Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Iridium (III) Luminescerende Probe for deteksjon av Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

Dette arbeid beskriver syntesen av et ikke-emitterende, cyclometalated Ir (III) kompleks, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1), som frembringer en rask, lang levetid fosfor signal når koordinert til et histidine- inneholdende protein immobilisert på overflaten av en magnetisk partikkel. Syntese av IR1, i høye utbytter, er komplett O / N og omfatter splitting av moder cyclometalated Ir (III) klor-brodannede dimer til to ekvivalenter av solvatisert kompleks. For å bekrefte spesifisiteten ble flere aminosyrer probet for koordinering aktivitet når de tilsettes til det syntetiserte probe, og bare histidin fremkalte en signalrespons. Bruke BNT-II, en forgrenet peptid mimikken i malaria biomarkør Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), ble iridium probe validert som et verktøy for HRP-II gjenkjenning. Slukkings effekter ble bemerket i BNT-II / IR1 titrering i forhold til L-histidin / IR1, men disse ble tilskrevet sterisk hindring og triPlet tilstand slukke. Biolag interferometri ble anvendt for å bestemme sanntidskinetikken for interaksjon av IR1 med BNT-II. Når systemet er optimalisert, er grensen for påvisning av rcHRP-II ved bruk av probe funnet å være 12,8 nM i oppløsning. Når dette protein ble immobilisert på overflaten av en 50 um agarose magnetisk partikkel, deteksjonsgrense var 14,5 nM. Den robuste signalrespons på denne uorganiske probe, så vel som dens fleksibilitet for bruk i løsning eller immobilisert på en overflate, kan egner seg mot en rekke anvendelser, fra diagnostisk bruk til avbildning.

Introduction

Colorimetric og fluorescerende merking er en viktig metode for deteksjon og sporing av biokjemiske molekyler og prosesser 1,2. De mest vanlige fluorescerende markører er lav molekylvekt, organiske fargestoffer som 3,4, men disse molekylene ikke alltid har ideelle optiske egenskaper. Fluorescerende fargestoffer er utsatt for fotobleking, ofte har små Stokes skift, og kan ha overlappende eksitasjon og emisjonsspektra. Colorimetric merking oppnås ofte ved bruk av enzymatiske etiketter, som har et forsterket signal anvendelig ved immunologisk kvantifisering 5,6. Disse enzymer har også sine ulemper, inkludert foto, reaksjonsbetingelser, og korte substrat holdbarhet. Disse egenskaper har en tendens til å kreve immunologiske analyser og proteinmerkingsmetoder for å gjøres under godt kontrollerte betingelser ved anvendelse av kostbare reagenser.

Utslippsovergangsmetallkomplekser har blitt utforsket som et alternativ merking tilnærming for biokjemisk deteksjon. Spesielt cyclometalated Ir (III) har blitt studert i sammenheng med organic light emitting diodes (OLED) 7-9 oksygen sensing 10, kata 11, og protein / celle flekker 12-14. Høy fotostabilitet og kvantevirkningsgraden gjøre denne klassen av sonder en god kandidat for biomolekyl deteksjon 15,16. Det ble tidligere funnet at cyclometalated Ir (III) komplekser, på formen [Ir (C ^ N) 2 (SOLV) 2] +, irreversibelt binde histidin og lokke fram en blå-grønt signal respons 12,17. Disse kompleksene er ikke emisjons i solvento staten, men når histidin fortrenger de løsemiddel molekyler og binder seg til metallet sentrum, de slipper en intens fosforiser signal etter langbølget UV-bestråling. Dette signalet bare opptrer etter ligand substitusjon, og er resultatet av en triplet tilstand elektron avslappende til grunntilstanden ved aktivering av metall ligand ladningsoverføring (3 MLCT) og ligand sentrert transfer (3 LC) trasé 8,15. Disse komplekser kan potensielt brukes som prober for deteksjon Histidinrike proteiner.

