Summary
Die Metastasierung von Krebs ist die Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle. Wir bieten eine eingehende Beschreibung der unser Überleben Chirurgie Methodik für die Festlegung eines "Patienten-like" orthotopen syngenen Mausmodellsystem zur Untersuchung der Mechanismen der Metastasierung bei soliden Organtumoren.
Protocol
Ethics Statement
Alle tierexperimentellen Studien wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) des Hunter College der City University of New York zugelassen.
Anmerkung: acht BALB / c-Mäuse wurden in diesem experimentellen Verfahren verwendet. Fünf BALB / c-Mäuse wurden mit 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus hepatozelluläre Karzinomzellen implantiert werden, um die primären Tumoren zu erzeugen. Drei BALB / c-Mäuse keine Implantationen wurden als Kontrollen verwendet. BNL 1ME A.7R.1 ist eine murine Leberzellkarzinom-Zelllinie, die durch chemische Umwandlung aus dem murinen nicht-tumor Hepatozyten-Zellinie BNL CL.2 abgeleitet wurde. BNL 1ME A.7R.1 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten.
1. Pre-Chirurgie
- Stellen Sie sicher, dass Mäuse, für alle Überlebens Operationen sind gesund. Um sicherzustellen, dass Mäusen gesund sind, inspizieren Anzeichen von Austrocknung durch Ausbeulung der Haut. Verwenden Sie keine Mäuse, die mit jedem Anzeichen von Krankheit oder distress in diesen Experimenten.
- Wiegen Mäusen, um sicherzustellen, sie sind nicht untergewichtig. Sicherzustellen, dass das Gewicht mindestens 16-20 Gramm.
- Vorbereitung 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen für die Implantation per Maus:
- Saugen Sie Medien aus einem 10 ml 60% - 70% konfluente Zellkulturschale BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen. Waschen zweimal mit 5 ml PBS. 2 ml Trypsin, in die Schale und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit Luft und 5% CO 2 für 5 min.
- Anschließend trypsiniert Pipette 10 ul Zellen in einer manuellen Zählkammer zur Zellzählung unter dem Mikroskop bei einer Vergrößerung von 10x. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in den vier großen Eckquadrate gefunden und multiplizieren Sie den Verdünnungsfaktor durch die Gesamtzahl der Zellen. Dann dividieren durch die Anzahl der Quadrate gezählt und mit 10 multiplizieren, 6 für die Zellkonzentration (Zellen pro ml).
- Mit den Programmen, sammeln 5 Millionen Zellen pro Maus in sterile1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Beschriften von 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Resuspendieren der 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen in 100 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Bewahren Sie diese Zellen auf Eis, bis die Implantation in der Chirurgie.
- Führen Sie Aktivitäten für die Vorbereitung von Mäusen für die Operation, wie Narkose und Haarschneide weg vom sterilen Geräten und Materialien, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Induzieren Narkose bei Mäusen durch Inhalation von Isofluran mit einem Isofluran Verdampfer zusammen mit Sauerstoff bei einer konstanten Konzentration Flussrate von 1 l pro min (ca. 2,1%). Anmerkung: Das System ist selbstständig und enthält eine Präzisions-Verdampfer, eine Sauerstoffversorgung und einen Aktivkohlebehälter, die mit einem Atmungskreislauf für Gas / Anästhetikum Abfangen benötigte verknüpft ist.
- Sicherzustellen, dass der Anästhesie geeignet ist, um das Tier unterzogen Schmerzen während der Operation zu verhindern. Führen Zehen Prise und beobachten Tier für nicht-Verantsiveness Anästhesie zu bestätigen.
- Zu dieser Zeit, schalten Sie die Ventilleitung, Siegel an die Box und offen für die Nasenkegel.
- Sobald die Maus betäubt, tragen Sie eine kleine Menge einer Augensalbe auf die Hornhaut als vorbeugende Maßnahme vor dem Austrocknen und Schäden.
- Anschließend bewegen Sie den Tier zum Vorbereitungsbereich, mit dem Nasenkegel ordnungsgemäß aufgestellt und angeschlossen (zur Aufrechterhaltung der Narkose). Bereiten Sie die Website des chirurgischen Einschnitt für die Chirurgie durch Depilation an diesem Vorbereitungsbereich.
- Sicherzustellen, dass der Bereich der Operation ist an einer Stelle frei von anderen Aktivitäten.
- Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsoberfläche stabil und angemessen desinfiziert, unverschmutzten und aufgeräumten vor der Operation ist. Legen Sie eine sterile Stück Leinen oder OP-Tray darüber.
- Stellen Sie sicher, dass das Operationsfeld sind nur verfügbar für Personen, die Durchführung der Operation. Stellen Sie sicher, dass die chirurgische Raum wird gereinigt und mit einem geeigneten Reinigungsmittel gewischt und mit einem geeigneten Desi gesprühtctant.
- Stellen Sie sicher, dass es auch von Türen und Fenstern, wie Luftströmungen positioniert kann Staub, was zu Kontamination der Website zu verbreiten.
- Führen Sie die Überlebenszeit der Operation mit sterilen Instrumenten. Entweder genießen Instrumente in einem Desinfektionsmittel nach Empfehlung oder Autoklav-Herstellers. Verwenden Sie sterile Grundversorgung, die betriebsbereit sind.
- Separate Instrumente nach Funktion, um zu verhindern Verunreinigung der sterilen Bereichen.
- Rasur ungefähr 1 Zoll rund um die Seite des Einschnitts (Mittelschnitt), um die Leber des Tieres gelangen. Entfernen der Haare von dem Tier entfernt von der Stelle der Operation.
- Nach der Rasur, reiben Sie die Fläche mit einem seifigen Desinfektionsmittel (betadine chirurgische Macchia) und waschen Sie die überschüssige Desinfektions weg mit sterilem PBS-Lösung. Führen Sie dies mehrmals, mit dem gesamten Prozess Peeling Dauer ca. 5 min. Entfernen und die verwendeten Handschuhe verworfen.
- Danach, um Schutzkleidung zu ändern, wie Surgical Kleid, Gestrüpp top und Gesichtsmaske. Als nächstes desinfizieren Hände mit der richtigen Peeling-Lösung vor, die sich OP-Handschuhe. Anmerkung: Dies ist ein notwendiger Schritt Abwurf und Verunreinigung der Operationsstelle mit möglichen Verunreinigungen zu verhindern.
2. Chirurgie
- Geben Sie eine externe Wärmequelle für Wärme während der gesamten Dauer der Anästhesie. Das Tier kann eine Unterkühlung zu erleben, weil Anästhesie verursacht Störungen der Thermoregulation; Daher halten die Körpertemperatur.
- Legen Sie die Maus auf dem Rücken in der gesamten Operation.
- Befestigen Sie die Vorderbeine, Hinterbeine und der Schwanz der Maus auf dem OP-Tisch mit Stücken von chirurgische Bänder.
- Stellen Sie eine gerade Linie Einschnitt unmittelbar schlechter als die xyphisternum.
- Verwenden Sie eine sterile selbsthaltender Retraktor, die Leber zu schützen.
- Mit einer Spritze mit einer 20G Nadel langsam und vorsichtig zu injizieren 100 ul PBS, enthaltend 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1Maus HCC-Zellen in den rechten Leberlappen.
- Nach dem Entfernen der Nadel, tragen Sie eine sterile Wattestäbchen für mindestens 1 min, um eine mögliche Blutung zu stoppen wegen der hohen Durchblutung der Leber.
- Schließen Sie das subkutane Gewebe mit einer absorbierbaren Naht, gefolgt von Hautverschluss mit chirurgischen Klammern. Anschließend reinigen Sie die Wunde noch einmal mit Betadin-Peeling. Anmerkung: Dies wird den Verschluß der Operationswunde zu gewährleisten.
- Subkutan geben 100 ul physiologischer Kochsalzlösung.
3. Post-Chirurgie
- Unmittelbar nach der Operation, übertragen Sie die Maus, um einen sauberen Käfig mit einem postoperativen Identifikationskarte, um Hausmeister des Maus-Zustand zu informieren. Geben Sie Nahrung und Wasser. Hinweis: Nach unserer Erfahrung, eine Maus, die gerade durchgemacht hat Chirurgie am besten abschneiden, wenn allein mit nassen Nahrung und Wasser für die erste 24-Stunden-Periode nach der Operation untergebracht.
- Halten Sie das Tier warm mit einer Wärmelampe, die Hitze abstrahlen nicht übertraf 38 ºC. USE-Thermometer, um die Temperatur zu messen, bis die Maus vollständig wiederhergestellt wird.
- Haus das Tier in einem Käfig vorzugsweise mit Papierbettwäsche, um Komfort zu gewährleisten.
