Abstract
この作品は、非発光の合成を概説し、シクロメタル化イリジウム（III）錯体、IR（PPY）2（H 2 O）2ヒスチジンに配位したときに迅速な、長寿命のリン光信号を誘発+（Ir1を）、磁性粒子の表面に固定化されたタンパク質を含有します。高収率でIr1をの合成は、完全なO / Nであり、親の分割を含む溶媒和複合体の2当量にイリジウム（III）クロロ架橋二量体をシクロメタル化。 特異性を確認するために、合成されたプローブを添加した場合にいくつかのアミノ酸は、配位活性についてプローブした、唯一のヒスチジンは、信号応答を誘発しました。 BNT-II、マラリアバイオマーカーヒスチジンリッチプロテインII（pfHRP-II）の分岐鎖状ペプチド模倣を使用して、イリジウムプローブは、HRP-IIを検出するためのツールとして確認されました。 L-ヒスチジン/ Ir1をと比較した場合、消光効果はBNT-II / Ir1を滴定で認められたが、これらは立体障害及びトリに帰属し、plet状態消光。生物層干渉はBNT-IIとの相互作用のIr1をリアルタイム動態を決定しました。システムを最適化した後、プローブを使用してrcHRP-IIの検出限界は、溶液中で12.8 nMであることが見出されました。このタンパク質は、50ミクロンの磁性アガロース粒子の表面上に固定化した場合には、検出限界は14.5 nMでした。堅牢な信号この無機プローブの応答だけでなく、溶液中での使用の柔軟性や表面上に固定化は、診断での使用からの撮像に、種々の用途に向けて自分自身を貸すことができます。
Introduction
比色および蛍光標識は、生化学分子の検出と追跡のための重要な方法であり、1,2を処理します。最も一般的な蛍光マーカーは、低分子量の有機色素3,4あるが、これらの分子は、常に理想的な光学特性を有していません。蛍光色素は、多くの場合、小さなストークスシフトを有し、重複励起及び発光スペクトルを有していてもよく、光退色する傾向があります。比色標識は、多くの場合、イムノアッセイ定量5,6において有用な増幅された信号を持っている酵素標識の使用によって達成されます。これらの酵素はまた、感光性、反応条件、およびショート基板の貯蔵寿命を含む、それらの欠点を有します。これらの特性は、高価な試薬を用いて十分に制御された条件下で行われるイムノアッセイ及びタンパク質標識法を必要とする傾向があります。
発光遷移金属錯体は、FO代替標識アプローチとして検討されています生化学的検出rを。具体的には、イリジウム（III）が10、触媒11、及びタンパク質/細胞染色12-14を感知ダイオード（OLED）7-9酸素有機発光との関連で研究されているシクロメタル化。高い光と量子効率は、プローブのこのクラスの生体分子検出15,16のための良好な候補を作ります。これは、以前に、不可逆的にヒスチジンを結合して、青緑色の信号応答12,17を引き出す+形のシクロメタル化イリジウム（III）錯体、こと[2 IR（C ^ N）2（SOLV）]が見つかりました。これらの複合体はsolvento状態で非発光であるが、ヒスチジンが溶媒分子を置換し、金属中心に結合する場合、それらは長波長のUV照射後の強いリン光信号を放出します。このシグナルは、リガンドの置換の後に発生し、三重項状態の電子の結果は、金属配位子電荷移動（3 MLの活性化を介して基底状態に弛緩されCT）とリガンド中心転送（3 LC）は8,15の経路。これらの複合体は、潜在的に、ヒスチジンが豊富なタンパク質の検出用プローブとして用いることができます。
ヒスチジンに富むタンパク質およびそれらの規制値は、肝硬変、癌、および血栓性疾患を含む、多くの疾患において重要である。18熱帯熱マラリア原虫のヒスチジンリッチプロテインII（pfHRP-II）、特にマラリア原虫感染症によく検証バイオマーカーです。このタンパク質は、主に特性AHHAHHAAD繰り返しモチーフ19内に、67 kDaであり、34％のヒスチジンが含まれています。これらのヒスチジン反復は、ホスト、血液中の遊離金属イオン19とヘム複合体20を結合することができます。 pfHRP-IIは、一般的に免疫クロマトグラフィ迅速診断テスト（RDTs）を用いた低リソースの設定で検出されましたが、これらのテストが原因サンプル条件、低バイオマーカー濃度、貧しい製造基準、および抗体の劣化21にしばしば不正確です。
[IR（PPY）2（H 2 O）2] +（Ir1を）の使用は、pfHRP-IIの分岐鎖状ペプチド模倣は、22を検討しています。この相互作用の速度論は、生物層の干渉技術を使用してリアルタイムでモニターしました。アッセイは、検出のナノモル限界が達成された上でビーズELISA型のフォーマットに適合させました。それは代わりに4-5時間、典型的なELISAを用いて、必要な生物学的試薬の、抗体を含まない試薬を用いて、2時間未満で行うことができるので、このアッセイは、伝統的なELISA法を超える利点を保持しています。
Protocol
イリジウムの1の合成（III）錯体
- [2 -ClのIr（PPY）] 2の 53.6 mgの（50マイクロモル）を秤量し、塩化メチレン5mlに溶解します。撹拌棒を備えた50mlの三角フラスコにこの溶液を加えます。
- AgOTfの26.2 mgの（100マイクロモル）を秤量し、メタノール5mlに溶解します。
- 溶解にAgOTf [IR（PPY）2 -Cl] 2溶液を添加し、1時間撹拌します。
注：クリーム色のスラリーが生じるはずです。 - 1時間後、25×95ミリメートルのドラムバイアルにシリカゲルを通してスラリーをフィルタリングし、ロータリーエバポレーター（5~10分）を使用して残りの溶媒を蒸発させます。
- 溶媒の大部分が除去されると、油状の黄色の残留物をバイアル中に残っていることを確認します。この残渣に、製品を再溶解し、黄色の固体生成物を得た1-2日間凍結乾燥するメタノール1mlを追加。
- <HによってIR（PPY）2（H 2 O）2 +製品（Ir1を）を特徴づけますSUP> 1 NMR、ESI及び紫外-可視（CDCl 3中）前述のように23
様々なアミノ酸とIr1を2.相互作用
- メタノール中Ir1を2 mM溶液（MW 537.10グラム/モル）を準備します。固体の完全な溶解を確実にするために渦。
- 準備HEPESで、次のアミノ酸及び生体分子の100μMのソリューションは、生理食塩水（HBS、100mMのHEPES、137mMのNaClを、pH7.4）でのAla、Aspの、Cysを、彼の、イル、リジン、セリン、試してみてください、ヴァルをバッファリング。
- ピペット黒色96ウェルプレートに各アミノ酸を100μl。ブランクとして機能するようにプレートにHBSの100μlを添加します。
- 各サンプルに2 mMのIr1を溶液の2.5μLを加え、10分間プレートシェーカー上でプレートを横に振ります。
- 10分後、96ウェルプレートリーダー（365 EX / EM 400〜700）を使用して、試料の発光スペクトルを取得します。
- 楽器でプレートを置き、新しい実験をセットアップするために、プレートリーダーソフトウェアを開きます。
- 新しいEXPを設定波長365nmの励起波長とトップの位置に光学系で9ナノメートルのスリット幅で蛍光スキャンを読み取るためのeriment。
- 5nmのステップサイズで300〜700 nmでの発光を読みます。
- データ分析のためのデータをエクスポートします。
- 透明な96ウェルプレート及び画像にUVトランスイルミネーターを使用して発光をサンプルを転送します。
BNT-IIとIr1を3.滴定
- HBS中BNT-II（MW 8233.6グラム/モル）の1mMストック溶液ならびにメタノール中Ir1を2mMの溶液を調製します。
- ストック溶液から、HBS中の100μMのBNT-IIの1ミリリットルを準備します。サンプルは混合であることを確認するためにマイクロチューブをボルテックスし。
- シリアル1.56μMBNT-IIの最終濃度になるようにHBSに半分に100μMのBNT-IIを希釈。
- HBSは96ウェルプレートのウェルに、空白となると、三連で、各希釈液100μlを追加します。各サンプルに、2 mMのIr1を2.5μlを添加します。
- SHプレートシェーカー上で10分間、プレートAKE。
- 振とう後、96ウェルプレートリーダーを用いて510nmで（365nmの励起）の発光強度を読み取ります。
- 楽器でプレートを置き、新しい実験をセットアップするために、プレートリーダーソフトウェアを開きます。
- 510ナノメートルの波長365nmおよび発光波長の励起波長と蛍光エンドポイントを読み取るための、新しい実験を設定します。トップの位置に光学系と、9nmに両方の波長用のスリット幅を設定します。
- プレートを読み、分析用のデータをエクスポートします。
- 透明な96ウェルプレート及び画像にUVトランスイルミネーターを用いて滴定を、サンプルを転送します。
生物層干渉法Ir1を/ BNT-IIシステムの4リアルタイム速度論的解析
- 黒色96ウェルプレートの最初の列の8ウェルに、プラスチックセンサーに板を挿入し、運動緩衝液200μl（0.02％のTween-20と1×リン酸緩衝生理食塩水KB）を追加しますホルダー。慎重に先端がバッファのウェル中に懸濁されるように、プラスチック製のホルダーに最初の列に8のNi（II）NTAバイオセンサーを転送します。干渉器の左側にプラスチック製のホルダーを配置します。
- KBでBNT-IIの0.5μM溶液2mlを準備します。
- KBにIr1を10μMの溶液500μlを用意し、シリアルKB単位で0.156μMまで半分に希釈します。
- 新しい黒96ウェルプレートにKBのピペット200μlの列AとCの全8ウェルに
- 同じプレートでは、列Bのウェルに0.5μMBNT-II溶液をピペットを200μl
- よくD1にブランクとしてKBで始まるピペットD列にIr1をの各希釈液200μlを、。ウェルが列ダウンIr1を濃度の増加ように希釈液を追加します。
- 事前湿潤センサーを含むプレートの右にある器具で、このプレートを置きます。
- 生体層干渉ソフトウェアでは、基本的なKINETを設定ICプレートを定義することによって、実験、分析、およびセンサチップ。
- プレートを定義するには、画面上の列を選択し、右クリックして、井戸のための適切な定義を選択します。列Dの列Bの列AとCの「バッファ」、「ロード」、および「サンプル」を選択
- （「追加」をクリックします）、次のステップを追加することで、次のタブでのアッセイを定義します。平衡化（カスタム）、60秒;読み込み中、120秒。ベースライン、60秒;協会、120秒。と解離、300秒。平衡化工程を選択し、（列B）、ベースライン（列C）、協会（列D）、および解離（列C）をロードするための列Aの繰り返しをダブルクリックします。ニッケル（II）NTAセンサーを選択します。
- 次のタブに移動し、センサーはプラスチック製のセンサホルダの列Aであることを確認。
- 実験が正しく概説されていることを確認し、ファイル名を挿入し、「遅延実験」がチェックされ、キーを押していることを確認し、「行きます。」
N注意速度実験を概説された後にプログラムとしてにより機器の自動化された性質のために、手順が発生します。
- 運動の実行が完了すると、提供処理ソフトウェアでデータを処理します。
- 左側のパネルの下部にある目的のファイル名でフォルダをダブルクリックします。次に、パネルの上部に「速度論」の下に対応するフォルダをダブルクリックします。 [処理]タブに移動します。
- センサー選択画面を開くには、左の減算ボックスにチェックを入れます。右だけでなく、A4をクリックして、リファレンスのウェルにウェルタイプを変更します。
- Y軸の位置を調整するには、次のボックスをチェックし、選択されたステップは、ベースラインであることを確認してください。ベースラインの最後の5秒（約55〜60秒）であることが時間範囲を指定します。
- インター段階補正のためのチェックボックスをオンにして、解離に整列を選択します。サビツキー·ゴーレイフィルタボックスがチェックされていることを確認し、キーを押し、「プロセスデータ！̶1;
- [Analysis]タブに移動します。 1：「協会と解離は「分析とモデルが1であることをするためのステップのための選択であることを確認してください。ローカル、フルフィットを選択し、Enterキーを押し、「フィットカーブを！」
- テーブル内のすべての曲線を強調表示し、右の色にすべてのカーブを設定する]をクリックします。次に、センサーによって色とRmaxのリンク解除によってグループ化されたグローバル（フル）フィットを、選択します。を押して「カーブにフィット！ "グローバル動態データを取得します。
5.オンビーズIr1を有するBNT-IIの検出とrcHRP-II
- 1ミリリットルをBNT-IIおよびTweenでHBSでrcHRP-IIの1μM溶液をそれぞれ準備（HBSTを、0.025％Tween 20でHBS）。
- 直列15.6 nMでの最終濃度にHBSTに半分に各タンパク質を希釈します。
- ピペット最高濃度下欄に最下位から順に希釈液の白色96ウェルプレートに三重の各希釈液100μl、、。
- 50ミクロンのNi（IIのピペット10μL）NTA磁性アガロース粒子各希釈ウェルに。
- 粒子が懸濁した滞在を保証するために、各ピペッティングした後、磁性粒子を含むマイクロチューブをボルテックスし。
- 粒子とサンプルをインキュベートし、15分間プレートシェーカー上でプレートを置きます。
- このインキュベーション期間の後、96ウェルプレートの磁石上に板を置き、粒子が溶液からの撤退をするための30秒を待ちます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、元のサンプルをやってのけるし、廃棄物として廃棄します。磁石からプレートを取り外します。
- 各ウェルマルチチャンネルピペットを使用してHBSTの200μlを添加します。磁性粒子を洗浄するには、上下に数回バッファをポンプ。
- 背面磁石の上に板を置き、粒子が溶液からの撤退をするための30秒を待ちます。
- マルチチャンネルピペットを用いて、緩衝液200μlをやってのけるし、廃棄物として廃棄します。磁石からプレートを取り外します。
- 繰り返しは5.8 througステップH 5.10 2回は、粒子の3回の洗浄を完了します。
- 2 mMのIr1を2.5μlのに続いて、各ウェルを含有する磁性粒子にHBSTの100μlを添加します。
- 1時間プレートシェーカー上Ir1を有する粒子をインキュベートします。
- 1時間後、96ウェルプレートリーダーを用いて510nmで（365nmの励起）の発光強度を読み取ります。
- 楽器でプレートを置き、新しい実験をセットアップするために、プレートリーダーソフトウェアを開きます。
- 510ナノメートルの波長365nmおよび発光波長の励起波長と蛍光エンドポイントを読み取るための、新しい実験を設定します。トップの位置に光学系で、9 nmの両波長用のスリット幅を設定します。
- プレートを読み、分析用のデータをエクスポートします。
- 透明な96ウェルプレート及び画像にUVトランスイルミネーターを用いて滴定を、サンプルを転送します。
Representative Results
図1、金属中心に不溶性のAgClの形の塩化物の沈殿による親二量体中の塩化物橋のIr1をsolvento錯体関与分裂の合成と水の分子の会合に示すように。 Ir1をの形成は、1 H NMR及びESIにより確認しました。 365 nmで励起した場合に加えて、金属配位子電荷移動の特性UV可視バンドとπ-π*遷移がさらにIr1をの形成を検証する、スペクトルに割り当てられていた。これは、複雑な展示ノー発光文字を溶媒和しません。
図1：Ir1をの合成とキャラクタリゼーションジクロロテトラキス（2-（2-ピリジニル）フェニル）二イリジウム（III）の塩化物架橋分割反応はアコ錯体Ir（PPY）2（H 2 O）2を作成します+（Ir1を）。 L-Hisの水性緩衝液中のアコ錯体に添加すると、蛍光信号がオンになっています。
複合体が合成され、特徴付けられた後、以前に同様のイリジウムアナログ17を用いて説明したように、アミノ酸の選択は、分析した。 図2Aは、365 nmで励起した場合にのみ、ヒスチジンは、510 nmでの信号応答を誘発することを示しています。
図2：アミノ酸選択性とヒスチジンリッチペプチドとIr1をの滴定（A）、50μMと各種アミノ酸（システイン、セリン、ASP、Gluの、Pheで、リジン、アルギニン、のTyr、Trpで、彼の）の200μMの相互作用。 HBSでIR1。スペクトルスキャンは、黒色の96ウェルプレート中で365nmでの励起波長で400〜700ナノメートルから採取しました。すべてのアミノ酸Bからの相対蛍光単位におけるシグナル（RFU）esidesヒスチジン（破線の黒のトレース）はごくわずかでした。 BNT-II（▪）とrcHRP-II（♦）の（B）ナノモル濃度は、HBSでIr1を用いて滴定しました。ヒスチジンリッチペプチドは、365nmの光で励起した後、510 nmでの発光を読み取る前に溶液中で15分間プローブと共にインキュベートしました。検出限界は、yは3σ ブランクを = xの値として算出しました。
この「オンスイッチ」イリジウムプローブのリン光のヒスチジンがコーディネートされたときのIr（III）バイオコンジュゲートの一重項励起状態（1 MLCT / 1 LC）は、三重項励起状態（3 MLCT）へ項間交差を受けるために発生金属中心へ。このプローブは、マラリア、バイオマーカー熱帯熱マラリア原虫のヒスチジンに富むタンパク質II（PF HRP-II）のペプチド模倣BNT-IIに適用しました。 Ir1を有するBNT-IIの滴定では、濃度依存性のシグナル応答が観察されました（
図3：ニッケル（II）NTAガラスセンサーの表面にBNT-IIに結合するIr1を種々の濃度の動態分析のためのBNT-II生物層の干渉とIr1をのリアルタイム速度論的解析 。 KB（領域A）にセンサーを平衡化した後、センサーは0.5μMBNT-II（領域B）がロードされます。ペプチドは、センサ上にロードされると、ベースラインは前BNT-II（領域D）にIr1をの結合を測定する（領域C）が確立されています。後に会合の期間は、センサは、解離（領域E）を測定するためにKBに戻されています。全体の動態解析処理が30分未満を要します。
磁性粒子プラットフォームに溶液ベースのアッセイから移行すると、システム内の粒子の追加された複雑さを考慮に入れなければなりませんでした。に見られるように、それは、上述し24ブラック蛍光プレートは、溶液アッセイのためにうまくいった。これらの粒子を効率的にマラリアのバイオマーカーPF HRP-IIに結合することが、これまでの研究から知られているが、白色プレートは、上の粒子検出プラットフォームに適したました図4A。白色板では、光は、このように、粒子の表面に結合Ir1をすることによって、より良い吸光度を可能にする、バックサンプルに反映されています。上の粒子アッセイにおいて、rcHRP-IIの検出限界は、14.5 nMで（ 図4B）であると決定されました。溶液中とオンビーズrcHRP-IIの検出限界はSTATISました対応のないt検定（P = 0.731）に基づいてtically同じ。
図4：オンビーズBNT-IIおよびHRP-IIの検出が50μmのNi黒（II）NTA磁性アガロース粒子の表面にBNT-IIに結合したIr1をから検出された信号との間の（A）の違い96。白色96ウェルプレートに対してウェルプレート（実線）（点線）。粒子は、365nmの光で励起し、発光は510 nmで測定しました。 rcHRP-IIの（B）滴定は、磁性粒子上に固定化し、Ir1をを使用して検出しました。検出限界は、VAのように算出しましたxのLUE yは3σ ブランクを =。
図5：Ir1を持つrcHRP-IIのオン·ビーズ検出の概略図 HRP-IIの一般的なスキームは、Ni（II）NTA粒子の表面に結合し、Ir1をで標識されました。粒子は、15分間のヒスチジンリッチペプチドとインキュベートします。このインキュベーション期間の後、粒子を溶液から粒子を引き寄せるために、磁石を用いHBSTで洗浄します。最後に、ペプチドに結合した粒子は、365 nmの光で励起した後、510 nmでの発光を読み取る前に1時間Ir1をインキュベートします。
Discussion
微粒子ベースの診断ツールは、現代の診断技術の最前線に来ているように、直接、粒子の表面上の標的生体分子の検出は、大きな利点です。そのようなELISAおよびPCRなどの従来の分子検出法は、その中にそれらが検出25の非常に低い限界を達成することができ、有利で す。しかし、これらのアッセイは、広範囲な試薬および長いプロトコルが必要です。このアッセイは、時間および試薬の要求（ 図5）なしにELISA型サンドイッチの相互作用を模倣するように設計されました。典型的なELISA用抗体のコストはサンプルあたり$ 0.20から0.30であるのに対し、さらに、サンプルあたりIr1をプローブのコストは、ペニーの周りにあると推定されました。
上記の方法は、マラリア、バイオマーカーの検出のためのシクロメタル化イリジウムプローブに依存しているので、このプローブは、 すなわち （他の検出方法に共通の故障モードの影響を受けやすいではありません。フルオロフォアquenchiNGおよび抗体/酵素分解）。ヒスチジンは、その金属結合特性に独特です。概説仕事は、金属含有錯体を有する典型的なELISAサンドイッチに抗体を置き換えることによって、この現象を利用しています。ニッケル（II）、NTAは、粒子の表面上にrcHRP-IIを捕捉し、Ir1を、タンパク質の存在を示します。アッセイの中で最も重要なステップは、磁性粒子は、サンプルとプローブと混合することを可能にします。 96ウェルELISAプレートにおいて、生体分子および試薬は、ウェルの底部の二次元表面に平衡に達します。磁性粒子は、利用可能な結合部位を減少させるそれらの緻密な酸化鉄コアに溶液から沈降する傾向があります。したがって、粒子は、最大結合を確認するためにアッセイ時間中に混合しなければなりません。
疾患の診断のための試薬を設計するとき、人は心の中で、患者試料の形だけでなく、バイオマーカーの生理的濃度を維持する必要があります。のためにマラリア、患者の血液中のPF HRP-IIの濃度が高いナノモルの低いピコモルから変化させることができます。このアッセイは、感染のより高いレベルのために臨床的に関連するが、検出限界は、PF HRP-II循環低いピコモルで無症候性の患者を検出するために改善する必要があります。上記に概説した方法では、「スイッチオン」Ir1をによって生成された信号は、ヒスチジンの存在下で起こります。マラリアのバイオマーカーは、ヒスチジンが豊富であるが、例えば、ヒト血清アルブミンおよびヒスチジンリッチ糖タンパク質のような他の血清タンパク質は、プローブの信号応答を誘発するであろう。これにより、偽陽性の診断につながります。これは有益なステップは、その中で目的のタンパク質を迅速に患者試料から抽出することができる粒子の表面上のタンパク質の捕捉を行います。さらに、二機能性プローブの設計、堅牢な分子認識素子に結合ヒスチジンリッチなペプチド（ すなわち 。アプタマーこと）、アッセイに特異性の別の層を追加することができます。ペプチドは、アプタマーに結合する前に、イリジウムでロードされることになります。アプタマーと標的特異性を達成しながら、このような設計では、安定したIr1をプローブは依然として利用することができます。これは、複雑なマトリックス（ すなわち、血漿又は全血）中に、ネイティブHRP-IIを検出し、非特異的結合効果を低減するためのプローブの適用を可能にします。さらに急速な診断テスト信号を高めるために、アッセイは、PF HRP-IIは、電気化学的読み出し26としてRDTsに検出することができる電気化学発光（ECL）システムに組み込むことができます。この次世代イリジウムプローブが大幅疾患バイオマーカーの検出のための私達の上にビーズELISAアッセイを高めるであろう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
| silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
| L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
| recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
| Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
| Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
| Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
| Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
| Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
| Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
| Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |
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