Histidinrike proteiner og deres reguleringsnivåer er viktig i mange sykdommer, inkludert levercirrhose, kreft og thrombic lidelser. 18 Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) er spesielt et godt validert biomarkør for malariaparasitten infeksjon. Dette proteinet er 67 kDa og inneholder 34% histidin, for det meste innen karakteristiske AHHAHHAAD gjenta motiver 19. Disse histidin repetisjoner kan binde frie metallioner 19 og heme komplekser 20 i verts blod. pfHRP-II er ofte påvist i lav ressursinnstillingene ved hjelp Immunokromatografisk rask diagnostiske tester (RDTs), men disse testene er ofte unøyaktig på grunn av prøve forhold, lav biomarkør konsentrasjon, dårlig produksjon standarder, og antistoff degradering 21.

2 (H 2 O) 2] + (IR1) for å oppdage BNT-II, en forgrenet peptid ligner av pfHRP-II utforskes 22. Kinetics av ​​denne interaksjonen ble overvåket i sanntid ved hjelp biolag interferometriteknikker. Analysen ble også tilpasset til en på vulst ELISA-type format, hvor nanomolare påvisningsgrenser ble oppnådd. Denne analysen har fordeler sammenlignet med tradisjonelle ELISA-er, fordi den kan utføres i henhold til to timer med antistoff-frie reagenser, i stedet for 4-5 timer og biologiske reagenser som er nødvendig med vanlige ELISA.

Protocol

1. Syntese av iridium (III) kompleks

  1. Vei opp 53,6 mg (50 umol) av [Ir (ppy) 2-Cl] 2 og oppløses i 5 ml metylenklorid. Legg denne oppløsning til en 50 ml Erlenmeyer-kolbe utstyrt med en rørestav.
  2. Vei opp 26,2 mg (100 umol) av AgOTf og oppløses i 5 ml metanol.
  3. Legg den oppløste AgOTf til [Ir (ppy) 2 -CI] 2 løsning og røre i 1 time.
    Merk: En kremfarget slurry bør resultere.
  4. Etter 1 time, filtrere oppslemmingen gjennom silikagel i en 25 x 95 mm dram ampulle og fordamp av de resterende oppløsningsmiddel ved bruk av en rotasjonsfordamper (5-10 min).
  5. Når mesteparten av oppløsningsmidlet er fjernet, kontrollere at en oljeaktig gul rest blir igjen i beholderen. Til dette residuum, tilsett 1 ml metanol for å re-oppløse produktet og lyofilisere 1-2 dager for å gi det gule faste produkt.
  6. Prege Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + produkt (IR1) av H <sup> 1 NMR (i CDCI3), ESI og UV-Vis som tidligere beskrevet. 23

2. Samhandling av IR1 med forskjellige aminosyrer

  1. Forbered en 2 mM løsning av IR1 i metanol (MW 537,10 g / mol). Vortex for å sikre fullstendig oppløsning av det faste stoff.
  2. Forbered 100 uM oppløsninger av de følgende aminosyrer og biomolekyler i HEPES-bufret saltløsning (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val.
  3. Pipetter 100 ul av hver aminosyre i en sort 96-brønners plate. Tilsett 100 ul HBS til platen for å tjene som en blank.
  4. Legg 2,5 mL av 2 mM IR1 oppløsning til hver prøve og riste platen på en platerister i 10 min.
  5. Etter 10 min erverve emisjonsspektra av prøvene ved hjelp av et 96-brønners plateleser (365 ex / 400 til 700 em).
    1. Sett platen i instrumentet og åpne plateleser programvare for å sette opp et nytt eksperiment.
    2. Sett den nye experiment å lese en fluorescens scan med en eksitasjon bølgelengde på 365 nm og en spaltebredde på 9 nm med optikken på topplassering.
    3. Les utslipp 300-700 nm med en trinnstørrelse på 5 nm.
    4. Eksportere data for dataanalyse.
  6. Overfør prøvene til en klar 96-brønns plate og bilde utslipp ved bruk av en UV-transilluminator.

3. Titrering av IR1 med BNT-II

  1. Tilbered en 1 mM stamløsning av BNT-II (MW 8233,6 g / mol) i HBS, så vel som en 2 mM oppløsning av IR1 i metanol.
  2. Fra stamløsning, fremstille 1 ml 100 mM BNT-II i HBS. Vortex mikrosentrifugerør for å sikre at prøven er blandet.
  3. Serielt fortynne 100 pM BNT-II til det halve i HBS til en endelig konsentrasjon på 1,56 uM BNT-II.
  4. Tilsett 100 ul av hver fortynning i tre eksemplarer, med HBS tjener som en blank, til brønnene i en 96-brønners plate. Til hver prøve, tilsett 2,5 mL av 2 mM IR1.
  5. Shake platen i 10 minutter på en plateryster.
  6. Etter risting, lese utslippsintensiteten ved 510 nm (eksitasjon ved 365 nm) ved anvendelse av en 96-brønns plateleser.
    1. Sett platen i instrumentet og åpne plateleser programvare for å sette opp et nytt eksperiment.
    2. Sett nye forsøk for å lese en fluorescens endepunkt med en eksitasjonsbølgelengde på 365 nm og emisjonsbølgelengde på 510 nm. Still slissebredden for begge bølgelengder til 9nm, med optikken på topplassering.
    3. Les platen og eksportere data for analyse.
  7. Overfør prøvene til en klar 96-brønns plate og avbilde titrering ved hjelp av en UV-transilluminator.

4. Sanntids Kinetic Analysis av IR1 / BNT-II System Bruke Biolag Interferometri

  1. Tilsett 200 ul av kinetisk buffer (KB, 1 x fosfatbufret saltvann med 0,02% Tween-20) til 8 brønner i den første kolonnen av en sort 96-brønners plate og sett platen inn i plast sensorholderen. Nøye overføre 8 Ni (II) NTA biosensorer til den første kolonnen i plastholderen, slik at spissene blir suspendert i brønnene av buffer. Legg plastholderen i venstre side av interferometri instrumentet.
  2. Tilbered en 2 ml av en 0,5 mM løsning av BNT-II i KB.
  3. Forbered 500 mL av en 10 mm løsning av IR1 i KB, og serielt fortynne med halvparten ned til 0,156 mikrometer i KB.
  4. Til en ny svart 96 brønners plate, pipette 200 ul KB til alle 8 brønner i kolonne A og C.
  5. I samme plate, pipettes 200 ul av 0,5 pm BNT-II-løsning til brønnene i kolonne B.
  6. Pipetter 200 ul av hver fortynning av IR1 på kolonne D, som starter med KB som blind i brønn D1. Tilsett fortynninger, slik at brønnene øker i konsentrasjon IR1 nedover kolonnen.
  7. Plasser denne plate i instrumentet på høyre side av platen som inneholder pre-fuktings sensorer.
  8. I biolaget interferometri programvare, sette opp en enkel Kinetic eksperiment ved å definere plate, analyse, og sensor tips.
    1. Å definere plate, velger du en kolonne på skjermen, høyreklikk, og velg riktig definisjon for brønnene. Velg "buffer" for kolonnene A og C, "Load" for kolonne B, og "Sample" for kolonne D.
    2. Definere analysen i neste fane ved å legge følgende trinn (Klikk "Legg til"): Ekvilibrering (Custom), 60 sek; Lasting, 120 sek; Baseline, 60 sekunder; Association, 120 sek; og dissosiasjon, 300 sek. Velg Ekvilibreringstrinnet og dobbeltklikk på kolonne A. Gjenta for Loading (kolonne B), (kolonne C), (kolonne D) Association, Baseline og Dissosiasjon (kolonne C). Velg Ni (II) NTA sensorer.
    3. Flytt til neste fane og bekrefter at sensorene er i kolonne A på plast sensor holderen.
    4. Bekreft eksperimentet er skissert riktig, sett inn et filnavn, sikre at "forsinkelsen eksperiment" er merket, og trykk "Go".
      NERK: På grunn av den automatiske typen av instrumentet, når den kinetiske forsøk er skissert, er fremgangsmåten vil oppstå som programmert.
  9. Når den kinetiske løp er fullført, behandle dataene i den medfølgende prosessering programvare.
    1. Dobbeltklikk på mappen med filnavnet av interesse i den nederste delen av panelet til venstre. Deretter dobbeltklikker du på mappen under "Kinetics" i den øverste delen av panelet. Flytt til kategorien Processing.
    2. Sjekk subtraksjon feltet til venstre for å åpne sensoren valgskjermen. Høyreklikk på vel A4 og endre godt typen til Reference Well.
    3. Merk av i boksen ved siden av Juster Y-aksen, og sikre det valgte trinnet er Baseline. Angi tidsperioden til å være den siste fem sekunder av grunnlinjen (ca 55-60 sek).
    4. Kryss av i boksen for Inter-trinns korreksjon og velg Align dissosiasjon. Kontroller at Savitzky-Golay Filtrering boksen er merket, og trykk "Process data! ̶1;
    5. Flytt til fanen Analysis. Pass på at "Foreningen og dissosiasjon" er utvalget for skritt for å analysere og at modellen er 1: 1. Velg en lokal, Full fit og trykk "Fit Curves!"
    6. Markere alle kurver i bordet og høyreklikk for å sette alle kurver til én farge. Deretter velger du en Utland (Full) fit, gruppert etter farge og Rmaks ulenket av sensor. Trykk "Fit Curves!» For å oppnå globale kinetikk data.

5. På-perle Påvisning av BNT-II og rcHRP-II med IR1

  1. Forbered 1 ml hver gang av en 1 mM oppløsning av BNT-II og rcHRP-II i HBS med Tween (HBST; HBS med 0,025% Tween 20).
  2. Serielt fortynnet hvert protein til det halve i HBST til en endelig konsentrasjon på 15,6 nM.
  3. Pipetter 100 ul av hver fortynning in triplo i et hvitt 96-brønns plate, med fortynninger i rekkefølge fra laveste til høyeste konsentrasjon ned en kolonne.
  4. Pipetter 10 ul 50 um Ni (II) NTA magnetiske agaroseplater partikler i hver fortynning også.
    1. Vortex mikrosentrifugerør inneholder de magnetiske partiklene etter hvert pipettering å sikre partiklene bli suspendert.
  5. Sett platen på en platerister i 15 min for å inkubere prøvene med partiklene.
  6. Etter denne inkuberingsperioden plassere platen på en 96-brønns plate og magnet vent 30 sek for partiklene å trekke seg ut av oppløsningen.
  7. Ved hjelp av en multikanal pipette, trekke av den opprinnelige prøven og kast som avfall. Fjerne platen fra magneten.
  8. Tilsett 200 ul av HBST til hver brønn ved hjelp av multikanal pipette. Pump bufferen opp og ned flere ganger for å vaske de magnetiske partiklene.
  9. Sett platen tilbake på magneten og vent 30 sek for partiklene å trekke seg ut av oppløsningen.
  10. Bruke multikanalspipette, trekk av 200 ul buffer og kast som avfall. Fjerne platen fra magneten.
  11. Gjenta trinn 5.8 througH 5.10 to ganger for å fullføre tre vaskinger av partiklene.
  12. Tilsett 100 ul av HBST til hver brønn inneholdende magnetiske partikler, etterfulgt av 2,5 ul 2 mM IR1.
  13. Inkuber partikler med IR1 på en platerister i 1 time.
  14. Etter 1 time, lese utslippsintensiteten ved 510 nm (eksitasjon ved 365 nm) ved anvendelse av en 96-brønners plateleser.
    1. Sett platen i instrumentet og åpne plateleser programvare for å sette opp et nytt eksperiment.
    2. Sett nye forsøk for å lese en fluorescens endepunkt med en eksitasjonsbølgelengde på 365 nm og emisjonsbølgelengde på 510 nm. Still slissebredden for begge bølgelengder til 9 nm, med optikken på topplassering.
    3. Les platen og eksportere data for analyse.
  15. Overfør prøvene til en klar 96-brønns plate og avbilde titrering ved hjelp av en UV-transilluminator.

Representative Results

Som vist i figur 1, syntese av IR1 solvento-kompleks involvert splitting av kloridet broen i moder dimer ved utfelling av kloridet i form av uoppløselige AgCl og tilknytning av vannmolekyler til metallsenteret. Dannelsen av IR1 ble bekreftet ved H NMR og en ESI. I tillegg ble UV-synlig band karakteristiske metall ligand ladningsoverføring og π-π * overganger tildelt spekteret, ytterligere validering dannelsen av IR1. Dette solvatisert komplekse utstillinger ingen emisjons tegn når eksitert ved 365 nm.


Figur 1
Fig. 1: Syntese og karakterisering IR1 av klorid bro splitting omsetning av Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) fenyl) diiridium (III) for å skape den aquo-komplekset Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1). Ved tilsetning av L-His til aquo kompleks i vandig buffer, blir luminescent signal slås på.

Når komplekset ble syntetisert og karakterisert, ble aminosyren analysert selektivitet, som tidligere beskrevet, ved anvendelse av en lignende iridium analogt 17. Figur 2A viser at bare histidin utløst et signal som respons på 510 nm, når eksitert ved 365 nm.


Figur 2
Figur 2: Amino Acid selektivitet og Titrering av IR1 med Histidinrike Rich peptider (A) Interaksjonen av 200 pM av forskjellige aminosyrer (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) med 50 uM. IR1 i HBS. Spektrale skanninger ble tatt 400-700 nm ved en eksitasjonsbølgelengde på 365 nm i en sort 96-brønners plate. Signal i forhold fluorescensenheter (RFU) fra alle aminosyrer bForuten å histidin (stiplet svart kurve) var ubetydelig. (B) nanomolare konsentrasjoner av BNT-II (▪) og rcHRP-II (♦) ble titrert med IR1 i HBS. Histidin rike Peptidene ble inkubert med proben i 15 minutter i løsning før lesing av emisjon ved 510 nm etter eksitasjon med 365 nm lys. Deteksjonsgrense ble beregnet som verdien av x når y = 3σ blank.

Denne "on-switch" av phosphorescence av iridium probe oppstår fordi sing opphisset tilstand (1 MLCT / 1 LC) av Ir (III) biokonjugatet gjennomgår intersystem krysset til lett opphisset tilstand (3 MLCT), når histidin koordineres til metallsenteret. Denne sonden ble brukt til BNT-II et peptid mimikken i malaria biomarkør Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (pf HRP-II). I en titrering av BNT-II med IR1 ble en konsentrasjonsavhengig signal respons observert ( D i IR1 binding til BNT-II immobilisert på en Ni (II) NTA overflate ble funnet å være 2,05 uM (figur 3).

Figur 4

Figur 3: Sanntids Kinetic Analysis of IR1 med BNT-II Biolag interferometri for kinetisk analyse av forskjellige konsentrasjoner av IR1 binding til BNT-II på overflaten av et Ni (II) NTA sensoren.. Etter ekvilibrering sensorene i KB (område A), er sensorene lastet med 0,5 pM BNT-II (region B). Når peptid er lastet på sensorene, er en baseline etablert (Region C) før måling sammenslutningen av IR1 til BNT-II (Region D). Etteren periode av foreningen er sensorene plassert tilbake i KB å måle dissosiasjon (Region E). Hele kinetisk analyseprosessen tar mindre enn 30 min.

Ved overgangen fra en løsning basert på analysen til et magnetisk partikkel plattform, ekstra kompleksitet av partikkelen i systemet måtte tas i betraktning. Det var kjent fra tidligere arbeid, at disse partiklene effektivt binde malaria biomarkør pf HRP-II. 24 Svart fluorescerende plater fungerte bra for løsningen analysen beskrevet ovenfor, men hvite plater var bedre egnet for on-partikkelregistrering plattform, som vist i Figur 4A. I en hvit plate, blir lyset reflektert tilbake inn i prøven, noe som tillater en bedre absorpsjon av IR1 er bundet til overflaten av partikkelen. I på-partikkelanalyse, grensen for påvisning av rcHRP-II ble bestemt til å være 14,5 nM (figur 4B). Deteksjonsgrensen for rcHRP-II in-løsning og on-perle var statistisk den samme basert på en uparet t-test (p = 0,731).

Figur 5
Figur 5


Fig. 4: On-bead Påvisning av BNT-II og HRP-II (A) forskjellen mellom det signal som detekteres fra IR1 bundet til BNT-II på overflaten av 50 um Ni (II) NTA agarose magnetiske partikler i en sort 96- brønns plate (heltrukket linje) sammenlignet med et hvitt 96-brønns plate (stiplet linje). Partiklene ble eksitert med 365 nm lys, og utslipp ble målt ved 510 nm. (B) Titrering av rcHRP-II immobilisert på de magnetiske partiklene og oppdaget ved hjelp IR1. Deteksjonsgrense ble beregnet som value av x når y = 3σ blank.

Figur 5

Figur 5: Skjematisk fremstilling av On-bead Påvisning av rcHRP-II med IR1 generelle ordningen av HRP-II binding til overflaten av Ni (II) NTA partikler og merket med IR1.. Partiklene blir inkubert med et histidin rik peptid i 15 min. Etter denne inkubasjonsperiode, blir partiklene vasket med HBST hjelp av en magnet, for å trekke partiklene ut av løsningen. Til slutt blir peptidet bundet partiklene inkubert med IR1 i 1 time før man leser av emisjon ved 510 nm etter eksitasjon med 365 nm lys.

Discussion

Som mikropartikkelbaserte diagnostiske verktøy kommer i forkant av moderne diagnostisk teknologi, er påvisning av målet biomolekyler direkte på overflaten av partikkelen en stor fordel. Tradisjonelle molekylære påvisningsmetoder, så som ELISA og PCR, er fordelaktige ved at de kan oppnå meget lave påvisningsgrense 25. Men disse analysene krever omfattende reagenser og lange protokoller. Denne analysen er designet for å etterligne ELISA-typen sandwich interaksjoner uten tid og krav reagens (figur 5). I tillegg ble kostnaden av IR1 sonde per prøve antatt å være omtrent en krone, mens kostnadene for antistoffer for en typisk ELISA er 0,20 til 0,30 $ per prøve.

Siden de ovenfor beskrevne metoder er avhengige av en cyclometalated iridium probe for påvisning av malaria biomarkør, vil denne proben ikke være utsatt for feilmodi er felles med andre påvisningsmetoder (f.eks. Fluoroforen quenching og antistoff / enzym nedbrytning). Histidin er unik i sin metallbindende egenskaper. Den skisserte Arbeidet tar fordel av dette fenomen ved å erstatte antistoffene i en typisk sandwich-ELISA med metallholdige komplekser. Ni (II) NTA fanger rcHRP-II på overflaten av partikkelen og IR1 signaler nærvær av proteinet. Den mest kritiske trinn i analysen er slik at de magnetiske partiklene til å blande seg med prøven og sonden. I en 96-brønns plate ELISA, den biomolekyler og reagenser nå likevekt med det todimensjonale flate av bunnen av brønnen. Magnetiske partikler har tendens til å felles ut av oppløsningen på grunn av deres tette jern-oksid kjernen, noe som ville redusere de tilgjengelige bindingssteder. Således må partiklene blandes i løpet av analysetiden for å sikre maksimal binding.

Når du utformer en reagent for sykdomsdiagnose, må man huske på form av pasientprøve samt fysiologiske konsentrasjon av biomarkør. Formalaria, kan konsentrasjonen av pf HRP-II i en pasients blod varierer fra lav til høy picomolar nanomolar. Selv om denne analysen er klinisk relevant for høyere nivåer av infeksjon, må deteksjonsgrensen for å bli bedre for å påvise asymptomatiske pasienter med lav picomolar sirkulerende pf HRP-II. I de fremgangsmåter som er skissert ovenfor, er "slå-på" signal genereres av IR1 forekommer i nærvær av histidin. Mens malarial biomarkør er rik på histidin, andre serumproteiner, så som humant serum albumin og histidin rik glykoprotein, vil fremkalle et signal reaksjon med proben. Dette vil i sin tur føre til falske positive diagnoser. Dette gjør fangst av proteinet på overflaten av partikkelen en gunstig trinn, ved at proteinet av interesse kan bli hurtig trukket ut fra en pasientprøve. I tillegg utforme et bifunksjonelt sonde, som par en histidin rik peptid til en robust molekylær anerkjennelse element (ie. Aptamer), Kan legge et lag av spesifisitet for metoden. Peptidet kan være lastet med iridium før kobling til aptamer. I en slik utforming, kan den stabile IR1 sonden fremdeles bli benyttet samtidig oppnå målet spesifisitet med aptamer. Dette ville muliggjøre anvendelse av sonden for å detektere naturlig HRP-II i et kompleks matrise (ie. Plasma eller helblod) og redusere ikke-spesifikke bindingseffekter. For ytterligere å forsterke signalet til rask diagnostiske tester, kan analysen bli innarbeidet i en elektrokjemiluminescensmarkør (ECL) system, hvor pf HRP-II kan detekteres på RDTs som en elektrokjemisk 26 avlesning. Denne neste generasjon iridium sonde vil kraftig forbedre vår on-perle ELISA-analysen for påvisning av sykdoms biomarkører.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. Point of Care Diagnostics: Status and Future. Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).
  2. Kuzmenko, A., et al. Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40. Scientific Reports. 1, (2011).
  3. Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. DNA Biosensors and Microarrays. Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).
  4. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).
  5. Liu, M., et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes. Analyst. 135, 327-331 (2010).
  6. Almeida, M., Carabineiro, S. C. The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy. Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).
  7. Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices. Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).
  8. Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices. Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).
  9. Lamansky, S., et al. Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes. Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).
  10. Ho, M. -L., et al. Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations. Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).
  11. McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water. Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).
  12. Ma, D. -L., et al. A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining. Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).
  13. Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications. Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).
  14. Leung, C. -H., et al. A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α. Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).
  15. You, Y., Nam, W. Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence. Chemical Society Reviews. 41, (21), 7061-7084 (2012).
  16. Zhao, Q., et al. Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging. Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).
  17. Li, C., et al. A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).
  18. Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems. Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).
  19. Panton, L. J., et al. Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II. Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).
  20. Schneider, E. L., Marletta, M. A. Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum. Biochemistry. 44, 979-986 (2004).
  21. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World. Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).
  22. Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates. Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).
  23. Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes. Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).
  24. Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance. Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).
  25. Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. Drivers of biodiagnostic development. Nature. 462, 461-464 (2009).
  26. Li, M. -J., et al. High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics. Analyst. 136, 205-210 (2011).
Iridium (III) Luminescerende Probe for deteksjon av Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter