A "المريض مثل" مثلي مسانج نموذج الفأر من سرطان الكبد الانبثاث

Summary

انتشار النقيلي من السرطان هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان. ونحن نقدم وصفا متعمقة لمنهجية عملية جراحية بقائنا لإنشاء نظام نموذجي الماوس مسانج مثلي "المريض مثل" لدراسة آليات الانبثاث في أورام الجهاز الصلبة.

Protocol

بيان الأخلاق
وقد وافق جميع الدراسات على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من كلية هنتر في جامعة مدينة نيويورك.

ملاحظة: استخدمت ثمانية BALB / ج الفئران في هذا الإجراء التجريبي. تم زرع خمسة BALB / ج الفئران مع 5 X 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 الماوس خلايا سرطان الكبد لإنتاج الأورام الأولية. واستخدمت ثلاثة الفئران BALB / ج بدون زرع والضوابط. BNL 1ME A.7R.1 هو الكبد خط خلية سرطان الفئران التي كانت التي يجنيها التحول الكيميائي من غير مكون للأورام الخلية الكبدية خط الفئران BNL CL.2. تم الحصول على BNL 1ME A.7R.1 من نوع الثقافة مجموعة أمريكا (آي تي ​​سي سي).

1. ما قبل الجراحة

1. تأكد من أن الفئران لجميع العمليات الجراحية البقاء في صحة جيدة. للتأكد من أن الفئران هي صحية، وفحص علامات الجفاف التي كتبها خيام من الجلد. لا تستخدم الفئران مع أي دليل على مرض أو دistress في هذه التجارب.
2. وزن الفئران للتأكد من أنهم ليسوا ناقصي الوزن. تأكد من أن الوزن هو 16-20 غراما على الأقل.
3. إعداد 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 خلايا فأر HCC لزرع في الماوس:
   1. وسائل الإعلام نضح من 10 مل 60٪ - 70٪ طبق خلية ثقافة متكدسة من BNL 1ME خلايا HCC A.7R.1 الماوس. يغسل مرتين مع 5 مل PBS. إضافة 2 مل من التربسين إلى الطبق واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع الهواء و 5٪ CO ₂ لمدة 5 دقائق.
   2. وفي وقت لاحق، ماصة 10 ميكرولتر trypsinized الخلايا في عدادة الكريات يدوية لفرز الخلايا تحت المجهر في التكبير من 10X. عد العدد الكلي للخلايا الموجودة في أربعة مربعات زاوية كبيرة ومضاعفة عامل التخفيف من العدد الكلي للخلايا. ثم، القسمة على عدد من الساحات عد وضرب من قبل 10 ⁶ للتركيز الخلية (الخلايا لكل مل).
   3. باستخدام حساب، جمع 5 ملايين الخلايا في الماوس في عقيمة1.5 مل أنابيب microcentrifuge. تسمية 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
4. Resuspend و5 × 10 ⁶ خلايا BNL 1ME A.7R.1 الماوس HCC في 100 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). الحفاظ على هذه الخلايا على الجليد حتى زرع في الجراحة.
5. أداء الأنشطة المطلوبة لإعداد الفئران لإجراء عملية جراحية مثل تحريض التخدير والشعر قصاصات بعيدا عن المعدات والمواد المعقمة لتجنب التلوث.
6. حمل التخدير العام في الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلورين استخدام المرذاذ الأيزوفلورين جنبا إلى جنب مع الأكسجين بتركيز معدل تدفق ثابت من 1 L لكل دقيقة (تقريبا 2.1٪). ملاحظة: هذا النظام هو الاعتماد على الذات، ويشمل المرذاذ الدقة، وإمدادات الأكسجين وعلبة الفحم الذي يرتبط دارة التنفس حاجة للغاز / مخدر الكسح.
