Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Iridium (III) Lichtgevende Probe voor detectie van de malaria Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

Dit werk beschrijft de synthese van een niet-emitterende, cyclometalated Ir (III) complex, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1), die een snelle, langlevende fosforescerende signaal opwekt wanneer gecoördineerd aan een histidine- bevattend eiwit geïmmobiliseerd op het oppervlak van een magnetisch deeltje. Synthese van IR1, in hoge opbrengsten, voltooid O / N en omvat splitsing van het bovenliggende cyclometalated Ir (III) chloro-gebrugd dimeer in twee equivalenten van de gesolvateerde complex. Om de specificiteit te bevestigen, werden verschillende aminozuren gesondeerd voor de coördinatie activiteit wanneer toegevoegd aan de gesynthetiseerde probe, en slechts histidine ontlokte een signaal reactie. Met behulp van BNT-II, een vertakt peptide nabootsing van de malaria biomarker Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), werd de iridium sonde gevalideerd als een instrument voor HRP-II detectie. Afschrikken effecten werden in het BNT-II / IR1 titratie vastgesteld in vergelijking met L-Histidine / IR1, maar deze werden aan sterische hindering en triPlet staat blussen. Biolayer interferometrie gebruikt voor real-time kinetiek van interactie van IR1 met BNT-II te bepalen. Nadat het systeem is geoptimaliseerd, de detectiegrens van rcHRP-II met de probe bleek 12,8 nM in oplossing. Wanneer dit eiwit geïmmobiliseerd op het oppervlak van een 50 urn magnetische agarose deeltjes, de detectiegrens was 14,5 nM. De robuuste signaalresponsie van deze anorganische probe, alsook de gebruiksflexibiliteit in oplossing of geïmmobiliseerd op een oppervlak, kan leent tegen een verscheidenheid aan toepassingen van diagnostische beeldvorming gebruik.

Introduction

Colorimetrische en tl-etikettering is een belangrijke methode voor het opsporen en volgen van biochemische moleculen en verwerkt 1,2. De meest voorkomende fluorescente merkers zijn laagmoleculaire organische kleurstoffen 3,4, maar deze moleculen niet altijd ideaal optische eigenschappen. Fluorescente kleurstoffen zijn gevoelig voor fotobleken, vaak kleine Stokes verschuivingen, en kunnen overlappen excitatie- en emissiespectra. Colorimetrische kenmerken wordt vaak bereikt door middel van enzymatische labels, die een versterkt signaal bruikbaar immunoassay kwantificatie 5,6 hebben. Deze enzymen hebben ook hun nadelen, zoals lichtgevoeligheid, reactie- omstandigheden en korte substraat houdbaarheid. Deze eigenschappen hebben de neiging om immunoassays en eiwitmarkerend vereisen onder goed gecontroleerde omstandigheden met behulp kostbare reagentia te doen.

Emissive overgangsmetaalcomplexen zijn onderzocht als alternatieve benadering labeling for biochemische detectie. Vooral cyclometalated Ir (III) werd onderzocht in de context van organische lichtgevende diodes (OLED's) 09/07 zuurstof sensor 10, 11 katalyse en eiwit / cel kleuring 12-14. Hoge fotostabiliteit en quantum efficiency maken deze klasse van probes een goede kandidaat voor biomolecuul detectie 15,16. Eerder werd gevonden dat cyclometalated Ir (III) complexen van de vorm [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, histidine onomkeerbaar binden en wekken een blauwgroene signaalrespons 12,17. Deze complexen zijn niet-emitterende in de solvento toestand, maar wanneer histidine verplaatst het oplosmiddel moleculen en bindt aan het metaalcentrum, zij een intense fosforescerend signaal na langegolf UV straling vrij. Dit signaal treedt alleen op na ligand substitutie, en is het resultaat van een triplet state electron ontspannen naar de grondtoestand door de activering van metaal ligand ladingsoverdracht (3 MLCT) en ligand gecentreerd overschrijving (3 LC) trajecten 8,15. Deze complexen kunnen eventueel worden gebruikt als probes voor de detectie histidine-rijke eiwitten.

