bakterie er ansvarlig for zoonotisk sygdom Q-feber. Her beskriver vi fremgangsmåder til generering af Coxiella fluorescerende transposon mutanter samt automatiseret identifikation og analyse af de resulterende internalisering, replikations- og cytotoksiske fænotyper.
Abstract
Invasion og kolonisering af værtsceller ved bakterielle patogener afhænge af aktiviteten af et stort antal af prokaryote proteiner, defineret som virulensfaktorer, som kan nedbryde og manipulere centrale vært funktioner. Studiet af vært / patogen interaktioner er derfor yderst vigtigt at forstå bakterielle infektioner og udvikle alternative strategier til infektionssygdomme. Denne tilgang dog kræver udvikling af nye high-throughput assays til fordomsfri, automatiseret identifikation og karakterisering af bakterielle virulensdeterminanter. Her beskriver vi en fremgangsmåde til frembringelse af et GFP-mærket mutant bibliotek ved transposon-mutagenese og udvikling af høj-indhold screeningsmetoder til samtidig identifikation af multiple transposon-associerede fænotyper. Vores arbejdsmodel er det intracellulære bakterielle patogen Coxiella burnetii, det ætiologiske agens for zoonosen Q-feber, som er forbundet med SEvere udbrud med en deraf følgende sundhedsmæssige og økonomiske byrder. Den obligat intracellulære karakter af denne patogen har, indtil for nylig, alvorligt hæmmet identifikationen af bakterielle faktorer involveret i vært patogen interaktioner, hvilket gør af Coxiella den ideelle model for gennemførelse af high-throughput / højt indhold tilgange.
Introduction
Den spirende, endemiske bakterie Coxiella burnetii er ansvarlig for store udbrud af Q-feber, en invaliderende influenzalignende zoonose med alvorlige sundheds- og økonomiske konsekvenser 1. De vigtigste reservoirer af Coxiella er indenlandske og husdyr, og det anslås, at mere end 90% af malkekvæg i USA bærer C. burnetii 2. Mennesker er tilfældige værter, der er smittet ved indånding af forurenede aerosoler. Menneskelig Q-feber manifesterer enten som en akut eller kronisk sygdom, som kan have fatale komplikationer med en dødelighed nåede 65% 1,3. Med en infektiøs dosis på 1 - 10 organismer, Coxiella er den mest infektiøse patogen kendes, og det er blevet undersøgt som en potentiel bio våben 4. Den nylige eksplosive udbrud af Q-feber i Nederlandene (2007 - 2010), med sager eskalerende fra 182 til mere end 2.000 året, står som et eksempel på den alvorlige virulens af dette patogen5.
Den bemærkelsesværdige effektivitet Coxiella infektioner er sandsynligvis forbundet med dets resistens over for miljømæssig stress, kombineret med sin unikke tilpasning til værtsceller. Faktisk Coxiella er til stede i miljøet i form af metabolisk inaktive små celle-varianter (SCV), som er bemærkelsesværdigt modstandsdygtigt over for flere barske betingelser (udtørring, temperatur, etc.). Olieudtag er op taget af fagocytiske celler via α V β 3 integriner 6 mens invasion af ikke-fagocytiske celler medieres af Coxiella adhæsion / invasion OmpA 7 og en endnu uidentificeret receptor. Efter optagelse, Coxiella bosat i tætsiddende vakuoler, positive for de tidlige endosomale markører Rab5 og EEA1 8. Bakterier reagere på endosomal forsuring ved at konvertere til metabolisk aktive store celle varianter (lette erhvervskøretøjer) og aktivere en Dot / Icm type 4 sekretionssystem (T4SS) 9, Stærkt homolog med den for Legionella pneumophila 10. Udskillelsen af Dot / integrerede dyrkningsmetoder effektorer tillader Coxiella at generere et stort, LAMP1-positive sure rum indeholdende aktive lysosomale enzymer, hvor bakterier kan trives og aktivt beskytte inficerede celler fra apoptose 11. Derfor er den intracellulære cyklus af Coxiella kontrolleres af Dot / Icm-medieret translokation af bakterielle effektorer 12 imidlertid de mikrobielle faktorer involveret i værtscelle invasion, bakteriel replikation og udbredelse af infektionen forbliver stort set ukendt.
Kombinere transposon mutagenese og fluorescens-baserede assays, udvikler vi uvildige metoder til samtidig identifikation af bakterielle faktorer involveret i de vigtigste trin af Coxiella infektioner: 1) internalisering inden værtsceller, 2) intracellulær replikation, 3) celle-til-celle-spredning og 4) vedholdenhed. Til dato har vi screenet over 1.000 mutations i 500 Coxiella kodende sekvenser, som gav os med hidtil usete indblik i værten-patogen interaktioner, der regulerer Coxiella patogenese 7. Af note, kan denne fremgangsmåde anvendes til studiet af andre intracellulære patogener, der deler cellebiologiske funktioner med Coxiella.
Protocol
1. Dannelse af et bibliotek af GFP-mærkede Coxiella transposon mutanter
Manipulere Coxiella burnetii RSA439 NMII i et biosikkerhed indeslutningsniveau 2 (BSL-2) i en mikrobiel sikkerhed kabinet (MSC) i overensstemmelse med lokale regler. Hvis kompatibel med den bakterielle anvendte model, at gentage trin fra 1.4.1 til 1.4.4 øge sandsynligheden for at opnå klonale mutanter. En typisk mutantbibliotek er sammensat (mindst) af et antal mutanter, der er lig med tre gange antallet af kodende sekvenser kommenteret i genomet af den organisme, der anvendes.