- Nach anfänglichen Erholung, überwachen das Tier Anzeichen von Unwohlsein, Blutungen, Schmerzen und Leiden. Geben Buprenorphin (0,05 -0,1 mg / kg), um Schmerzen zu lindern. Die Aktivität, Verhalten und Aussehen, sowie Wasser und der Nahrungsaufnahme für ca. 2 h genau zu überwachen. Wenn ambulante, bewegen Sie das Tier wieder in die Gegend für regelmäßige normale Gehäuse von Mäusen und weiterhin auf 6-12 h Intervalle für 24 Stunden nach der Operation zu überwachen. Führen Sie eine Gewichtskontrolle, falls gewünscht.
- Allerdings, wenn das Tier ist mit Problemen erholt, geeignete unterstützende Behandlung Aktionen. Wenn Mäuse sind nicht in der Lage sich zu erholen, mit Menschlichkeit einschläfern Mäusen über CO 2 Ersticken und Genickbruch. Folgen Sie genehmigten Richtlinien des Instituts für die Euthanasie.
- Nach der Operation, überprüfen Sie für die klinische Beweise für HCC in der Regel observab istle als signifikante Reduktion der Körperkondition. Anmerkung: An diesem Punkt wurde ein Primärtumor wahrscheinlich in der Leber entwickelt und metastatischen Ablagerungen wahrscheinlich in der Lunge entwickelt.
- An dieser Stelle opfern alle Mäuse (Versuchs- und Kontroll) im Experiment durch humane Sterbehilfe beteiligt. Betreff die Mäuse zu Erstickung mit Kohlendioxid: sehr langsam setzen Kohlendioxid in die Kammer über einen Zeitraum von 5 bis 10 min. Dies führt dazu, Atemstillstand.
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Representative Results
Die Leber von Balb / c-Mäuse wurden mit 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen implantiert. Klinische Beweise für HCC Entwicklung zu beobachten war 63 Tage nach der Operation. Demzufolge wurden die Mäuse auf humane Weise eingeschläfert. Autopsie wurde auf die eingeschläfert Mäusen durchgeführt. Die Lunge und Leber wurden reseziert und eine sorgfältige Brutto Prüfung durchgeführt, um makroskopischen Tumoren zu identifizieren. In einer Maus wurde ein oberflächlicher Tumor auf der Oberfläche der Leber mit irgendeiner Befestigung an der Bauchwand (1A) beobachtet. In einer zweiten Maus, wurde eine ungewöhnlich aussehende Leber beobachtet. Die Anomalie sieht sehr stark wie ein oberflächlicher Tumor (1B). Wie erwartet, Mäuse in der Kontrollgruppe ohne Implantation von BNL 1ME A.7R.1 HCC-Zellen entwickelten keine Tumore, wie durch eine Leber (1D) und Lunge (1E) von einer Kontroll-Maus zeigt. Auch die Lungen der Mäuse mit Tumoren sah etwas abnormal, Displaying Bereichen hämorrhagischen Nekrose (1C). Nach den bisherigen Erfahrungen können diese Lunge Metastasen 3 Hafen.
Abbildung 1. Die makroskopische Untersuchung des Tumors und Metastasen. Balb / c-Mäuse wurden mit 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Tumorzellen implantiert und 63 Tage später getötet. Vertreter Lebertumoren beobachtet wurden fotografiert und hier dargestellt. (A und B) zeigen beide oberflächlichen Lebertumoren. (C) Lungen von Tumorzellen implantierten Mäusen. (D) zeigt Leber einer Kontrollmaus. (E) zeigt die Lungen eines Steuer Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Methodik des "Patienten-like" orthotopen syngenen Mausmodell des hepatozellulären Karzinoms Metastasierung. Einmal betäubt, ist Mausleber mit 5 X 106 BNL 1ME A.7R.1 Maus hepatozellulären Karzinoms (HCC) Zellen implantiert. Bei klinischen Anzeichen einer HCC beobachtbar ist, wird durch humane Sterbehilfe Tier (zu Erstickung mit Kohlendioxid unterzogen, gefolgt durch eine perkutane intra Ausbluten und Genickbruch) geopfert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Artikel eine ausführliche Beschreibung des Verfahrens gegeben, dass kürzlich von Ogunwobi und Kollegen der erfolgreichen Etablierung eines orthotopen syngenen Mausmodell der HCC Metastase berichtet (Abbildung 2) 3. Die Entnahmerate von Tumoren, für dieses Verfahren ist im Allgemeinen hoch. Wir haben früher beobachteten eine Tumoraufnahmerate von 100% 3. Allerdings kann die Aufnahmerate variabel, abhängig von der Kompetenz der Prüfer sein. In einer aktuellen Experiment durch eine neue Student in der Ausbildung durchgeführt, war der Tumor take Rate so niedrig wie 40%. Auch wenn die meisten Versuche werden bei 4 beendet - 6 Wochen wegen der in Körperkondition zurückgehen, glauben wir aus der Erfahrung mit subkutaner Implantation der gleichen Zellen in den gleichen Mäusen, die Primärtumoren können durch 2 festgelegt werden - 3 Wochen. Wir erwarten in der Regel auf eine Tumorknoten von einem erfolgreichen Versuch zu sehen. Und obwohl wir erwarten, Lungenmetastasen auf 4 zu entwickeln - 6 Wochen, ist es erdenklichenin der Lage, dass Tumor in der Leber kann viel früher zu nehmen.