Histidine-rijke eiwitten en hun regulering zijn belangrijke bij vele ziekten, waaronder levercirrose, kanker en aandoeningen trombische. 18 Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (pfHRP-II) in het bijzonder is een goed gevalideerde biomarker voor malariaparasiet infectie. Dit eiwit is 67 kDa en bevat 34% histidine, meestal binnen karakteristieke AHHAHHAAD herhalende motieven 19. Deze histidine herhalingen kan binden vrije metaalionen 19 en heem complexen 20 in gastheer bloed. pfHRP-II wordt vaak gedetecteerd in low-resource-instellingen met behulp van immunochromatographic snelle diagnostische tests (RDTs), maar deze tests zijn vaak onnauwkeurig vanwege sample omstandigheden, lage biomarker concentratie, slechte productie normen, en antilichaam degradatie 21.

2 (H2O) 2] + (IR1) tot BNT-II, een vertakt peptide nabootsing van pfHRP-II onderzocht 22 detecteren. Kinetiek van deze interactie zijn in real time via biolayer interferometrie technieken. De test werd ingericht om een ​​on-bead ELISA-type format, waarbij nanomolair aantoonbaarheidsgrenzen werden bereikt. Deze test heeft voordelen ten opzichte van traditionele ELISA omdat het kan worden uitgevoerd in minder dan 2 uur met antilichaam-vrije reagentia, in plaats van 4-5 hr en biologische reagentia nodig met typische ELISA.

Protocol

1. Synthese van iridium (III) Complex

  1. Weeg 53,6 mg (50 umol) [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 en oplossen in 5 ml methyleenchloride. Voeg deze oplossing toe aan een 50 ml Erlenmeyer kolf uitgerust met een roerstaaf.
  2. Weeg 26,2 mg (100 umol) van AgOTf en los op in 5 ml methanol.
  3. Voeg de opgeloste AgOTf de [Ir (ppy) 2 Cl] 2-oplossing toe en roer gedurende 1 uur.
    Opmerking: Een crèmekleurige slurry moeten leiden.
  4. Na 1 uur, filtreer de suspensie door silicagel in een 25 x 95 mm dram flesje en verdampen resterende oplosmiddel met een rotatieverdamper (5-10 min).
  5. Nadat het meeste oplosmiddel verwijderd, controleert een olieachtig geel residu blijft in de flacon. Aan dit residu, voeg 1 ml methanol opnieuw oplossen van het product en lyofiliseren 1-2 dagen om de gele vaste stof werd verkregen.
  6. Karakteriseren Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + product (IR1) van H <sup> 1 NMR (in CDCl3), ESI en UV-Vis zoals eerder beschreven. 23

2. Interacties van IR1 met verschillende Aminozuren

  1. Bereid een 2 mM oplossing van IR1 in methanol (MW 537,10 g / mol). Vortex tot volledige oplossing van de vaste stof te verzekeren.
  2. Bereid 100 pM oplossing van de volgende aminozuren en biomoleculen in HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val.
  3. Pipetteer 100 ul van elk aminozuur in een zwarte 96-putjesplaat. Voeg 100 ul van HBS aan de plaat om te dienen als blanco.
  4. Voeg 2,5 gl van 2 mM IR1 oplossing aan elk monster en schud de plaat op een plaat schudder gedurende 10 min.
  5. Na 10 min, het verwerven van de emissiespectra van de monsters onder toepassing van een 96 putjes plaatlezer (ex 365 / em 400-700).
    1. Plaats de plaat in het instrument en opent de plaat lezer software voor het opzetten van een nieuw experiment.
    2. Stel de nieuwe experiment een fluorescentiescan gelezen met een excitatiegolflengte van 365 nm en een spleetbreedte van 9 nm met de optiek in de bovenste positie.
    3. Lees de emissie 300-700 nm met een stapgrootte van 5 nm.
    4. De gegevens voor data-analyse te exporteren.
  6. Breng de monsters een duidelijke 96-putjesplaat en beeld de emissie met een UV transilluminator.

