Un «Patient-Like" Orthotopique Syngénique modèle de souris de carcinome hépatocellulaire Métastases

Summary

La dissémination métastatique du cancer est la principale cause de décès liés au cancer. Nous fournissons une description en profondeur de notre méthodologie de chirurgie de survie pour établir un système orthotopique "patient comme" modèle de souris syngénique pour étudier les mécanismes de métastases dans les tumeurs d'organes solides.

Protocol

Déclaration éthique
Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) du Hunter College de la City University de New York.

Remarque: Huit souris BALB / c ont été utilisées dans ce mode opératoire expérimental. Cinq souris BALB / c ont été implantés avec 5 ^x 10 6 cellules de carcinome hépatocellulaire BNL 1ME A.7R.1 souris pour produire les tumeurs primaires. Trois souris BALB / c avec aucun implantations ont été utilisés comme témoins. BNL 1ME A.7R.1 est une lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire murin qui a été dérivée par transformation chimique de la non-tumorigène lignée cellulaire d'hépatocytes murins BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 a été obtenu à partir de la American Type Culture Collection (ATCC).

1. Pré-chirurgie

1. Veiller à ce que les souris pour toutes les chirurgies de survie sont en bonne santé. Pour assurer que les souris sont en bonne santé, d'inspecter des signes de déshydratation par tentes de la peau. Ne pas utiliser la souris avec aucune preuve de maladie ou distress dans ces expériences.
2. Peser souris pour vous assurer qu'ils ne sont pas d'insuffisance pondérale. Assurez-vous que le poids est d'au moins 16-20 grammes.
3. Préparer 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 cellules HCC de la souris pour l'implantation par souris:
   1. Aspirer le milieu de 10 ml 60% - plat de 70% de la culture de cellules confluentes de cellules HCC A.7R.1 de souris BNL 1ME. Laver deux fois avec 5 ml de PBS. Ajouter 2 ml de trypsine à l'antenne et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec de l'air et 5% de CO ₂ pendant 5 min.
   2. Par la suite, pipette 10 ul trypsinisées cellules dans un hémocytomètre manuel pour le comptage des cellules au microscope à un grossissement de 10X. Comptez le nombre total de cellules présentes dans les quatre grands carrés de coin et multiplier le facteur de dilution par le nombre total de cellules. Ensuite, on divise par le nombre de carrés comptés et multiplier par ⁶ 10 pour la concentration de cellules (cellules par ml).
   3. En utilisant le calcul, de recueillir 5 millions de cellules par souris dans stérile1,5 ml microtubes. Étiqueter 1,5 ml microtubes.
4. Remettre en suspension les 5 × 10 ^{6 cellules} BNL 1ME A.7R.1 HCC souris dans 100 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Gardez ces cellules sur de la glace jusqu'à l'implantation en chirurgie.
5. Effectuer des activités nécessaires à la préparation de la souris pour la chirurgie, tels que induction de l'anesthésie et les cheveux écrêtage loin de l'équipement et du matériel stérile pour éviter la contamination.
6. Induire une anesthésie générale chez les souris par inhalation d'isoflurane l'aide d'un vaporisateur isoflurane avec l'oxygène à un débit constant de concentration de 1 litre par minute (env. 2,1%). Remarque: Le système est autonome, et comprend un vaporisateur de précision, une alimentation en oxygène et un cartouche de charbon actif qui est relié à un circuit de respiration nécessaire pour le gaz / anesthésie balayage.
7. Assurez-vous que l'anesthésie est suffisante pour empêcher l'animal de subir la douleur pendant la chirurgie. Effectuer toe-pincement et d'observer l'animal en cas de non-responsiveness pour confirmer l'anesthésie.
8. A cette époque, passer la ligne de soupape, joint à la boîte et ouverte sur le cône de nez.
9. Dès que la souris est anesthésiée, appliquer une petite quantité d'une pommade ophtalmique à la cornée comme une mesure préventive contre le dessèchement et les dommages.
10. Par la suite, déplacer l'animal à la zone de préparation, avec le cône de nez correctement placé et connecté (pour entretien de l'anesthésie). Préparer le site de l'incision chirurgicale pour la chirurgie par épilation à cette zone de préparation.
11. Assurez-vous que le domaine de la chirurgie est à un emplacement libre de toute autre activité.
12. Assurez-vous que la surface de travail est robuste et convenablement désinfectés, non sali et avant la chirurgie sans encombrement. Placez un morceau de linge stérile ou plateau chirurgical sur elle.
13. Assurez-vous que le champ opératoire est seulement disponible pour les personnes qui effectuent la chirurgie. Assurez-vous que la pièce chirurgicale est nettoyé et balayé avec un nettoyant approprié et pulvérisé avec un disinfe appropriéectant.
14. Assurez-vous qu'il est également positionné loin des portes et fenêtres que les courants d'air peut se propager la poussière conduisant à la contamination du site.
15. Effectuer la chirurgie de survie avec des instruments stériles. Soit faire tremper les instruments dans un désinfectant selon la recommandation du fabricant ou un autoclave. Utilisez fournitures stériles de base qui sont prêts à l'emploi.
16. Instruments distincts selon leur fonction pour aider à prévenir la contamination des zones stériles.
17. Raser environ 1 pouce autour du site d'incision (incision médiane) pour accéder à la foie de l'animal. Enlever les poils de l'animal en dehors du site de l'intervention chirurgicale.
18. Après le rasage, frotter la zone avec un désinfectant savonneuse (bétadine chirurgicale de gommage) et laver l'excès de désinfectant loin avec une solution stérile PBS. Effectuez cette opération plusieurs fois, avec le processus de gommage toute durée d'environ 5 min. Retirer et jeté les gants usagés.
19. Ensuite, changer de vêtements de protection comme Surgicrobe al, haut de gommage et le masque de visage. Ensuite, désinfecter les mains avec une solution appropriée de gommage avant de mettre des gants chirurgicaux. Note: Ceci est une étape nécessaire pour empêcher une chute et de contaminer le site chirurgical avec des contaminants potentiels.

2. Chirurgie

1. Fournir une source de chaleur externe pour plus de chaleur pendant toute la durée de l'anesthésie. L'animal peut éprouver une certaine hypothermie, car l'anesthésie provoque des perturbations de thermorégulation; par conséquent, de maintenir la température du corps.
2. Posez la souris sur son dos tout au long de la chirurgie.
3. Fixer les membres antérieurs, membres postérieurs et la queue de la souris à la table d'opération avec des morceaux de rubans chirurgicaux.
4. Faire une incision droite immédiatement inférieure à la xyphisternum.
5. Utiliser un écarteur chirurgical autostatique stérile pour exposer le foie.
6. Avec une seringue ayant une aiguille de 20G, lentement et avec précaution, injecter 100 ml de PBS contenant 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1cellules dans le lobe droit du foie de souris HCC.
7. Après avoir retiré l'aiguille, appliquer un tampon de coton stérile pendant au moins 1 min d'arrêter toute hémorragie potentielle raison de la forte vascularisation du foie.
8. Fermez le tissu sous-cutané avec une suture absorbable suivie d'une fermeture de la peau en utilisant des agrafes chirurgicales. Par la suite, nettoyer la plaie avec de la bétadine nouveau gommage. Remarque: Cela permettra d'assurer la fermeture de la plaie chirurgicale.
9. Donner en sous-cutané 100 pi de solution saline normale.