7. ضمان التخدير كافية لمنع الحيوانات من الألم أثناء خضوعه لعملية جراحية. أداء إصبع القدم قرصة ومراقبة الحيوان لغير respon-siveness لتأكيد التخدير.
8. في ذلك الوقت، والتحول خط صمام، وختم لمنطقة الجزاء، ومفتوحة للمخروط الأنف.
9. بمجرد أن يتم تخدير الماوس، وتطبيق كمية صغيرة من مرهم للعين لالقرنيات كإجراء وقائي من الجفاف والتلف.
10. وفي وقت لاحق، نقل الحيوان إلى منطقة التحضير، مع مخروط الأنف وضعها بشكل صحيح ومتصل (للتخدير الصيانة). إعداد الموقع للشق الجراحي لعملية جراحية قبل إزالة الشعر في هذا المجال التحضير.
11. تأكد من أن مجال الجراحة في مكان خال من كل نشاط آخر.
12. تأكد من أن سطح العمل هو قوي وتعقيم مناسب، unsoiled وقبل الجراحة خالية من الفوضى. وضع قطعة معقمة من الكتان أو علبة الجراحية أكثر من ذلك.
13. تأكد من أن حقل من المنطوق متاح للأشخاص فقط تنفيذ عملية جراحية. تأكد من أن غرفة العمليات الجراحية يتم تنظيفها واجتاحت مع نظافة المناسبة ورش مع disinfe المناسبctant.
14. تأكد من وضعه أيضا بعيدا عن الأبواب والنوافذ كما تيارات الهواء يمكن أن ينتشر الغبار مما يؤدي إلى تلوث الموقع.
15. إجراء الجراحة البقاء على قيد الحياة مع أدوات معقمة. إما نقع الصكوك في مطهر وفقا لتوصية الشركة الصانعة أو الأوتوكلاف. استخدم مستلزمات معقمة الأساسية التي هي جاهزة للاستخدام.
16. أدوات منفصلة وفقا لوظيفة للمساعدة في منع التلوث من المناطق العقيمة.
17. يحلق حوالي 1 بوصة حول موقع شق (شق خط الوسط) للوصول إلى كبد الحيوان. إزالة الشعر من الحيوانات بعيدا عن موقع الجراحة.
18. بعد الحلاقة، فرك المنطقة مع مطهر والصابون (betadine فرك الجراحية) وغسل مطهر الزائد بعيدا مع حل PBS العقيمة. تنفيذ هذا عدة مرات، مع عملية فرك كامل دائم حوالي 5 دقائق. إزالة والتخلص من القفازات المستخدمة.
19. بعد ذلك، تغيير الملابس الواقية مثل surgicآل ثوب، أعلى فرك، وقناع الوجه. المقبل، تطهير الأيدي بمحلول فرك الصحيح قبل وضع القفازات الجراحية. ملاحظة: هذه هي خطوة ضرورية لمنع سفك وتلويث موقع الجراحية مع الملوثات المحتملة.

2. جراحة

1. توفير مصدر الحرارة الخارجية للدفء طوال فترة التخدير. قد تواجه بعض الحيوانات انخفاض حرارة الجسم بسبب التخدير يسبب اضطرابات الحراري. وبالتالي، والحفاظ على درجة حرارة الجسم.
2. وضع الماوس على ظهرها طوال الجراحة.
3. إصلاح أطرافه الصدارة، أطرافه الخلفية وذيل الماوس إلى طاولة الجراحة مع قطعة من الأشرطة الجراحية.
4. جعل شق خط مستقيم أقل شأنا على الفور إلى xyphisternum.
5. استخدام الذاتي الاحتفاظ ضام جراحي معقم لفضح الكبد.
6. مع حقنة ذات إبرة 20G، ببطء وبعناية ضخ 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1خلايا فأر HCC في الفص الأيمن من الكبد.
7. بعد إزالة الإبرة، وتطبيق مسحة القطن المعقم لمدة 1 دقيقة على الأقل لوقف أي نزيف محتمل بسبب ارتفاع الأوعية الدموية للكبد.
8. إغلاق الأنسجة تحت الجلد مع خياطة للامتصاص تليها إغلاق الجلد باستخدام مقاطع الجراحية. وفي وقت لاحق، وتنظيف الجرح مرة أخرى مع betadine فرك. ملاحظة: وهذا يضمن إغلاق الجروح.
9. تحت الجلد تعطي 100 ميكرولتر من محلول ملحي.