3. Titratie van IR1 met BNT-II

  1. Bereid een 1 mM voorraadoplossing van BNT-II (MW 8.233,6 g / mol) in HBS en een 2 mM oplossing van IR1 in methanol.
  2. Uit de voorraad oplossing, voor te bereiden 1 ml van 100 uM BNT-II in HBS. Vortex de microcentrifugebuis om ervoor te zorgen het monster is gemengd.
  3. Serieel verdunnen 100 pM BNT-II met de helft in HBS tot een eindconcentratie van 1,56 uM BNT-II.
  4. Voeg 100 ul van elke verdunning in drievoud met HBS dienen als blanco, aan de putjes van een 96 putjesplaat. Voor elk monster, voeg 2,5 pl 2 mM IR1.
  5. Shake de plaat gedurende 10 minuten op een bord shaker.
  6. Na schudden lees de emissie-intensiteit bij 510 nm (excitatie bij 365 nm) onder toepassing van een 96-well plaatlezer.
    1. Plaats de plaat in het instrument en opent de plaat lezer software voor het opzetten van een nieuw experiment.
    2. Stel het nieuwe experiment een fluorescentie eindpunt gelezen met een excitatiegolflengte van 365 nm en emissiegolflengte van 510 nm. Stel de sleufbreedte beide golflengten 9nm, met de optiek in de bovenste positie.
    3. Lees de plaat en de gegevens te exporteren voor analyse.
  7. Breng de monsters een duidelijke 96-putjesplaat en beeld titratie met een UV transilluminator.

4. Real-time kinetische analyse van de IR1 / BNT-II systeem met behulp van Biolayer Interferometry

  1. Voeg 200 ul kinetische buffer (KB, 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,02% Tween-20) met 8 putjes in de eerste kolom van een zwarte 96-putjesplaat en plaats de plaat in de plastic sensorhouder. Zorgvuldig overdragen 8 Ni (II) NTA biosensoren naar de eerste kolom in de kunststof houder zodanig dat de uiteinden opgehangen in de putjes van buffer. Plaats de plastic houder aan de linkerkant van de interferometrie instrument.
  2. Bereid een 2 ml van een 0,5 uM oplossing van BNT-II KB.
  3. Bereid 500 pi van een 10 pM oplossing van IR1 in KB, en serieel verdund met de helft omlaag naar 0,156 uM in KB.
  4. Een nieuwe zwarte 96 puts plaat, een pipet 200 pi KB alle 8 wells in kolom A en C.
  5. In dezelfde plaat Pipetteer 200 ul van 0,5 uM BNT-II-oplossing aan de putjes in kolom B.
  6. Pipetteer 200 ul van elke verdunning van IR1 in kolom D, te beginnen met KB als blanco in een goed D1. Voeg de verdunningen, zodat de putten toenemen IR1 concentratie door de kolom.
  7. Plaats deze plaat het instrument aan de rechterkant van de plaat met de vooraf bevochtiging sensors.
  8. In de biolayer interferometrie software, het opzetten van een basis Kinetic experiment door het definiëren van de plaat, test, en de sensor tips.
    1. Om de plaat te definiëren, selecteert u een kolom op het scherm, klik met de rechtermuisknop en kies de juiste definitie van de putten. Selecteer "Buffer" voor de kolommen A en C, "Load" voor kolom B, en "Monster" voor kolom D.
    2. Definieer de test in het volgende tabblad door toevoeging van de volgende stappen (Klik op "Add"): Evenwicht (Custom), 60 sec; Laden, 120 sec; Baseline, 60 sec; Association, 120 sec; en dissociatie, 300 sec. Selecteer de Equilibration stap en dubbelklik op kolom A. Repeat voor Laden (kolom B), Baseline (kolom C), Vereniging (kolom D) en dissociatie (kolom C). Selecteer de Ni (II) NTA sensors.
    3. Ga naar het volgende tabblad en bevestigen dat de sensoren in kolom A van de houder plastic sensor.
    4. Bevestig het experiment correct is geschetst, plaatst u een bestandsnaam, ervoor te zorgen dat "vertraging experiment 'is aangevinkt, en druk op" Go ".
      Noot: Door de geautomatiseerde aard van het instrument, nadat de kinetische experiment wordt beschreven, de stappen plaatsvinden zoals geprogrammeerd.
  9. Zodra de kinetische run voltooid is, verwerkt de gegevens in het ontvangen verwerkingssoftware.
    1. Dubbelklik op de map met de bestandsnaam van belang in het onderste gedeelte van het paneel aan de linkerkant. Vervolgens dubbelklikt u op de bijbehorende map onder "Kinetics" in het bovenste gedeelte van het paneel. Ga naar het tabblad Processing.
    2. Vink het vakje Aftrekken aan de linkerkant om de sensor selectie scherm te openen. Klik met de rechtermuisknop op zowel A4 en verander het goed op Reference Well.
    3. Vink het vakje naast de Y-as uitlijnen, en zorgen voor de geselecteerde stap is Baseline. Geef de tijd bereik te zijn van de laatste vijf seconden van de basislijn (ongeveer 55-60 sec).
    4. Vink het vakje voor Inter-stap Correction en selecteer Align dissociatie. Zorg ervoor dat de doos Savitzky-Golay Filtering wordt gecontroleerd en druk op de "Process data! ̶1;
    5. Ga naar het tabblad Analyse. Zorg dat "Association en dissociatie" is de selectie stappen te analyseren en dat het model 1: 1. Selecteer een lokale, Full fit en druk op "Fit Curves!"
    6. Markeer alle bochten in de tabel en klik met de rechtermuisknop om alle bochten ingesteld op één kleur. Vervolgens selecteert u een Global (Full) fit, gegroepeerd op kleur en Rmax Unlinked door Sensor. Druk op "Fit Curves!" Aan de mondiale kinetiek gegevens te verkrijgen.