Gute chirurgische Techniken und aseptischen Bedingungen sind für den Erfolg des Überlebens Operationsmethode. Mäuse für das Überleben der Operation verwendet werden, sollten gesund sein. Wiegen vor und nach der Operation ist eine gute Praxis. Die durchschnittlichen Vorchirurgischer Gewichte der Mäuse verwendet oder letzte Experiment betrug 18 Gramm, und im experimentellen Endpunktes (63 Tage nach der chirurgischen Implantation) ihre Durchschnittsgewicht betrug nur 22 g. Ein Gewinn von nur 4 Gramm Gewicht während dieser Zeit ist wahrscheinlich, weil es einige Rückgang der Gewichtszunahme durch systemische Erkrankung aus dem Tumor. Wir hätten eine objektivere Einschätzung dieser hatten wir, gemessen Mausgewicht einmal oder zweimal pro Woche während des Experiments. Dies wird empfohlen, Best Practice.
Wie in Figur 2 zusammengefaßt, sollten Mäuse ausreichend vor der Operation und während der gesamten Dauer der Operation, um Schmerzen zu vermeiden a narkotisiert nd Bedrängnis. Die Fläche sollte frei von Unordnung zu sein, und der Zugang sollte nur zur Verfügung, mit denen die Durchführung der Operation. Sowohl das OP-Bereich sowie die Instrumente sollten alle steril sein.
Ein wichtiger Schritt für den Erfolg der Implantation ist die Herstellung der BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen, die implantiert werden. Während der Herstellung ist es entscheidend, um eine Verunreinigung der Entnahme der Zellen aus konfluenten Zellkulturen Geschirr zu vermeiden. Diese Schritte sind in einem Zellkulturhaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Eine Zellzählung sollte auch durchgeführt werden, um sicherzustellen, 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen wurden in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pro Maus, das in 100 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert wird gesammelt. Trypanblaufärbung kann gegebenenfalls auch durchgeführt werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestätigen. Diese Zellen sollten auf Eis nicht länger als 2 h vor der Implantation in der Leber von Mäusen, gehalten werden.
_content "> Die Implantation der Krebszellen mit Vorsicht wegen der heiklen Natur der Leber (Abbildung 2) behandelt werden. Während der Injektion der Krebszellen, zu vermeiden, zu tief, einen Reifenschaden, der in der Nadel geht durch die gesamte Leber führen kann . Es ist wichtig, die Krebszellen zu langsam und vorsichtig zu injizieren. Auf der anderen Seite wird eine zu flache ein Einstich mit der Nadel vor der Injektion wahrscheinlich dazu, Verschütten von den Krebszellen in die Bauchhöhle injiziert. Auch nach dem Entfernen der Nadel, es gibt immer ein Potential des Organ Ausbluten aufgrund seiner hohen Durchblutung. Daher Anlegen einer sterilen Wattestäbchen für mindestens 1 min empfohlen. Pflege und Aufmerksamkeit wird die höchste Rate der Implantation Erfolg zu gewährleisten. Das Tier sollte auch zur Verfügung gestellt werden externe Wärmequelle während des gesamten Verfahrens als Hypothermie ist ein wichtiges Anliegen verursacht Störungen der Thermoregulation während der Narkose Post-Chirurgie., sollte das Tier zu kontrollieren,Anzeichen von Beschwerden oder Schmerzen an welcher Stelle entsprechend vorsichtig verabreicht werden. Wenn die Maus nicht in der Lage, um von der Operation erholen, sollte sie auf humane Weise getötet werden.Als Krebsmetastasen ist die Hauptursache für Todesfälle durch Krebs, ist es entscheidend, die Mechanismen der hämatogenen Verbreitung 2-4 abzugrenzen. Novel zirkulierenden Tumorzellen wurden aus diesem orthotopen syngenen Mausmodell der HCC Metastase 3 etabliert. Darüber hinaus sind die CTCs von diesem Modell abgeleitet konsequent zeigen eine erhöhte Tumorinitiation und metastatische Fähigkeit 3. Die zirkulierenden Tumorzellen isoliert mit dieser Methode kann sich als sehr wichtig zu sein, da sie dazu beitragen, spezifische molekulare Faktoren, Marker und mögliche therapeutische Ziele von Krebsmetastasen 2-4 entwirren. Diese Methode wurde bereits identifiziert, dass es erhöht Hochregulation von Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) und sein Rezeptor, c-Met in zirkulierenden Tumorzellen im Vergleich zudie primären Tumorzellen von HCC 3. Diese Ergebnisse bauen auf früheren Arbeiten zeigen, dass ein wichtiger Aspekt der Tumormetastasierung ist der zelluläre Prozess der epithelial-mesenchymale Transition 2-4,10. Weitere kennzeichnenden zirkulierenden Tumorzellen mit diesen neuartigen Modell wird unser Verständnis der komplizierten Mechanismen der Faktoren, die den Prozess so zur Entwicklung von mehr wirksame Verwaltung der HCC 1-3,10 führenden Förderung zu erhöhen.
Derzeit ist die am häufigsten verwendete Tiertumormodelle sind Maus-Xenograft-Tumormodelle, bei menschlichen Tumorzellen in immundefiziente Mäuse implantiert. Die in diesem Artikel beschriebene Modell hat wesentliche Vorteile, da es syngenen und ist daher geeignet für die Untersuchung der Rolle des Immunsystems bei der Tumormetastasierung 3. Dieses Modell hat sich als sehr gut reproduzierbar zur Isolierung, Kultivierung und das Studium von lebensfähigen zirkulierenden Tumorzellen 3 zu sein. Es hat daher tremendous Potenzial für die Bewertung der klinischen Anwendungen wie Screening, Diagnose, Prognose, Therapie-Monitoring und Identifizierung neuartiger therapeutischer Strategien. Eine Beschränkung der oben beschriebenen Methode ist, dass ein erheblicher Teil der BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen in Mäuse implantiert werden nicht überlebensfähig sein und somit nur ein kleiner Teil der Zellen lebensfähig und geschickt an Einführen Tumoren sein sekundären Standorten 3. Wir machen diese Einschränkung durch anfängliche Implantation von 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen pro Maus.
Im Ergebnis dieses orthotope syngenen Mausmodell des metastasierten soliden Organkrebs bietet eine gute Plattform für die Aufklärung der biologischen Mechanismen der Metastasenfähigkeit von zirkulierenden Tumorzellen im Blut von Krebspatienten 3 zugrunde. Dies wiederum dürfte zu vergießen neue Einblicke in die Mechanismen der Krebsmetastasen, weil Krebsmetastasen geschieht primär durch hematogenous verteilt 11-13. Somit in die Mechanismen der Krebsmetastasen gewonnen neuartigen Erkenntnisse werden entscheidend für die Entwicklung von neuen klinischen Anwendungen vorteilhaft 3,14,15 sein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz | (RS-5040) | Tip 0.20 x 0.12 mm |
| Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip | Roboz | (RS-5111) | 1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm |
| Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs) | Roboz | (RS-6501) | Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm |
| Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs) | Roboz | (RS-6503) | Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm |
| Jameson Caliper (Measures tumors) | Roboz | (RS-6466) | 80 mm/3 inch scale, chrome plated |
| Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp | Roboz | (RS-5852) | 23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings |
| Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures | Roboz | (RS-9861-36) | |
| Scalpel handle | Roboz | (RS-9884) | Solid |
| Littauer Stitch Sissors | Roboz | (RS-7074) | Length 4.5 inches |
| Brown needle holder, for easy suture tying | Roboz | (RS-7960) | Convex jaw, fine serrations |
| Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier | Roboz | (RS-9262) | safe, secure alternative method of wound closure |
| Instrument tray and lid | Roboz | RT-1350S | |
| Mini-clipper with detachable blade | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | For fast decontamination of micro-dissecting instruments. Instruments decontaminate within 15 sec. |
| Microinjection needles | VWR | BD305125 | 25G Needle |
References
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