- Udarbejdelse af elektrokompetente Coxiella RSA439 NMII:
- Forbered 1x ACCM-2 13: 13.4 mM citronsyre, 16,1 mM natriumcitrat, 3,67 mM kaliumphosphat, 1 mM magnesiumchlorid, 0,02 mM calciumchlorid, 0,01 mM jernsulfat, 125,4 mM natriumchlorid, 1,5 mM L-cystein, 0,1 g / L Bacto Neopeptone, 2,5 g / l casaminosyrer, 1 g / l methyl-beta-cyclodextrin, 125 ml / l RPMI. Juster pH til 4,75 og filter sterilisere (må ikke autoklaveres). Bemærk: Flydende ACCM-2 er stabil ved 4 ° C i ca. 1 måned.
- Pode 100 ml ACCM-2 med 2 x 10 6 genomækvivalent (GE) / ml Coxiella RSA439 NMII (fra en bakteriel bestand tidligere dannet og kvantificeres som i trin 1.5) fra -80 ° C lagre og distribuere den bakterielle suspension i 75 cm2 celledyrkningskolber med ventilerede hætter (10 - 15 ml bakteriesuspension pr kolbe). Vokse i 7 dage ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 og 2,5% O2.
- Samle de resulterende bakteriesuspension i 50 ml rør og centrifugeres ved 3.900 xg i 1 time ved 4 ° C.
- Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 30 ml 10% glycerol. Centrifuger ved 3.900 xg i 1 time ved 4 ° C.
- Pellet resuspenderes i et passende volumen af 10% glycerol (typisk 2 ml) og 50 pi alikvot i 500 rør pi. Hold resuspenderet bacteria på is under hele processen. Bemærk: I denne fase, bakterier er elektrokompetente og en alikvot er tilstrækkeligt til at udføre en elektroporering. De bakterielle suspensioner kan opbevares ved -80 ° C i 6 måneder eller anvendes direkte til elektroporering af plasmid-DNA.
- Elektroporation af kompetent Coxiella med transposon- og transposasesekvenser-koder plasmider:
Bemærk: for følgende protokol, er det transposerbare element og transposasen kodet af to forskellige plasmider (pITR-CAT-GFP og pUC19-Himar1C9 henholdsvis) 7. Begge plasmider mangler en Coxiella-specifik replikationsstartsted, hvilket gør dem selvmord plasmider når elektroporeret i Coxiella. Dette sikrer stabile transposoninsertioner. Den transposerbart element indeholder en Chloramphenicol modstand kassette under regulering af Coxiella promotor p1169 for udvælgelse og GFP-genet under regulering af Coxiella promotor P311 at mærke de genererede mutanter med GFP.- Pre-køle en 0,1 cm elektroporeringskuvette i 10 minutter på is. Bland 50 pi elektrokompetente Coxiella med 10 ug plasmid transposon og 10 ug transposase plasmid 7. Sikre, at plasmid koncentration er højere end 500 pg / ml for at minimere fortynding af glycerol.
- Elektroporere at bruge følgende opsætning: 18 kV, 500 Ω, 25 uF. Sørg for, at den resulterende tidskonstant er mellem 9 og 13 msek.
- Tilføje straks 950 pi RPMI, resuspendere elektroporerede bakterier og overføre til et skruelåg rør og holde ved stuetemperatur.
- Tag 200 pi af de elektroporerede bakterier og føje til 3 ml ACCM-2 suppleret med 1% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) i 6-brønds plader. Tilføj 88 pi DMSO til den resterende mængde af elektroporerede bakterier (for at nå frem til en endelig koncentration på 10% DMSO) og opbevares ved -80 ° C.
- Udvælgelse af de transposonbaserede mutanter:
- Incubate de 6-brønds plader inokuleret som beskrevet ovenfor (1.2.4) natten over ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 og 2,5% O2. Tilsæt de passende antibiotika (375 ug / ml kanamycin eller 3 ug / ml chloramphenicol). Inkubér bakteriekulturen i yderligere 3 dage i de ovenfor beskrevne betingelser.
- Isolering af individuelle mutanter:
- Forberedelse af faste ACCM-2 plader og plettering af Coxiella transposonsekvenser mutanter
Bemærk: Følgende instruktioner er for 1 petriskål, flere fortyndinger af bakteriekulturer skal testes for at vurdere den optimale podning lydstyrken for koloni isolation.- Varm 10,5 ml 0,5% agarose i en mikrobølgeovn og lad den køle i et 55 ° C vandbad. Varm 11,25 ml 2x ACCM-2 (pH 4,75) ved 37 ° C.
- Forbered nederste agarose:
- Bland 10 ml smeltet 0,5% agarose med 10 ml 2x ACCM-2 og tilføjer de passende antibiotika (375 ug / ml kanamycin eller 3ug / ml chloramphenicol).
- Hæld straks ind petriskålen. Hold petriskålen unlidded, lad mediet afkøles i 30 minutter og lufttørre i 20 minutter.
- Forbered topagarose:
- Bland 1,25 ml 2x ACCM-2 med 0,75 ml vand i et 5 ml polystyrenrør, tilføje de passende antibiotika (375 ug / ml kanamycin eller 3 ug / ml chloramphenicol) og inkuberes ved 37 ° C.
- Tilføj bakteriekulturen (typisk 1 til 100 pi) og vortex i 5 sek.
- Tilføj 0,5 ml smeltet agarose, bland og straks hældes på bunden agarose.
- Lad det køle af i 20 min, udskifte låget på petriskålen og inkuberes ved 4 ° C i 20 minutter for at lette agarose størkning.
- Lufttørre i 20 min unlidded i en MSC. Grow plader ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 og 2,5% O2 i 6 til 7 dage.
- Tilføj DMSO til de resterende bakterierl kulturer med henblik på at nå til en endelig koncentration på 10% DMSO og opbevares ved -80 ° C.
- Vurdere den optimale fortynding som følger: at sikre, at kolonier er 0,5-1 mm i diameter og er ordentligt isolerede for at undgå krydskontaminering. Tø resterende bakteriekulturer fra punkt 1.4.2 og plade på et passende fortynding på ACCM-2 agar, som beskrevet i 1.4.1.2 og 1.4.1.3. Inkuberes i 6 til 7 dage som beskrevet i 1.4.1.3.5.
- Når kolonier kan påvises, samle dem ved at skære enden af en 1 ml spids, picking proppen indeholdende isolerede kolonier og dispergering kolonien ved pipettering i 1,5 ml ACCM-2 indeholdende de passende antibiotika (375 ug / ml kanamycin eller 3 ug / ml chloramphenicol) i en plade med 24 brønde. Forstærk enkelte kolonier i 6 dage i de forhold, der er beskrevet i 1.3.1. På dag 3 i inkubationen sprede bakterielle klumper ved pipettering hver kultur.
- Opbevar hver mutant suspension i 2D barcoded screwcap rør i 96-brønds plader i 10% DMSO ved -80 ° C.
- Forberedelse af faste ACCM-2 plader og plettering af Coxiella transposonsekvenser mutanter
- Evaluering af bakteriel koncentration:
Bemærk: Der kan anvendes følgende protokol for at opnå de vækstkurver bakterielle mutanter replikerer i axenisk medium (se 1.4.4).- Standard kurve forberedelse:
- En 2 ug / ml stamopløsning af dsDNA (typisk en tilfældig plasmid med kendt størrelse og koncentration) i 1x Tris-EDTA (TE). Forbered 10 gange serielle fortyndinger fra stamopløsningen for at opnå koncentrationer i området fra 2 ug / ml til 2 ng / ml. Dispensere 50 pi af hver koncentration til enkelte brønde i en 96-brønds mikroplade med sorte vægge og bund (se tabel of Materials).
- Fortynd dsDNA kvantificering reagens 1: 200 i 1 x TE-buffer, og der tilsættes 55 pi af den fortyndede reagens til hver prøve i 96-brønds mikroplade. Bland godt ved hjælp af en pladeryster og inkuber i 2 til 5 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Mål prøver fluorescens under anvendelse af en fluorescerernce mikropladeaflæser og filtre til standard fluorescein bølgelængder (excitation ~ 480 nm, emission ~ 520 nm).
- Plot plasmidet koncentrationsinterval mod fluorescens intensitet aflæsninger.
- Bakteriesuspension kvantificering:
- Dispensere 5 pi 10% Triton X-100 per brønd i en 96-brønds mikroplade med sorte vægge og bund (se tabel of Materials). Der tilsættes 50 ul af de bakterielle suspensioner til hver brønd og inkuberes 10 minutter ved stuetemperatur, på en pladeryster.
- Fortynd dsDNA kvantificering reagens 1: 200 i 1 x TE-buffer, og der tilsættes 55 pi af den fortyndede reagens til hver prøve i 96-brønds mikroplade. Bland godt ved hjælp af en pladeryster og inkuber i 2 til 5 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Mål prøver fluorescens under anvendelse af en fluorescens-mikropladelæser og filtre for standard fluorescein- bølgelængder (excitation ~ 480 nm, emission ~ 520 nm).
- At opnå den bakterielle DNEn koncentration, plotte fluorescens aflæsninger i skemaet fås ved henvendelse til punkt 1.5.1.4. Opdele DNA-koncentration ved massen af Coxiella genom (2,2 fg) for at opnå bakterielle koncentrationer. Udtrykke resultater i genomækvivalent / ml.
- Udsmid mutanter udviser en betydelig vækst defekt i ACCM-2.
- Standard kurve forberedelse:
2. Single Primer Colony PCR, sekventering, og Annotation
Bemærk: Den følgende protokol er for DNA amplifikation af 96 prøver, er en multikanalpipette anbefales til de følgende trin. Kolonne oprensning af PCR-produkter ved hjælp af magnetiske perler og DNA-sekventering med et transposon-specifik primer (2.3) er givet i underentreprise til en ekstern virksomhed.
- Sikre, at amplificeringsprimeren er udformet med henblik på at hybridisere mellem 100 og 200 basepar opstrøms for den omvendte tandem repeat (ITR), til opnåelse af PCR-produkter, der dækker transposon insertion site på Coxiellet genom. Forbered 3 ml PCR-blanding (1x high fidelity-puffer, 200 uM dNTP'er, 1 uM amplifikationsprimer, 20 U / ml high fidelity DNA-polymerase) og dispensere 29 pi per brønd i en 96-brønds PCR-plade indstillet på is. Overføres 1 pi af hver mutant i stationær fase i ACCM-2 til PCR-blandingen.
- Kør PCR med initial denaturering (98 ° C, 1 min), 20 højstringente cykler (98 ° C, 10 sek, 50 ° C, 30 sek, 72 ° C, 90 sek), 30 lavstringente cykler (98 ° C, 10 sek; 30 ° C, 30 sekunder; 72 ° C, 90 sek) og 30 høj stringens cykler (98 ° C, 10sek, 50 ° C, 30 sek; 72 ° C, 90 sek) efterfulgt af en endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min.
- Oprense PCR-produkter under anvendelse af magnetiske perler og sekvens-DNA med et transposon-specifik primer. Designe transposon-specifik primer med en forudsagt smeltetemperatur mellem 50 ° C og 75 ° C, et GC-indhold mellem 40% og 60%, en længde mellem 18 og 25 nukleotider og en annealing site nedstrøms for amplificeringsprimeren hybridiseringssitet og mindst 100 basepar opstrøms for det første basepar af transposonet ITR.
- Ved hjælp af sekvensanalyse-software, indlæse komplet, kommenteret genom Coxiella burnetii 493 NMI. Brug funktionen "tilpasse til reference" for at indlæse og tilpasse (BLASTN) sekventeringsresultaterne og bestemme stedet for gennemførelsen. Kassér mutanter med ikke-matching og / eller visning dobbelt reads.To overvåge mætning af mutantbibliotek, registrere forekomsten af flere transposoninsertioner på samme sted.
3. eukaryote celler Udfordring med Coxiella Mutanter og overvågning af Intracellulær vækst
Bemærk: En multikanalpipette anbefales til de følgende trin. Infektioner blev udført i triplikater i sterilt mikroplader med 96 brønde med sorte vægge og flad transparent bund. wt Coxiella burnetii udtrykker GFP 14 wsom fastsat af Dr. Robert Heinzen.
- Grow Vero-celler i RPMI uden phenolrødt suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) i fravær af antibiotika (komplet RPMI-medie).
- Dagen før infektion, vask Vero-celler fra en konfluerende eller sub-sammenflydende cellekultur kolbe med 10 ml PBS.
- Frigør Vero-celler ved at tilsætte 1 ml trypsin EDTA-opløsning til cellekulturen kolbe og inkuberes i 3 til 5 minutter ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2.
- Resuspender cellerne i 10 ml komplet RPMI-medium. Tæl celler og fremstille en cellesuspension af 10 5 celler pr.
- Dispenseres 100 pi af cellesuspensionen i hver brønd på en sort plade med 96 brønde med flad bund transparent.
- Centrifuger i 5 minutter ved 400 xg ved stuetemperatur for at lette celleadhæsion i bunden af brøndene og inkuberes natten over ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2.
- Optø plader med 96 brønde indeholdende Coxiella mutanter ved stuetemperatur, og der fortyndes 150 pi bakteriesuspension i 300 pi RPMI uden phenolrødt og FBS i en dyb brønd 96-brønds plade.
- Fjern medier fra mikropladen indeholdende Vero-celler og dispenseres 100 ul / brønd af fortyndede Coxiella mutanter (MOI på 100). Bruge brønd A1 som negative (ikke-inficerede celler) kontrol- og brønde A2 og A3 som positive kontroller (celler inficeret med wt Coxiella udtrykker GFP 14 ved mangfoldigheder af infektioner (MOI) på 100 og 200).
- Centrifugeres pladen i 10 minutter ved 400 xg ved stuetemperatur under anvendelse af en aerosol-tæt centrifuge pladeholderen.
- Der inkuberes ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 i 2 timer derefter erstatte bakterier medium med 100 pl / brønd af frisk, komplet RPMI-medium.
- Mål GFP-fluorescens hverdagen i 7 dage ved hjælp af en fluorescens-mikropladelæser og filtre til standard fluorescein bølgelængder (excitation ~ 480 nm, emission ~ 520 nm). At undgåinterferens på grund af kondensation og signal dispersion i dyrkningsmediet, brug bunden excitation og emission optagelse på mikropladelæser.
4. Fremstilling af prøver til Automated Image Acquisition
Bemærk: Denne procedure er for en 96-brønds plade, opskalere volumener i overensstemmelse hermed. Skridt fra 4.2 kan drage fordel af en pladevasker.
- Den 7. dag efter infektion, fjern medium fra pladen og erstatte det med 50 pl / brønd af frisk, komplet medium indeholdende en celle permeabel fluorescerende farvestof på et passende fortynding (sædvanligvis 1: 1.000, skal optimeres i overensstemmelse med den anvendte cellelinie ). Inkuber celler til 30-60 minutter ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2.
- Erstat medium med 50 pl / brønd af 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) og fjern derefter PFA-holdige buffer og vask 3 gange med PBS.
- Fjern PBS og dispense 50 pl / brønd af blokerende opløsning (0,5% bovint serumalbumin, 50 mM NH4CI i PBS, pH 7,4) suppleret med 0,05% saponin. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Erstat blokerende opløsning med 40 pl / brønd af frisk blokeringsopløsning suppleret med saponin (som ovenfor), og med et anti-LAMP1 antistof ved en 1: 500 fortynding. Inkuber pladen i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Fjerne blokerende opløsning og vask 96-brønds plade 5 gange med 100 pl / brønd PBS.
- Dispensere 40 pl / brønd blokeringsopløsning suppleret med saponin (som ovenfor), det passende fluorescensmærket sekundært antistof (i en fortynding på 1: 1.000) for at afsløre det anti-LAMP1 antistof anvendt i trin 4.4, og med Hoechst 33258 ved 5 ug / ml. Inkuber pladen i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Fjerne blokerende opløsning og vask 96-brønds plade 5 gange med 100 pl / brønd PBS. Forlade volumen af PBS svarende til det sidste vask i 96-brønds plade, som de fikserede celler ikke skal tørre ud.
- Billede straks pladen eller opbevares plade ved 4 ° C, beskyttet mod lys, til efterfølgende analyse.
5. Image Acquisition
- Anskaf billeder i GFP (488 nm, bakterier), Hoechst 33258 (350 nm, værtscelle kerner), rød (~ 555 nm, cellemembran markør), og langt rød (~ 615 nm, LAMP1) kanaler ved hjælp af et epifluorescens automatiseret mikroskop udstyret med en 20X objektiv. Erhverve 21 uafhængige felter per brønd for at afbilde et minimum af 5000 celler pr prøve. Påfør autofokusering hjælp værtscellen kerner kanal som reference. Ved arbejde med bakterielle patogener inficerer en lav procentdel af værtsceller, kan brugerne justere antallet af uafhængige felter afbildet per brønd, for at opnå et minimum af 500 inficerede celler at analysere.
6. Image Processing
Bemærk: de følgende trin er specifikke for brugen af billedet analyse software CellProfiler. I alle tilfælde den optimale algorithm for segmentering skal defineres eksperimentelt og objekterne rører grænsen af billedet skal fjernes med den relevante funktion.
- Indlæs alle billeder i CellProfiler.
- Brug modulet "ImageMath" for at trække GFP kanal fra Hoechst-kanalen, for at undgå at blive opdaget af Coxiella kolonier (også mærket af Hoechst) som vært cellekerner i de følgende trin.
- Brug modulet "IdentifyPrimaryObjects" til segment host cellekerner fra det resulterende billede i trin 6.2. Navngiv segmenterede objekter "kerner".
- Brug modulet "IdentifySecondaryObjects" til segment værtsceller fra 555 nm billeder ved hjælp kernerne detekteret ved trin 6.3 som frø. Navngiv segmenterede objekter "celler".
- (Valgfrit) Brug modulet "IdentifyTertiaryObjects" for at trække kerner identificeret i trin 6.3 fra celler, identificeret ved trin 6.4. Navngiv segmenterede objekter "Cytoplasma221 ;.
- Brug modulet "EnhanceOrSuppressFeatures" på de 615 nm billeder til at fjerne baggrunden og fremme følgende identifikation af LAMP1-positive rum.
- Brug modulet "IdentifyPrimaryObjects" på billedet opnået i trin 6.6 til at identificere LAMP1-positive rum. Navngiv segmenterede objekter "Lysosomer".
- Brug modulet "IdentifyPrimaryObjects" på 488 nm billedet for at identificere Coxiella kolonier. Navngiv segmenterede objekter "Colonies".
- Brug modulet "IdentifySecondaryObjects" på de 615 nm billeder for at identificere Coxiella-holdige vakuoler hjælp af Coxiella kolonier detekteret ved trin 6.8 som frø. Navngiv segmenterede objekter "CCVs".
- Brug modulet "MaskObjects" for at vælge CCVs detekteret på celler (som celler rører grænsen af billedet er blevet fjernet, kan nogle CCVs påvises "uden for" celler). Navngiv resulting objekter "Filtreret CCVs".
- Brug modulet "MaskObjects" for at vælge Kolonier detekteret på celler (som celler rører grænsen af billedet er blevet fjernet, kan nogle Kolonier påvises "uden for" celler). Navngiv de resulterende objekter "Filtreret Colonies".
- Brug modulet "MaskObjects" at knytte Lysosomer til celler. Navngiv de resulterende objekter "Filtreret lysosomer".
- Brug modulet "MaskObjects" for at vælge celler, der indeholder Coxiella kolonier. Navngiv de resulterende objekter "inficerede celler".
- Brug modulet "Relatere objekter" for at indstille objekter "Filtreret CCVs" som børn af de forældre objekter "celler". Dette vil gøre det muligt at tælle antallet af CCVs / Cell.
- Brug modulet "Relatere objekter" for at indstille objekter "Filtreret Colonies" som børn af de forældre objekter "celler". Dette viltillade at tælle antallet af kolonier / Cell.
- Brug modulet "Relatere Objects" for at indstille de objekter "Filtreret lysosomer" som børn af de forældre objekter "celler". Dette vil gøre det muligt at tælle antallet af Lysosomer / Cell.
- Brug modulet "MeasureObjectSizeShape" for at opnå en morfologisk analyse af kerner, Cells, filtreret CCVs, filtreret Kolonier og filtreret Lysosomer
- Brug modulet "MeasureObjectIntensity" at kvantificere GFP-fluorescens forbundet med Filtreret CCVs og estimere effektiviteten af Coxiella replikering inden CCVs.
- Brug af moduler "OverlayOutlines" og "SaveImages" overlay de segmentering resultater og det originale billede til kvalitetskontrol.
- Brug modulet "ExportToSpreadsheet" for at eksportere alle eller et udvalg af resultater af billedanalyse.
- (Valgfrit) Brug modulet "ExportToDatabase" for at analysere resultaterved hjælp af softwaren CellProfiler Analyst.
7. Data Analysis
- For opnået hver parameter, identificere og fjerne outliers (på grund af fejl i billedet segmentering) derefter beregne middelværdierne pr mutant.
- Brug Z-scores til at identificere væsentlige fænotyper. Overvej fænotyper med en Z-score> -2 som ikke-signifikant, Fænotypers med en Z-score mellem -2 og -4 som mild og fænotyper med en Z-score ≤ -4 så stærk.
- Plot kombinationer af parametre efter eksperimentelle behov.
Representative Results
Efter isolering af transposon mutanter, enkelt primer koloni-PCR er en robust, high-throughput metode til at identificere stedet for transposon insertion for hver mutant. Denne fremgangsmåde følger af en typisk nested PCR-protokol, men her en enkelt primer hybridiserer specifikt og / eller ikke-specifikt til template-DNA afhængigt af stringensen af annealing temperatur (figur 1A). De typiske PCR-produkter består af flere DNA-fragmenter, hvoraf de fleste er specifikke (figur 1b). Anvendelsen af en anden sekventeringsprimer der annealer højre opstrøms for transposon ITR, og nedstrøms for den sekvens, der genkendes af amplificeringsprimeren tilvejebringer specificitet for sekventering trin (figur 1C). Automatiseret software til sekvensanalyse justerer de opnåede sekvenser til Coxiella genom levere præcise sted for transposoninsertioner (figur 1C). Alle transposoninsertioner kan være så annotated på Coxiella genom (figur 1D).
Hver Coxiella mutant isoleres og amplificeres axenisk i ACCM-2 medium før enten lagring eller screening. Figur 2 illustrerer et eksempel på 38 transposon mutanter i 16 punkter / ICM Coxiella gener (figur 2A). For at vurdere levedygtigheden af Coxiella mutanter, der axeniske vækstkurver opnået ved prøveudtagning bakteriekulturer i 7 dage efter inokulering og anvende den bakterielle koncentration assayet beskrevet i 1.5 (Figurie 2B). Amplificerede mutanter inkuberes derefter med epitelceller, i tredobbelte plader med 96 brønde i 7 dage. Alle Coxiella frembragte mutanter bliver GFP-mærket, er intracellulære vækstkurver opnået ved måling af GFP-fluorescens intensiteten af hver brønd, hver 24 timer, og plotte de målte værdier som en funktion af tid (figur 2C).
Intracellulære vækstkurver give kvantitative analyse af de fænotyper, der er forbundet med hvert transposon insertion i Coxiella genomet. For at tilføje kvalitative oplysninger om de samme transposonsekvenser mutanter, vi valgt indsamling og analyse automatiseret billede. Syv dage efter infektion, plader er faste, forarbejdet til immunfluorescens som beskrevet i 4 og analyseret ved hjælp af en automatiseret, epifluorescensmikroskop som beskrevet i 5. Automatiseret billedanalyse software som CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.com ) behandler de tilkøbte kanaler selvstændigt og segmenter identificeres objekter for sammenlignende analyse (figur 3). Dette muliggør identifikation og morfologiske karakterisering af værtscellelinier kerner, celle konturer, lysosomer og Coxiella kolonier (figur 3 øverste paneler). Korrelering Coxiella kolonier med celler og lysosomer tillader identifikatom og specifik morfologisk analyse af Coxiella holdige vakuoler (som er LAMP1 positiv, figur 3 nederste venstre panel). Korrelering Coxiella kolonier med værtscelle konturer muliggør identifikation og specifik morfologisk analyse af inficerede celler (figur 3 nederst i midten panel). Endelig er de 4 kanaler fusioneret til illustration og kvalitetskontrol (figur 3 nederste højre panel).
Data fra automatiseret billedanalyse kan plottes mod hinanden for at opnå "flere fænotypiske scatter plots". Som et eksempel er i figur 4A det gennemsnitlige areal (i um 2) af Coxiella kolonier plottet mod antallet af kolonier per celle (Figur 4A), for at identificere mutationer, der påvirker intracellulær replikation af Coxiella (replikationsfænotype) og / eller evne bakterier at invadere værtsceller (internalization fænotype). Statistisk analyse blev anvendt til at definere regionerne i den resulterende scatter plot svarende til milde (-4 <Z-score ≤ -2) og svær (Z-score ≤ -4) fænotyper. Mutanter blev observeret i 3 hovedgrupper: mutationer, der resulterede i et defekt intracellulær vækst i Coxiella blev grupperet i venstre meste af plottet (figur 4A, pink og røde prikker); mutationer, der er ramt Coxiella internalisering i celler blev grupperet i den nederste del af plottet (figur 4A, lys og mørk blå prikker) og endelig, grønne prikker i højre mest region af plottet svarer til mutationer resulterer i ikke-signifikante fænotyper ( Z-score> -2). Vigtigt er det, mutanter, der ikke replikere, men er stadig i stand til at invadere værtsceller, detekteres efter 7 dages infektion som enkelte bakterier eller små kolonier, der støder op til vært cellekerner (figur 4C, andet panel). Dermed størrelsen af Coxiella "coloselskaber "vil blive væsentligt påvirket, men antallet af inficerede celler vil ikke variere i forhold til WT Coxiella inficerede celler. Tværtimod mutationer, der påvirker evnen af Coxiella at invadere værtsceller resultere i et fald i antallet af kolonier / celle. Når dette antal er væsentligt under 1, betyder det, at i gennemsnit er der et fald i det samlede antal inficerede celler. Alternativt kan den gennemsnitlige areal (i um 2) af Coxiella kolonier afsættes mod antallet af værtsceller overlever infektion (figur 4B), til at identificere mutationer, som bibringer cytotoksicitet til Coxiella (cytotoksisk fænotype). Som ovenfor blev statistisk analyse anvendes til at definere regionerne i den resulterende scatter plot svarende til milde (-4 <Z-score ≤ -2) og svær (Z-score ≤ -4) fænotyper. Mest screenet mutationer påvirkede ikke signifikant celleoverlevelse uanset bakteriel replikation inden værtceller (figur 3B grønne prikker). 37 mutationer mildt påvirkede værtscelle overlevelse (figur 3B, lette røde prikker) og 7 mutationer var særligt skadelige for vært celleoverlevelse (figur 3B, mørke røde prikker). Bemærk, at yderligere parametre opnået ved automatiseret billedanalyse procedure kan anvendes til at udlede andre diagrammer, ifølge eksperimentelle behov.
Figur 1:. Sekventering og annotation af Coxiella transposon mutanter (A) Single primer koloni-PCR anvendes til at opformere DNA-fragmenter indeholdende det sted transposon insertion. En amplifikation primer (Amp) anvendes både som en specifik og ikke-specifik primer afhængigt af stringensen af annealing temperatur. (B) Typisk resultat af enkelt primer koloni-PCR. Hver Reactipå producerer en række fragmenter af forskellig størrelse, hvoraf nogle indeholder transposonet indsættelsesstedet; nogle andre er tilfældigt amplificeret som biprodukter af lav stringens PCR-cyklus. (C) Anvendelsen af en sekventeringsprimer (Seq), der hybridiserer til transposon-sekvensen tillader sekventering af fragmenterne af interesse. (D) Sekvensanalyse software gør det muligt automatisk annotation af transposoninsertioner på bakterielle genom. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Axeniske og intracellulær vækst Coxiella transposonsekvenser mutanter (A) I pilot skærmen har vi isoleret, sekventeret og screenet 38 transposonsekvenser mutanter i 16 core gener af Coxiella dot / ICM sekretionssystem (angivet med rødt). (B) For at vurdere levedygtigheden af hvert transposon mutant, væksten af hvert isolat i axenisk dyrkningsmedium overvåges over 8 dage ved anvendelse af en fluorescens-mærkede DNA-interkalerende middel. (C) Hver mutant anvendes derefter til at inficere epithelceller. Som transposonen besidder en GFP-kassette, er intracellulær bakterievækst overvåget over 7 dage infektion ved at følge variationer af GFP-fluorescens forbundet med Coxiella replikering, ved hjælp af en mikropladelæser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Automatiseret billedanalyse af Coxiella infektioner En automatisk.parret epifluorescensmikroskop bruges til billedet 21 positioner per brønd af tredobbelte plader med 96 brønde. De billedanalyse software segmenter objekter i hver erhvervede kanaler til kvantificering og analyse. I alle tilfælde er objekter rører grænsen af billederne udelukket. (A) Hoechst kanal anvendes til at identificere host cellekerner (i cirkel med grønt). (B) Disse bruges som frø til at identificere værtscelleproteiner konturer i Cy3 kanal (positionen af kerner er omgivet i blå, celle konturer med grønt). (C) The Cy5-kanalen anvendes til at identificere LAMP1-positive rum (i cirkel med grønt); kun de objekter, der indgår i de tidligere identificerede celle konturer (i rødt) tilbage til billedanalyse. (D) Den GFP kanal anvendes til at identificere Coxiella kolonier (i cirkel med grønt). (E) Korrelere Coxiella kolonier med LAMP1-positive rum tillader identifikation af Coxiella (F) Korrelere Coxiella kolonier med celle konturer tillader identifikation af inficerede celler (pseudocolored). (G) Billeder erhvervet i de 4 fluorescens kanaler (svarende til Coxiella kolonier (grøn), host cellekerner (blå), værtscelle plasmamembranen (grå), LAMP1-positive rum (rød)) er slået sammen og anvendes til illustration og kvalitet kontrol. Scale barer 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Storstilet identifikation af Coxiella faktorer involveret i vært / patogen interagererioner. (A) Det gennemsnitlige areal (i um 2) af Coxiella kolonier er plottet mod det relative antal kolonier pr celle, til at identificere replikation og internalisering fænotyper af interesse. Grønne prikker repræsenterer fænotyper, der afviger fra WT Coxiella af en Z-score> -2 (ikke signifikant). Pink og lyseblå prikker repræsenterer replikation og internalisering fænotyper henholdsvis med en Z-score mellem -2 og -4 (milde fænotyper). Røde og mørkeblå prikker repræsenterer fænotyper med en Z-score ≤ -4 (stærke fænotyper). (B) Det gennemsnitlige areal (i um 2) af Coxiella kolonier blev plottet mod det totale antal celler (inficeret og ikke inficerede), der overlevede 7 dage infektion at estimere den cytotoksiske virkning af transposoninsertioner. Grønne prikker repræsenterer fænotyper, der afviger fra WT Coxiella af en Z-score> -2 (ikke signifikant). Lyserøde prikker repræsenterer cytotoksiske phenotypes med en Z-score mellem -2 og -4 (milde fænotyper). Røde prikker repræsenterer cytotoksiske fænotyper med en Z-score ≤ -4 (stærke fænotyper). Pile angiver mutanter illustreret ved den tilsvarende lille bogstav i C. (C) Repræsentative billeder af replikation, internalisering og cytotoksiske fænotyper. I alle tilfælde host cellekerner er i rød, Coxiella kolonier med grønt. Scale barer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Studiet af vært / patogen interaktioner har vist sig at være en bemærkelsesværdig metode til at forstå bakterielle infektioner og udvikle alternative strategier til infektionssygdomme. Men på grund af mangfoldigheden af strategier udarbejdet af forskellige bakterielle patogener, identifikation og karakterisering af bakterielle virulensfaktorer og værten signalveje, der er målrettet under infektioner udgør en reel udfordring. Det kræver udvikling af nye metoder til storstilet identifikation af centrale vært / patogen interaktion hubs. Den nylige udvikling af innovative, high-throughput og høj-indhold screeningsteknikker repræsenterer en uvurderlig ressource, der kan tilpasses til studiet af intracellulære bakterielle patogener 15. Her har vi brugt den zoonotiske bakterielt patogen Coxiella burnetii som model til at udvikle screening tilgange, der kombinerer transposon mutagenese og fluorescens assays. Importantly, denne screeningsmetode muliggør samtidig overvågning af flere trin i Coxiella intracellulære cyklus, hvilket giver et samlet overblik over strategier udviklet af denne bakterie til at invadere, replikere og persistere i inficerede celler.
Den her beskrevne fremgangsmåde er baseret på to veletablerede teknikker, transposon mutagenese og fluorescens-baserede assays, som er blevet anvendt med succes til studiet af bakterielle patogener. Kombinere disse teknikker i forbindelse med high-throughput / high-content skærme giver os mulighed for at vurdere virkningerne af et stort antal bakterielle mutationer ved at analysere et meget stort antal af hændelser (typisk 15.000 inficerede celler pr bakterielle mutationer afbildes og analyseres). Dette giver et vigtigt statistisk analyse af begivenheder, såsom bakteriel invasion af værtsceller og intracellulær replikation, som i sagens natur underlagt høj variabilitet. Det er vigtigt at bemærke, at celle bortset ep linjerithelial kan anvendes til denne type screening. Imidlertid flade og store epitelceller er optimale til billedanalyse som vært celleorganeller er lettere at afsløre. Fordi størstedelen af automatiserede mikroskoper automatisk kan håndtere et stort antal plader, der er næsten ingen grænser for antallet af mutanter, der kan screenes samtidigt. Afhængig af patogenet, kan brugeren privilegium anvendelsen af et epifluorescens eller et konfokalt mikroskop. Tidspunktet for billedregistrering vil mest afhænge af følsomheden af mikroskopet kamera, om antallet af felter, der er erhvervet pr brønd og af antallet af kanaler, der er erhvervet pr synsfelt. Brugeren kan beslutte, hvordan man justere disse faktorer for at optimere screeningsprotokol. Som et eksempel, vi afbildes en plade med 96 brønde / time ved anvendelse af betingelserne angivet i punkt 5.1. Billedanalyse afhænger i høj grad på maskinen (eller klynge af maskiner), der anvendes. Vi bruger en 12-kerne (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB RAM arbejdsstation. Denne maskine kræver indbyrdesende 40 min at analysere billeder erhvervet fra én plade.
Et vigtigt aspekt, der skal tages i betragtning ved udviklingen af disse assays er etableringen af nye (eller optimering af eksisterende) protokoller for at tillade manipulation og bearbejdning af et stort antal prøver. Et typisk eksempel er udviklingen af den enkelt primer koloni-PCR tilgang, hvilket tillod os til hurtigt at amplificere og sekvens Coxiella DNA-fragmenter indeholdende insertionsstedet af hvert transposon, fra meget små prøver. Baseret på vores erfaring, high-fidelity-polymerase skal nøje udvalgt og testet for at opnå reproducerbare resultater. Den eneste begrænsning af denne fremgangsmåde kan gemme sig i den iagttagelse, at i de fleste tilfælde, ca. 30% af de behandlede prøver ikke udnyttes, enten som følge af PCR eller sekventering trin. Men i betragtning af at isolering af nye Coxiella transposonsekvenser mutanter er ikke en hastighedsbegrænsende trin, dette ikke repræsensendt et stort problem. Ligeledes har udviklingen af en pålidelig analyse for at kvantificere den bakterielle koncentration af mutante bestande været nøglen for denne fremgangsmåde. På grund af tendensen til, Coxiella til at aggregere, når i suspension, anvendelse af absorbansaflæsningerne gælder ikke for beregning af koncentrationen af Coxiella kulturer og den eneste eksisterende alternativ var kvantitativ PCR (qPCR). Her er anvendelsen af en fluorescens-mærkede DNA interkalationsmiddel signifikant fremskyndet bakterier kvantificering.
Denne fremgangsmåde kan også drage fordel af anvendelsen af stabile cellelinjer, der udtrykker fluorescerende markører for adskillige intracellulære rum afhængigt af patogenet anvendes. Et andet vigtigt aspekt er anvendelsen af celledyrkningsmedier blottet for phenolrødt. Vi observerede, at denne pH-indikator har en naturlig fluorescens spænder over røde og grønne spektrum, mætter signalet optaget på automatiseret fluorescens-læser.
THan strategi præsenteres her bygger på tilfældige transposon mutagenese. For mutanter af interesse, anbefaler vi validere unikke gennemførelser (og klonalitet) ved hjælp af Southern blot og PCR-amplifikationer af transposon insertion site.
Udover det udstyr, der er beskrevet i protokollen afsnittet teams interesseret i at bruge screening metode præsenteres her, vil tage stor fordel i opsætningen af en relationel database for indsamling af data, en server til lagring af data og en arbejdsstation til hurtig billedanalyse.
Vigtigt er det, hvilken fremgangsmåde er beskrevet her er egnet til undersøgelse af andre intracellulære bakterielle patogener tilvejebragt en tilfældig mutagenese metode findes for patogenet, kan cellelinier blive inficeret af patogenet, og dette viser en specifik fænotype under infektion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
| Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
| Fetal bovine serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
| Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
| Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
| Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
| 96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
| 96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
| 96-well plate, deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
| PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
| Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
| Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
| Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
| Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
| Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |
References
- Maurin, M., Raoult, D. Q fever. Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).
- Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States. Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).
- Kazar, J. Coxiella burnetii. infection. Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).
- Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).
- Der Hoek, W. V. an, et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).
- Capo, C., et al. Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3. Journal of immunology. 163 (11), Baltimore, Md. 6078-6085 (1999).
- Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell. Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Newton, H. J., Mcdonough, J. a, Roy, C. R. Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole. PloS one. 8 (1), e54566 (2013).
- Vogel, J. P. Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii. Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).
- Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii. Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).
- Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. mBio. 2, (2011).
- Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium. Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).
- Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).
- Brodin, P., Christophe, T. High-content screening in infectious diseases. Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).