5. On-kraal Detectie van BNT-II en rcHRP-II met IR1

  1. Bereid 1 ml van een 1 uM oplossing van BNT-II en rcHRP-II in HBS met Tween (HBST, HBS met 0,025% Tween 20).
  2. In serie verdunde elk eiwit met de helft in HBST tot een eindconcentratie van 15,6 nM.
  3. Pipetteer 100 ul van elke verdunning in drievoud in een witte 96-wells plaat met verdunningen in de volgorde van de laagste naar de hoogste concentratie in een kolom.
  4. Pipetteer 10 ul van 50 um Ni (II) NTA magnetische agarose deeltjes in elke verdunning ook.
    1. Vortex de microcentrifugebuis met de magnetische deeltjes na elke pipetteren te zorgen voor de deeltjes gesuspendeerd blijven.
  5. Plaats de plaat op een plaat schudder gedurende 15 minuten de monsters te incuberen met de deeltjes.
  6. Na deze incubatieperiode, plaatst u de plaat op een 96-wells plaat magneet en wacht 30 seconden voor de deeltjes te trekken uit de oplossing.
  7. Met behulp van een multichannel pipet, trek de oorspronkelijke monster en weggooien als afval. Verwijder de plaat uit de magneet.
  8. Voeg 200 ul van HBST aan elk putje met behulp van de multichannel pipet. Pomp de buffer en neer meerdere malen om de magnetische deeltjes te wassen.
  9. Plaats de plaat terug op de magneet en wacht 30 seconden voor de deeltjes te trekken uit de oplossing.
  10. Met behulp van de multichannel pipet, trek de 200 ul buffer en weggooien als afval. Verwijder de plaat uit de magneet.
  11. Herhaal stap 5.8 through 5.10 tweemaal drie wassingen van de deeltjes te voltooien.
  12. Voeg 100 ul van HBST aan elk putje met magnetische deeltjes, gevolgd door 2,5 pl 2 mM IR1.
  13. Incubeer de deeltjes met IR1 op een plaat schudder gedurende 1 uur.
  14. Na 1 uur, lees de emissie-intensiteit bij 510 nm (excitatie bij 365 nm) onder toepassing van een 96-well plaatlezer.
    1. Plaats de plaat in het instrument en opent de plaat lezer software voor het opzetten van een nieuw experiment.
    2. Stel het nieuwe experiment een fluorescentie eindpunt gelezen met een excitatiegolflengte van 365 nm en emissiegolflengte van 510 nm. Stel de sleufbreedte beide golflengten 9 nm, met de optiek in de bovenste positie.
    3. Lees de plaat en de gegevens te exporteren voor analyse.
  15. Breng de monsters een duidelijke 96-putjesplaat en beeld titratie met een UV transilluminator.