3. ما بعد الجراحة

1. مباشرة بعد عملية جراحية، ونقل الماوس إلى قفص نظيفة مع بطاقة الهوية بعد الجراحة لإعلام القائمين على شرط الماوس. توفير الغذاء والماء. ملاحظة: في تجربتنا، والفأر الذي خضع لعملية جراحية فقط سوف يحقق نتائج أفضل إذا يضم وحده مع الغذاء الرطب والماء لفترة أولية 24 ساعة بعد الجراحة.
2. الحفاظ على الحارة الحيوان مع مصباح الحرارة التي تولد الحرارة لا يتجاوز 38 درجة مئوية. Uحد ذاتها ترمومتر لقياس درجة الحرارة حتى يتم استرداد الماوس بشكل كامل.
3. بيت الحيوانات في قفص ويفضل مع الفراش ورقة لضمان الراحة.
4. بعد الانتعاش الأولي، ومراقبة الحيوانات لعلامات الانزعاج، والنزيف والألم والضيق. إعطاء البوبرينورفين (0.05 -0.1 ملغم / كغم) لتخفيف الألم. تراقب عن كثب النشاط والسلوك والمظهر، وكذلك استهلاك الماء والغذاء لحوالي 2 ساعة. إذا العيادات الخارجية، نقل الحيوان إلى منطقة للسكن العادي العادي من الفئران ومواصلة رصد في فترات 12/06 ساعة لمدة 24 ساعة بعد الجراحة. إجراء فحص الوزن إذا رغبت في ذلك.
5. ولكن إذا كان الحيوان هو وجود قضايا يتعافى، واتخاذ إجراءات الرعاية الداعمة المناسبة. إذا الفئران غير قادرة على التعافي، الموت ببطء إنسانية الفئران عبر CO ₂ الخنق وخلع عنق الرحم. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة للقتل الرحيم.
6. بعد الجراحة، لفحص الأدلة السريرية من HCC التي عادة ما تكون observabلو خفض كبير كما في حالة الجسم النتيجة. ملاحظة: عند هذه النقطة، والورم الرئيسي المحتمل وضعت في الكبد، وقد الودائع المتنقل المرجح ضعت في الرئتين.
7. عند هذه النقطة، تضحية بكل الفئران (التجريبية والضابطة) تشارك في التجربة التي كتبها القتل الرحيم إنسانية. تعرض الفئران لثاني أكسيد الكربون الاختناق: ببطء شديد الافراج عن ثاني أكسيد الكربون في الغرفة خلال الفترة من 5 -10 دقائق. وهذا سوف يسبب توقف التنفس.

Representative Results

تم زرع كبد BALB / ج الفئران مع 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 خلايا فأر HCC. والأدلة السريرية التنمية HCC يمكن ملاحظتها 63 أيام بعد الجراحة. ونتيجة لذلك، الموت الرحيم كانت الفئران إنسانية. تم إجراء تشريح على الفئران الموت الرحيم. كانت مقطوعة الرئتين والكبد وتم إجراء الفحص الإجمالي دقيق لتحديد الأورام العيانية. في الماوس واحد، لوحظ وجود ورم سطحي على سطح الكبد مع بعض التعلق جدار البطن (الشكل 1A). في ماوس الثاني، وقد لوحظ تضخم الكبد تبحث بشكل غير طبيعي. الشذوذ تبدو قويا جدا مثل ورم سطحي (الشكل 1B). كما هو متوقع، الفئران في المجموعة الضابطة مع عدم وجود زرع خلايا BNL 1ME A.7R.1 HCC ضعت أية أورام، كما يتضح من الكبد (1D الشكل) والرئتين (الشكل 1E) من الماوس السيطرة. أيضا، بدت الرئتين من الفئران بأورام غير طبيعية إلى حد ما، وعرض المناطق جي النزفية نخر (الشكل 1C). بناء على الخبرة السابقة، قد تكون هذه الرئتين المرفأ الودائع المتنقل ^3.

الشكل 1. فحص الإجمالي من الورم والانبثاث. زرعت BALB / ج الفئران مع 5 X 10 ⁶ خلايا الورم BNL 1ME A.7R.1 والموت الرحيم في وقت لاحق 63 يوما. الأورام تمثيلية الكبد لاحظ تم تصويرها وعرضها هنا. (A و B) على حد سواء تظهر أورام الكبد سطحية. (C) هي الرئتين من الخلايا السرطانية المزروعة الفئران. (D) تعرض كبد الفأر السيطرة. (E) إلى الرئتين لعنصر تحكم الماوس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جنرال الكتريك = "دائما">
الشكل 2. تخطيطي لمنهجية نموذج الفأر مسانج مثلي "المريض مثل" من سرطان الكبد ورم خبيث. وبمجرد تخدير، يتم زرع كبد الفأر مع 5 X 106 BNL 1ME A.7R.1 الماوس سرطان الكبد (HCC) الخلايا. عندما تكون الأدلة السريرية للHCC يمكن ملاحظته، هو التضحية الحيوانية القتل الرحيم إنسانية (تعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون الاختناق، تليها عن طريق الجلد استنزاف داخل القلب وخلع عنق الرحم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه المقالة يتم إعطاء وصف متعمقة للطريقة التي تم الإبلاغ عنها مؤخرا من قبل Ogunwobi وزملاؤه من إنشاء الناجح لنموذج الفأر مسانج مثلي من سرطان الكبد ورم خبيث (الشكل 2) ^3. معدل تأخذ من أورام لهذا الإجراء مرتفع عموما. وقد لاحظنا سابقا بمعدل اتخاذ الورم من 100٪ ^3. ومع ذلك، يمكن للمعدل تأخذ تكون متغيرة تبعا لاختصاص المحقق. في التجربة الأخيرة التي يقوم بها طالب دراسات عليا جديد تحت التدريب، كان معدل أخذ الورم منخفضة تصل إلى 40٪. وعلى الرغم من إنهاء معظم التجارب في 4-6 أسابيع بسبب الانخفاض في حالة الجسم النتيجة، نحن نعتقد من الخبرة في زرع تحت الجلد من الخلايا نفسها في نفس الفئران التي قد تنشأ الأورام الأولية من خلال 2-3 أسابيع. نتوقع عادة لرؤية الورم واحد العقيدات من تجربة ناجحة. وعلى الرغم من أننا نتوقع ورم خبيث في الرئة لتطوير ما بين 4-6 أسابيع، هو conceivقادرة أن الورم في الكبد قد تحدث في وقت سابق من ذلك بكثير.

التقنيات الجراحية جيدة وظروف معقمة ضرورية لنجاح هذه الطريقة عملية جراحية البقاء على قيد الحياة. يجب أن الفئران المستخدمة لإجراء عملية جراحية بقاء تكون صحية. وزنها قبل وبعد الجراحة هو ممارسة جيدة. متوسط ​​الأوزان قبل الجراحة من الفئران المستخدمة في أو كانت تجربة أحدث 18 غراما، وفي التجريبية نقطة النهاية (63 يوما زرع آخر الجراحي) كان متوسط ​​وزنهم 22 غراما فقط. وكسب 4 فقط غراما من وزنه خلال تلك الفترة الزمنية من المرجح أنه كان هناك بعض الانخفاض في زيادة الوزن بسبب المرض النظامية من الورم. سيكون لدينا وكان تقييم أكثر موضوعية لهذا قمنا بقياس وزن الفأر مرة واحدة أو مرتين أسبوعيا في كافة مراحل التجربة. ويوصي هذا أفضل الممارسات.

كما خصت في الشكل 2، والفئران يجب تخدير كاف قبل الجراحة وطوال فترة عملية جراحية لتجنب الألم استغاثة الثانية. يجب أن تكون المنطقة خالية من جميع فوضى، ويجب أن يكون الوصول فقط متاحة لأولئك الذين يؤدون الجراحة. كل من منطقة الجراحة وكذلك الأدوات المستخدمة يجب أن تكون جميع العقيمة.

خطوة حيوية لنجاح زرع هي إعداد BNL 1ME A.7R.1 خلايا فأر HCC ليكون مزروع. خلال فترة الإعداد، فمن الأهمية بمكان لتجنب التلوث من جمع الخلايا من مزارع الخلايا متموجة الأطباق. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات في غطاء ثقافة الخلية تحت ظروف معقمة. وينبغي أن يتم عد الخلايا أيضا لضمان تم جمع 5 خلايا × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 الماوس HCC في أنبوب معقم microcentrifuge 1.5 مل في الفأر الذي هو معلق في 100 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ويمكن أيضا التريبان تلطيخ الأزرق أن يؤديها اختياريا لتأكيد سلامة الخلايا. يجب أن تبقى هذه الخلايا على الجليد لم يعد من 2 ساعة قبل الزرع في كبد الفئران.

وينبغي التعامل مع _content "> وزرع الخلايا السرطانية مع الرعاية بسبب الطبيعة الحساسة للكبد (الشكل 2). وخلال حقن الخلايا السرطانية، وتجنب عميق جدا ثقب التي قد تؤدي إلى الإبرة يمر الكبد كامل ومن الضروري لحقن الخلايا السرطانية ببطء وبعناية. ومن ناحية أخرى، فإن ضحلة جدا ثقب مع إبرة قبل الحقن المرجح أن يسبب تسرب من الخلايا السرطانية حقن بها في التجويف البريتوني. أيضا، بعد إزالة الإبرة، هناك دائما إمكانية للجهاز النزيف خارج بسبب الأوعية الدموية العالية. لذلك، تطبيق مسحة القطن المعقم لمدة 1 دقيقة على الأقل يوصى. سوف العناية والاهتمام ضمان أعلى نسبة نجاح الغرس. وينبغي أيضا تقديم الحيوان ل مصدر خارجي للحرارة في جميع أنحاء الإجراء وانخفاض حرارة الجسم هو مصدر قلق كبير مما تسبب في اضطرابات في التنظيم الحراري أثناء التخدير. في مرحلة ما بعد الجراحة، ويجب مراقبة الحيوان لالتي ينبغي أن تدار نقطة الرعاية المناسبة أي علامات الانزعاج أو الألم. إذا الماوس غير قادر على التعافي من الجراحة، فإنه يجب أن يتم التخلص إنسانية.

كما الانبثاث السرطان هو السبب الرئيسي للوفيات من السرطان، من الأهمية بمكان لتحديد آليات نشر الدموي ^2-4. أنشئت رواية الخلايا السرطانية المنتشرة من هذا نموذج الفأر مسانج مثلي من سرطان الكبد ورم خبيث ^3. وعلاوة على ذلك، فإن CTCs المستمدة من هذا النموذج باستمرار تظهر زيادة بدء الورم والقدرة النقيلي ^3. الخلايا السرطانية المنتشرة معزولة باستخدام هذا الأسلوب قد يثبت أنه مهم جدا لأنها تساعد على كشف العوامل الجزيئية محددة، وعلامات والأهداف العلاجية المحتملة للسرطان ورم خبيث ^2-4. وقد حددت هذه المنهجية بالفعل أن هناك زيادة upregulation من عامل نمو الخلايا الكبدية (HGF) ومستقبله، ج-MET في تعميم الخلايا السرطانية بالمقارنة معخلايا الورم الرئيسي من HCC ^3. هذه النتائج بناء على الأعمال السابقة مما يدل على أن جانبا هاما من جوانب الورم ورم خبيث هو عملية الخلوية-الظهارية الوسيطة الانتقال ^2-4،10. ومزيد من تميز تعميم الخلايا السرطانية باستخدام هذا النموذج رواية زيادة فهمنا لآليات معقدة من العوامل التي تعزز عملية مما يؤدي إلى تطوير إدارة أكثر فعالية من HCC ^1-3،10.

حاليا، ونماذج ورم الحيوان الأكثر استخداما هي الماوس نماذج ورم طعم أجنبي حيث يتم زرع الخلايا السرطانية البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. النموذج الذي وصفها في هذه المقالة مزايا هامة لأنها مسانج وهو، بالتالي، ومناسبة لدراسة دور جهاز المناعة في الورم ورم خبيث ^3. وقد أثبت هذا النموذج ليكون تكرار للغاية من أجل عزل، زراعة، ودراسة الخلايا السرطانية المنتشرة قابلة للحياة ^3. ولذا، فقد tremenإمكانية دوس لتقييم التطبيقات السريرية مثل الفحص والتشخيص والتكهن، ورصد العلاج واكتشاف استراتيجيات علاجية جديدة. وجود قيود على المنهجية المذكورة أعلاه هو أن جزءا كبيرا من BNL 1ME خلايا HCC A.7R.1 الماوس زرعها في الفئران سيكون غير قادر على قيد الحياة، وبالتالي سوى جزء صغير من الخلايا ستكون قادرة على البقاء وبارعون في إدخال الأورام في مواقع ثانوية ^3. نفسر هذا التحديد عن طريق غرس الأولي من 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 خلايا فأر HCC في الماوس.

في الختام، وهذا نموذج الفأر مسانج مثلي من سرطان الجهاز الصلبة المنتشر يوفر منصة جيدة لتوضيح الآليات البيولوجية الكامنة وراء قدرة النقيلي تعميم الخلايا السرطانية في الدم لمرضى السرطان ^3. وهذا بدوره من المرجح تسليط رؤى جديدة في آليات الانبثاث سرطان بسبب ورم خبيث سرطان يحدث في المقام الأول عن طريق هيمانشر togenous ^11-13. ورؤى جديدة وبالتالي اكتسبت في آليات الانبثاث سرطان ستكون حاسمة في تطوير التطبيقات السريرية مفيدة رواية ^3،14،15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Tweezer	Roboz	(RS-5040)	Tip 0.20 x 0.12 mm
Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip	Roboz	(RS-5111)	1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm
Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs)	Roboz	(RS-6501)	Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm
Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs)	Roboz	(RS-6503)	Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm
Jameson Caliper (Measures tumors)	Roboz	(RS-6466)	80 mm/3 inch scale, chrome plated
Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp	Roboz	(RS-5852)	23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings
Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures	Roboz	(RS-9861-36)
Scalpel handle	Roboz	(RS-9884)	Solid
Littauer Stitch Sissors	Roboz	(RS-7074)	Length 4.5 inches
Brown needle holder, for easy suture tying	Roboz	(RS-7960)	Convex jaw, fine serrations
Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier	Roboz	(RS-9262)	safe, secure alternative method of wound closure
Instrument tray and lid	Roboz	RT-1350S
Mini-clipper with detachable blade	Roboz	(RS-5903)
Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer	Roboz	Ds-400, Ds-401, DS-501	For fast decontamination of micro-dissecting instruments.   Instruments decontaminate within 15 sec.
Microinjection needles	VWR	BD305125	25G Needle