3. post-chirurgie

1. Immédiatement après la chirurgie, transférer la souris dans une cage propre avec une carte d'identité post-chirurgie pour informer les gardiens de la condition de la souris. Fournir de la nourriture et de l'eau. Remarque: Dans notre expérience, une souris qui vient de subir une intervention chirurgicale sera meilleur tarif si logé seul avec la nourriture humide et de l'eau pour la période de 24 heures après la chirurgie initiale.
2. Gardez l'animal au chaud avec une lampe de chaleur qui génère de la chaleur dépassant pas 38 ºC. USE thermomètre pour mesurer la température jusqu'à ce que la souris est entièrement récupéré.
3. Maison de l'animal dans une cage de préférence avec de la literie de papier pour assurer le confort.
4. Après la récupération initiale, surveiller l'animal pour des signes d'inconfort, saignement, douleur et la détresse. Donnez buprénorphine (0,05 -0,1 mg / kg) pour soulager la douleur. Surveiller de près l'activité, le comportement et l'apparence, ainsi que l'eau et la consommation alimentaire pendant environ 2 heures. Si ambulatoires, déplacer l'animal revenir à la zone de logement régulière normale de souris et continuer à surveiller à intervalles de 6-12 h pour 24 h post-chirurgie. Effectuer un contrôle de poids, si désiré.
5. Toutefois, si l'animal a des problèmes récupérer, prendre des mesures de soins de soutien appropriés. Si les souris sont incapables de récupérer, euthanasier humainement souris par _asphyxie au CO2 et dislocation cervicale. Suivez les directives institutionnels approuvés pour l'euthanasie.
6. Post-chirurgie, vérifier les preuves cliniques de HCC qui est habituellement Observable réduction que significative du score d'état corporel. Remarque: À ce stade, une tumeur primaire a probablement développé dans le foie et les dépôts métastatiques ont probablement développé dans les poumons.
7. A ce point, sacrifier toutes les souris (expérimentales et de contrôle) impliqués dans l'expérience par euthanasie. Soumettre les souris à une asphyxie dioxyde de carbone: libérer lentement du dioxyde de carbone dans la chambre sur une période de 5 à 10 min. Cela entraînera un arrêt respiratoire.

Representative Results

Les foies de souris Balb / c ont été implantés avec 5 × 10 ⁶ cellules HCC de la souris BNL 1ME A.7R.1. Des preuves cliniques du développement HCC était observable 63 jours post-chirurgie. Par conséquent, les souris ont été euthanasiés. L'autopsie a été effectuée sur des souris euthanasiées. Les poumons et le foie ont été réséquées et un examen macroscopique attention a été réalisée pour identifier les tumeurs macroscopiques. Dans une souris, une tumeur superficielle a été observée sur la surface du foie avec une certaine fixation de la paroi abdominale (figure 1A). Dans un deuxième souris, un foie anormalement prospectifs été observée. L'anomalie est très fortement comme une tumeur superficielle (figure 1B). Comme prévu, les souris du groupe de contrôle sans l'implantation de cellules BNL 1ME A.7R.1 HCC développé aucune tumeur, comme en témoigne un foie (figure 1D) et les poumons (figure 1E) d'une souris de contrôle. En outre, les poumons des souris avec des tumeurs semblait quelque peu anormale, affichageING zones de nécrose hémorragique (figure 1C). Basé sur l'expérience précédente, ces poumons peuvent héberger des dépôts métastatiques ^3.

Figure 1. L'examen macroscopique de la tumeur et les métastases. Des souris Balb / c ont été implantés avec 10 ⁶ cellules tumorales 5 X BNL 1ME A.7R.1 et euthanasiés 63 jours plus tard. Tumeurs représentatives du foie observés ont été photographiés et montré ici. (A et B) montrent tous deux tumeurs hépatiques superficielles. (C) est poumons à partir de cellules tumorales souris implantées. (D) affiche le foie d'une souris de contrôle. (E) indique poumons d'un contrôle souris. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Schéma de la méthodologie d'un modèle «patient-like" orthotopique souris syngénique de carcinome hépatocellulaire métastase. Une fois anesthésié, foie de souris est implanté avec 5 X 106 BNL 1ME carcinome hépatocellulaire A.7R.1 de la souris (HCC) cellules. Lorsque des signes cliniques de HCC est observable, animal est sacrifié par euthanasie (soumis à dioxyde de carbone asphyxie, suivie par percutanée exsanguination intracardiaque et la dislocation cervicale). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Dans cet article, une description approfondie de la méthode est donnée qui a été récemment rapporté par Ogunwobi et ses collègues de mise en place réussie d'un modèle de souris syngénique orthotopique du HCC métastases (figure 2) ^3. Le taux de participation des tumeurs de cette procédure est généralement élevé. Nous avons déjà observé un taux de participation de la tumeur de 100% ^3. Cependant, le taux d'utilisation peut être variable en fonction de la compétence de l'investigateur. Dans une expérience récente réalisée par un nouvel étudiant diplômé en cours de formation, le taux de participation de la tumeur était aussi bas que 40%. Bien que la plupart des expériences sont terminées à 4 - 6 semaines en raison de baisser dans la note d'état corporel, nous croyons que de l'expérience avec l'implantation sous-cutanée de ces mêmes cellules dans la même souris que les tumeurs primaires peuvent être établis par 2 - 3 semaines. Nous attendons généralement de voir un nodule de la tumeur à partir d'une expérience réussie. Et bien que nous nous attendons métastases pulmonaires de développer entre 4 - 6 semaines, il est conceivmesure que la tumeur dans le foie peut avoir lieu beaucoup plus tôt.

Bonnes techniques chirurgicales et des conditions d'asepsie sont essentiels à la réussite de cette méthode de chirurgie de survie. Les souris utilisées pour la chirurgie de survie doivent être en bonne santé. Pesant pré et post-opératoire est une bonne pratique. Les poids moyen des souris pré-chirurgie ou utilisés dans l'expérience la plus récente était de 18 grammes, et à la fin-point expérimental (63 jours après l'implantation chirurgicale) de leur poids moyen était de seulement 22 grammes. Un gain de seulement 4 grammes de poids pendant cette période de temps est probablement parce qu'il y avait une certaine baisse du gain de poids due à une maladie systémique de la tumeur. Nous aurions eu une évaluation plus objective de ce devait nous avons mesuré le poids de la souris une fois ou deux fois par semaine pendant toute l'expérience. Cette pratique recommandée est.

Comme résumé sur la figure 2, les souris anesthésiées doivent être adéquatement avant la chirurgie et pendant toute la durée de la chirurgie afin d'éviter une douleur e détresse. La zone doit être libre de tout encombrement, et l'accès ne devrait être disponible pour ceux qui accomplissent la chirurgie. Tant le secteur de la chirurgie ainsi que les instruments utilisés doivent tous être stériles.

Une étape cruciale pour le succès de l'implantation est la préparation des cellules HCC de la souris BNL 1ME A.7R.1 à être implanté. Lors de la préparation, il est crucial pour éviter la contamination de la collection des cellules à partir de cultures de cellules confluentes plats. Ces mesures doivent être effectuées dans une hotte de culture cellulaire dans des conditions stériles. Un nombre de cellules doit également être fait pour assurer 5 × 10 ⁶ cellules BNL 1ME A.7R.1 souris HCC ont été recueillis dans un tube de 1,5 ml par souris stérile qui est remis en suspension dans 100 pi de phosphate de solution saline tamponnée (PBS). Trypan coloration au bleu peut aussi éventuellement être effectuée pour confirmer la viabilité des cellules. Ces cellules devraient être conservés dans la glace ne sont plus que 2 h avant l'implantation dans le foie de souris.

_content "> L'implantation des cellules cancéreuses doit être manipulé avec précaution en raison de la nature délicate du foie (figure 2). Lors de l'injection des cellules cancéreuses, d'éviter une ponction trop profonde qui peut entraîner l'aiguille passant par le foie entier . Il est indispensable d'injecter les cellules cancéreuses lentement et avec précaution. D'autre part, une perforation trop peu profond avec l'aiguille avant l'injection est susceptible de causer un déversement des cellules cancéreuses injectées dans la cavité peritoneale. De plus, après le retrait de l'aiguille, il ya toujours un potentiel de l'organe de saignement en raison de sa forte vascularisation. Par conséquent, l'application d'un coton-tige stérile pendant au moins 1 min est recommandée. soin et attention seront assurer le plus haut taux de réussite d'implantation. L'animal doit également être prévu une source de chaleur externe au long de la procédure que l'hypothermie est une préoccupation majeure entraînant des troubles de la thermorégulation pendant l'anesthésie. post-chirurgie, l'animal doit être surveillé pourdes signes d'inconfort ou de douleur à quel point les soins appropriés devraient être administrés. Si la souris est incapable de récupérer de la chirurgie, il devrait être euthanasiés sans cruauté.

Comme les métastases du cancer est la principale cause de décès par cancer, il est essentiel de définir les mécanismes de dissémination hématogène ^2-4. Les cellules tumorales circulantes ont été établies à partir de nouveaux ce modèle de souris orthotopique syngénique de métastases HCC ^3. En outre, les CTC dérivés de ce modèle montrent une augmentation constante initiation de la tumeur et la capacité métastatique ^3. Les cellules tumorales circulantes isolées en utilisant cette méthode peut se révéler très importants car ils aident à démêler les facteurs moléculaires spécifiques, des marqueurs et des cibles thérapeutiques possibles de métastases du cancer ^2-4. Cette méthodologie a déjà identifié ce qu 'on augmente la régulation positive du facteur de croissance des hépatocytes (HGF) et son récepteur, c-Met dans les cellules tumorales circulantes par rapport àles cellules de tumeur primaire de carcinome hépatocellulaire ^3. Ces résultats se fondent sur ​​les travaux antérieurs démontrant que d'un aspect important de la métastase de la tumeur est le processus cellulaire épithéliale-mésenchymateuse transition ^2-4,10. Les cellules tumorales de caractérisation circulant en outre l'utilisation de ce modèle de roman va augmenter notre compréhension des mécanismes complexes de facteurs qui favorisent le processus conduisant ainsi au développement d'une gestion plus efficace de la HCC ^1-3,10.

À l'heure actuelle, les modèles de tumeurs animales les plus largement utilisés sont des modèles de xénogreffe de tumeur de souris dans lequel les cellules tumorales humaines sont implantées dans des souris immunodéficientes. Le modèle décrit dans cet article présente des avantages importants, car il est syngénique et est, par conséquent, approprié pour l'étude du rôle du système immunitaire dans la métastase tumorale ^3. Ce modèle est avéré être hautement reproductible pour isoler, la mise en culture, et l'étude des cellules circulantes tumorales viables ^3. Il a donc tremendous pour évaluer le potentiel des applications cliniques comme le dépistage, le diagnostic, le pronostic, le suivi et la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques thérapie. Une limitation de la méthodologie décrite ci-dessus est qu'une partie importante des cellules HCC A.7R.1 de souris BNL 1ME implanté dans la souris sera incapable de survivre et donc seulement une petite partie des cellules sera viable et apte à introduire des tumeurs au ³ sites secondaires. Nous comptabilisons pour cette limitation par implantation initiale de 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 cellules HCC de la souris par souris.

En conclusion, ce modèle de souris syngénique orthotopique de cancer d'organe solide métastatique fournit une bonne plateforme pour élucider les mécanismes biologiques sous-jacents de la capacité métastatique des cellules tumorales circulantes dans le sang de patients atteints de cancer ^3. Cela sera probablement jeter de nouvelles perspectives sur les mécanismes de métastases du cancer parce que les métastases du cancer se fait principalement par hematogenous réparties ^11-13. Idées nouvelles ainsi acquises dans les mécanismes de métastases du cancer seront cruciales pour le développement de nouvelles applications cliniques bénéfiques ^3,14,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Tweezer	Roboz	(RS-5040)	Tip 0.20 x 0.12 mm
Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip	Roboz	(RS-5111)	1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm
Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs)	Roboz	(RS-6501)	Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm
Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs)	Roboz	(RS-6503)	Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm
Jameson Caliper (Measures tumors)	Roboz	(RS-6466)	80 mm/3 inch scale, chrome plated
Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp	Roboz	(RS-5852)	23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings
Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures	Roboz	(RS-9861-36)
Scalpel handle	Roboz	(RS-9884)	Solid
Littauer Stitch Sissors	Roboz	(RS-7074)	Length 4.5 inches
Brown needle holder, for easy suture tying	Roboz	(RS-7960)	Convex jaw, fine serrations
Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier	Roboz	(RS-9262)	safe, secure alternative method of wound closure
Instrument tray and lid	Roboz	RT-1350S
Mini-clipper with detachable blade	Roboz	(RS-5903)
Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer	Roboz	Ds-400, Ds-401, DS-501	For fast decontamination of micro-dissecting instruments.   Instruments decontaminate within 15 sec.
Microinjection needles	VWR	BD305125	25G Needle