Representative Results

Zoals getoond in figuur 1, de synthese van de IR1 solvento-complex betrokken splitsing van het chloride brug in de bovenliggende dimeer door precipitatie van het chloride in de vorm van onoplosbare AgCl en associatie van watermoleculen aan het metaalcentrum. De vorming van IR1 werd bevestigd door 1 H NMR en ESI. Bovendien, UV-zichtbare banden kenmerkend metaal ligand ladingsoverdracht en π-π * overgangen werden toegewezen aan het spectrum, verder valideren van de vorming van IR1. Het opgeloste complex vertoont geen emitterend vermogen bij excitatie bij 365 nm.


Figuur 1
Figuur 1:. Synthese en karakterisering van IR1 Chloride brug splitsing reactie van Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) fenyl) diiridium (III) aan de Aquo complex maken Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1). Na toevoeging van L-His de Aquo complex in waterige buffer, luminescente signaal ingeschakeld.

Nadat het complex gesynthetiseerd en gekarakteriseerd, werd de aminozuur selectiviteit geanalyseerd zoals hiervoor omschreven met een soortgelijke iridium analogon 17. Figuur 2A toont dat slechts histidine veroorzaakte een signaal responsie bij 510 nm, wanneer geëxciteerd bij 365 nm.


Figuur 2
Figuur 2: Amino Acid Selectiviteit en Titratie van IR1 met Histidine rijke peptiden (A) Interactie van 200 uM van diverse aminozuren (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) bij 50 uM. IR1 in HBS. Spectrale scans werden 400-700 nm bij een excitatiegolflengte van 365 nm in een zwarte 96 puts plaat. Signaal in relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) van alle aminozuren baast histidine (gestippelde zwart trace) was verwaarloosbaar. (B) nanomolaire concentraties van BNT-II (▪) en rcHRP-II (♦) werden getitreerd met IR1 in HBS. De histidine rijke peptiden werden geïncubeerd met de probe gedurende 15 min in oplossing vóór het lezen van de emissie bij 510 nm na excitatie met 365 nm licht. Detectiegrens werd berekend als de waarde van x als y = 3σ leeg.

Deze "on-switch 'van de fosforescentie van de iridium sonde treedt op omdat de singlet aangeslagen toestand (1 MLCT / 1 LC) van de Ir (III) bioconjugaat ondergaat intersystem oversteek naar de triplet aangeslagen toestand (3 MLCT), wanneer histidine wordt gecoördineerd het metaalcentrum. Deze probe werd op BNT-II een peptide nabootser van het Plasmodium falciparum malaria biomarker Histidine Rich Protein II (pf HRP-II). In een titratie van BNT-II met IR1, werd een concentratie afhankelijk signaal respons waargenomen ( Kd van binding aan IR1 BNT-II geïmmobiliseerd op een Ni (II) NTA oppervlak bleek 2,05 pM (Figuur 3).

Figuur 4

Figuur 3: Real-time kinetische analyse van IR1 met BNT-II Biolayer interferometrie voor kinetische analyse van diverse concentraties van IR1 binding aan BNT-II op het oppervlak van een Ni (II) NTA glassensor.. Na equilibreren van de sensoren KB (regio A), worden de sensoren geladen met 0,5 uM BNT-II (regio B). Zodra het peptide op de sensoren is geplaatst, wordt een basislijn vastgesteld (regio C) voorafgaand aan het meten van de associatie van IR1 de BNT-II (Region D). Naeen periode van vereniging, de sensoren worden weer in KB geplaatst dissociatie (Regio E) te meten. Het hele kinetische analyse neemt minder dan 30 minuten.

Bij overgang van een op oplossingen gebaseerde test die een magnetisch deeltje platform, de extra complexiteit van het deeltje in het systeem moest rekening worden gehouden. Het was bekend uit eerder werk, dat deze deeltjes efficiënt malaria biomarker pf HRP-II binden. 24 Black fluorescerende platen werkte goed voor de oplossing assay hierboven beschreven, maar witte platen geschikter zijn voor de detectie platform deeltjes, zoals in Figuur 4A. In een witte plaat, wordt het licht terug in het monster gereflecteerd, waardoor een betere absorptie door IR1 gebonden aan het oppervlak van het deeltje. In de assay on-deeltje, de detectiegrens van rcHRP-II werd bepaald op 14,5 nM (Figuur 4B). De detectiegrens voor rcHRP-II-oplossing en on-bead waren statistisch dezelfde basis van een ongepaarde t-test (p = 0,731).

Figuur 5
Figuur 5


Figuur 4:. On-bead Detectie van BNT-II en HRP-II (A) Verschil tussen gedetecteerd IR1 gebonden aan BNT-II op het oppervlak van 50 micrometer Ni signaal (II) NTA magnetische agarose deeltjes in een zwarte 96- putjesplaat (getrokken lijn) versus een witte 96-well plaat (stippellijn). De deeltjes werden enthousiast met 365 nm licht, en de emissie werd gemeten bij 510 nm. (B) Titratie van rcHRP-II geïmmobiliseerd op magnetische deeltjes en gedetecteerd met IR1. Detectiegrens werd berekend als het value van x als y = 3σ leeg.

Figuur 5

Figuur 5: Schematische weergave van On-bead Detectie van rcHRP-II met IR1 opzet van HRP-II binden aan het oppervlak van Ni (II) NTA deeltjes en gelabeld met IR1.. De deeltjes worden geïncubeerd met een histidine rijke peptide gedurende 15 minuten. Na deze incubatieperiode worden de deeltjes gewassen met HBST behulp van een magneet, zodat de deeltjes trekken uit de oplossing. Tenslotte worden de peptide gebonden deeltjes geïncubeerd met IR1 gedurende 1 uur voorafgaand aan het lezen van de emissie bij 510 nm na excitatie met 365 nm licht.

Discussion

Als microdeeltjes gebaseerde diagnostische hulpmiddelen op de voorgrond van moderne diagnostische technologie, detectie van doelwit biomoleculen rechtstreeks op het oppervlak van het deeltje een groot voordeel. Traditionele moleculaire detectiemethoden zoals ELISA en PCR, zijn voordelig, doordat zij zeer lage detectiegrenzen 25 kan bereiken. Echter, deze testen vereisen uitgebreide reagentia en langdurige protocols. Deze test werd ontworpen om ELISA-type sandwich interacties nabootsen zonder de tijd en reactieve vereisten (figuur 5). Bovendien zijn de kosten van de IR1 probe per monster werd geschat op rond een cent, terwijl de kosten van antilichamen voor een typische ELISA Vertaald 0,20-0,30 per monster.

Omdat de hierboven beschreven werkwijzen steunen op een cyclometalated iridium probe voor detectie van malaria biomarker zou deze probe niet storingsgevoelig modes bij andere detectiemethoden (bijv. Fluorofoor quenchi wordenng en antilichaam / enzym afbraak). Histidine is uniek in zijn metalen bindende eigenschappen. De geschetste werkzaamheden maakt gebruik van dit fenomeen door vervanging van de antilichamen in een typische sandwich ELISA met metaal complexen. Ni (II) NTA vangt rcHRP-II op het oppervlak van het deeltje en IR1 signaleert de aanwezigheid van het eiwit. De meest kritische stap bij het onderzoek wordt waardoor de magnetische deeltjes te mengen met het monster en de probe. In een 96-putjesplaat ELISA, de biomoleculen en reagentia evenwicht bereiken met het tweedimensionale oppervlak van de bodem van de put. Magnetische deeltjes de neiging te regelen uit oplossing door hun dichte ijzeroxide kern, waarbij de beschikbare bindingsplaatsen zou verminderen. Zo moet de deeltjes gemengd worden gedurende de testduur te garanderen maximale binding.

Bij het ontwerpen van een reagens voor diagnostica, moet men rekening houden met de vorm van patiëntmonster en de fysiologische concentratie van de biomarker. Voormalaria, kan de concentratie van pf HRP-II in het bloed van de patiënt variëren van laag naar hoog picomolaire nanomolair. Hoewel deze test is klinisch relevant voor de hogere niveaus van de infectie, de detectielimiet moet worden verbeterd om asymptomatische patiënten op te sporen met een lage picomolaire circulerende pf HRP-II. In de hierboven beschreven werkwijzen, het "inschakel" signaal gegenereerd door IR1 plaatsvindt in de aanwezigheid van histidine. Terwijl de malaria biomarker is rijk aan histidine, andere serumeiwitten, zoals humaan serum albumine en histidine rijk glycoproteïne, zou een signaal met de probe response opwekken. Dit zou op zijn beurt leiden tot een vals positieve diagnoses. Dit maakt het vangen van het eiwit op het oppervlak van het deeltje een positieve stap in het eiwit van belang kan snel worden geëxtraheerd uit een patiëntenmonster. Bovendien, het ontwerpen van een bifunctionele sonde, dat paren een histidine rijke peptide om een robuuste moleculaire herkenning element (dwz. Aptameer), Zou een andere laag van specificiteit aan de bepaling. Het peptide zal worden geladen met iridium voordat koppeling aan de aptameer. In een dergelijk ontwerp, kan de stabiele IR1 sonde nog steeds gebruikt worden, terwijl het bereiken doel specificiteit van de aptameer. Zodoende zou de toepassing van de sonde natieve HRP-II te detecteren in een complexe matrix (bijv. Plasma of volbloed) en niet-specifieke binding te verminderen. Om het signaal van snelle diagnostische tests te verbeteren zouden de assay in een elektrochemiluminescent (ECL) systeem, waarbij pf HRP-II kan worden gedetecteerd op de RDTs een elektrochemische uitlezing 26 worden opgenomen. Deze volgende generatie iridium probe zou sterk verbeteren onze on-bead ELISA assay voor de detectie van ziekte biomarkers.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. Point of Care Diagnostics: Status and Future. Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).
  2. Kuzmenko, A., et al. Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40. Scientific Reports. 1, (2011).
  3. Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. DNA Biosensors and Microarrays. Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).
  4. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).
  5. Liu, M., et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes. Analyst. 135, 327-331 (2010).
  6. Almeida, M., Carabineiro, S. C. The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy. Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).
  7. Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices. Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).
  8. Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices. Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).
  9. Lamansky, S., et al. Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes. Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).
  10. Ho, M. -L., et al. Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations. Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).
  11. McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water. Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).
  12. Ma, D. -L., et al. A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining. Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).
  13. Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications. Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).
  14. Leung, C. -H., et al. A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α. Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).
  15. You, Y., Nam, W. Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence. Chemical Society Reviews. 41, (21), 7061-7084 (2012).
  16. Zhao, Q., et al. Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging. Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).
  17. Li, C., et al. A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).
  18. Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems. Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).
  19. Panton, L. J., et al. Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II. Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).
  20. Schneider, E. L., Marletta, M. A. Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum. Biochemistry. 44, 979-986 (2004).
  21. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World. Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).
  22. Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates. Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).
  23. Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes. Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).
  24. Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance. Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).
  25. Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. Drivers of biodiagnostic development. Nature. 462, 461-464 (2009).
  26. Li, M. -J., et al. High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics. Analyst. 136, 205-210 (2011).
Iridium (III) Lichtgevende Probe voor detectie van de malaria Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter