Summary
Den metastatiska spridningen av cancer är den största orsaken till cancerrelaterade dödsfall. Vi erbjuder en djupgående beskrivning av vår överlevnad kirurgi metoder för att fastställa en "patient-liknande" ortotop syngen musmodell system för att studera mekanismerna för metastaser i tumörer solida organ.
Protocol
Etik Uttalande
Alla djurstudier har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) av Hunter College of The City University i New York.
Obs: Åtta BALB / c-möss användes i detta experimentella förfarande. Fem BALB / c-möss implanterades med 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus hepatocellulär karcinomceller för att framställa de primära tumörer. Tre BALB / c-möss utan implantationer användes som kontroller. BNL 1ME A.7R.1 är en mus hepatocellulär cancer cellinje som erhölls genom kemisk omvandling från murina icke-tumörogen hepatocyt-cellinje BNL CI.2. BNL 1ME A.7R.1 erhölls från American Type Culture CoUection (ATCC).
1. Pre-operation
- Se till att möss för alla överlevnad operationer är friska. För att säkerställa att möss är friska, inspektera tecken på uttorkning genom tält av huden. Använd inte möss med några tecken på sjukdom eller distress i dessa experiment.
- Väg möss så att de inte är underviktig. Säkerställa att vikten är minst 16-20 gram.
- Förbered 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 musen HCC celler för implantation per mus:
- Aspirera media från en 10 ml 60% - 70% sammanflytande cellkultur maträtt av BNL 1ME A.7R.1 mus HCC celler. Tvätta två gånger med 5 ml PBS. Tillsätt 2 ml trypsin till skålen och inkubera vid 37 ° C i en fuktad inkubator med luft och 5% CO2 under 5 min.
- Därefter pipetteras 10 | il med trypsin celler till en manuell hemocytometer för cellräkning under ett mikroskop med förstoringen 10X. Räkna det totala antalet celler som finns i de fyra stora hörnet fyrkanter och multiplicera med spädningsfaktorn med det totala antalet celler. Därefter delar med antalet fyrkanter räknades och multiplicera med 10 6 för cellkoncentrationen (celler per ml).
- Använda beräkningen, samla 5 miljoner celler per mus i steril1,5 ml mikrocentrifugrör. Etikett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Resuspendera 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus HCC-celler i 100 pl fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Håll dessa celler på is tills implantation i kirurgi.
- Utföra aktiviteter som krävs för framställning av möss för kirurgi såsom anestesi induktion och hår klippning bort från steril utrustning och material för att undvika kontaminering.
- Inducera generell anestesi hos möss genom inhalation av isofluran med användning av en isofluran förångare tillsammans med syre vid en konstant koncentration flödeshastighet av 1 L per minut (ung. 2,1%). Obs: Systemet är självständiga och har en precision Vaporizer, en syretillförsel och en kolkanistern som är kopplad till en andningskrets som krävs för gas / bedövningsmedel rensning.
- Se till att anestesi är tillräckliga för att förhindra djuret från att genomgå smärta under operationen. Utför toe-nypa och observera djur för icke-ansvarssiveness att bekräfta anestesi.
- Vid denna tidpunkt slår ventillinjen, försegla till boxen och öppna för noskonen.
- Så snart musen bedövas, applicera en liten mängd av en oftalmisk salva till hornhinnorna som en förebyggande åtgärd mot uttorkning och skador.
- Därefter flyttar djuret till beredningen området, med noskonen korrekt placerad och ansluten (för underhållsanestesi). Förbered platsen för det kirurgiska snittet för kirurgi genom hårborttagning vid denna beredning område.
- Se till att området av kirurgi är vid ett läge fritt från all annan aktivitet.
- Se till att arbetsytan är robust och lämpligt saneras, obesudlade och fritt från plotter innan operationen. Placera en steril bit linne eller kirurgisk bricka över den.
- Se till att operationsområdet är tillgänglig för endast personer som utför operationen. Se till att den kirurgiska rummet städas och sveptes med ett lämpligt rengöringsmedel och sprutades med en lämplig disinfectant.
- Se till att det också är placerad bort från dörrar och fönster som luftströmmar kan sprida damm leder till förorening av webbplatsen.
- Utför överlevnad kirurgi med sterila instrument. Antingen blöt instrument i ett desinfektionsmedel enligt tillverkarens rekommendation eller autoklav. Använda grundläggande sterila förnödenheter som är klar för användning.
- Separata instrument efter funktion för att förhindra förorening av sterila områden.
- Raka approximativt en tum runt platsen för snittet (mittlinjeincision) för att komma åt levern hos djuret. Ta bort hår från djuret bort från stället för kirurgi.
- Efter rakning, skrubba området med en tvål desinfektionsmedel (Betadine kirurgiska buskmarker) och tvätta överskottet desinfektionsmedel bort med steril PBS-lösning. Gör detta flera gånger, med hela scrub processen varar ca 5 min. Ta bort och kastas de använda handskar.
- Efteråt, byt till skyddskläder såsom surgical klänning, skrubba topp, och ansiktsmask. Nästa, desinficera händerna med rätt skrubba lösning innan du sätter på operationshandskar. Anmärkning: Detta är ett nödvändigt steg för att förhindra att utsöndring och förorenar det kirurgiska stället med potentiella föroreningar.
2. Kirurgi
- Ge en extern värmekälla för värme under hela perioden av anestesi. Djuret kan uppleva några hypotermi eftersom anestesi orsakar störningar i termo; därför bibehålla kroppstemperaturen.
- Placera musen på rygg under hela operationen.
- Fäst främre ben, bakbenen och svansen på musen till operationsbordet med bitar av kirurgisk tejp.
- Gör en rak linje snitt omedelbart sämre än xyphisternum.
- Använd en steril självhållande kirurgisk sårhake för att exponera levern.
- Med en spruta med en 20G nål, långsamt och försiktigt injicera 100 pl PBS innehållande 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1mus HCC celler i höger lob i levern.
- Efter avlägsnande av nålen, tillämpa en steril bomullstopp under minst en minut för att stoppa eventuella blödningar på grund av hög kärl i levern.
- Stäng den subkutana vävnaden med en absorberbar sutur följt av huden stängning med hjälp av kirurgiska klämmor. Därefter, rengöra såret en gång med Betadine scrub. Obs: Detta kommer att säkerställa stängningen av operationssåret.
- Subkutant ge 100 pl normal koksaltlösning.
3. Post-kirurgi
- Omedelbart efter operation, överföra musen till en ren bur med en post-operation identitetskort att meddela övervakningsarbeten musen skick. Ge mat och vatten. Obs: Enligt vår erfarenhet, en mus som just har opererats kommer att klara sig bäst om inrymt ensam med våt mat och vatten för den inledande 24-timmarsperiod efter operationen.
- Håll djuret varmt med en värmelampa som genererar värmen inte överträffar 38 ºC. Usyns en termometer för att mäta temperaturen tills musen är helt återställd.
- Hus djuret i en bur företrädesvis med papper strö för att säkerställa komfort.
- Efter initial återhämtning, övervaka djuret tecken på obehag, blödning, smärta och ångest. Ge buprenorfin (0,05 -0,1 mg / kg) för att lindra smärta. Noggrant övervaka aktivitet, beteende och utseende, samt vatten och livsmedelskonsumtion under ca 2 timmar. Om ambulatorisk, flytta djuret tillbaka till området för regelbunden normal bostad hos möss och fortsätta att övervaka med 6-12 timmars intervall för 24 timmar efter operationen. Utför en viktkontroll om så önskas.
- Men om djuret har problem återhämtar vidta lämpliga understödjande vårdåtgärder. Om möss inte kan återhämta sig, humant euthanize möss via CO 2 kvävning och halsdislokation. Följ godkända institutionella riktlinjer för dödshjälp.
- Efter operationen, kontrollera om kliniska tecken på HCC som vanligtvis observable som betydande minskning av hull poäng. Obs: På denna punkt har en primärtumör sannolikt utvecklas i levern och metastaser fyndigheter har troligen utvecklats i lungorna.
- Vid denna punkt, offra alla möss (försöks- och kontroll) deltar i experimentet genom humana dödshjälp. Utsätta möss för kvävning med koldioxid: mycket långsamt släppa koldioxid in i kammaren under en period av 5 -10 min. Detta kommer att leda till andningsstillestånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lever av Balb / c-möss implanterades med 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus HCC-celler. Kliniska tecken på HCC utveckling kunde observeras 63 dagar efter operationen. Följaktligen möss humant avlivas. Obduktion utfördes på euthanized möss. Lungor och lever var opererande och en noggrann brutto undersökning genomfördes för att identifiera makroskopiska tumörer. I en mus, var en ytlig tumör observerades på ytan av levern med viss infästning i bukväggen (Figur 1A). I en andra mus, var en onormalt utseende lever observerades. Abnormiteten ser mycket starkt som en ytlig tumör (Figur 1B). Som förväntat, möss i kontrollgruppen utan någon implantation av BNL 1ME A.7R.1 HCC-celler utvecklade inga tumörer, vilket framgår av en lever (figur 1D) och lungorna (figur 1E) från en kontrollmus. Även lungorna från mössen med tumörer såg något onormalt, displaying områden hemorragisk nekros (Figur 1C). Baserat på tidigare erfarenheter, kan dessa lungor hysa metastaserande insättningar 3.
Figur 1. Brutto undersökning av tumören och metastas. Balb / c-möss implanterades med 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 tumörceller och avlivades 63 dagar senare. Representativa levertumörer observerats fotograferades och visas här. (A och B) visar båda ytliga levertumörer. (C) är lungor från tumörceller implanterade möss. (D) visar levern hos en mus kontroll. (E) anger lungorna hos en kontroll mus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk av metoderna för en "patient-liknande" ortotop syngena musmodell av hepatocellulär cancer metastasering. När sövda, är muslever implanteras med 5 x 106 BNL 1ME A.7R.1 mus hepatocellulär cancer (HCC) celler. När kliniska tecken på HCC är observerbar är djur avlivades genom humana dödshjälp (utsätts för koldioxid kvävning, följt av perkutan intrakardiära exsanguination och halsdislokation). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln en fördjupad beskrivning av metoden ges som nyligen rapporterades av Ogunwobi och kollegor lyckas med inrättandet av en ortotopisk syngena musmodell av HCC metastaser (Figur 2) 3. Utnyttjandehastigheten av tumörer för denna procedur är generellt hög. Vi har tidigare observerat en tumör ta hastighet av 100% 3. Däremot kan ta hastigheten vara varierar beroende på kompetens utredaren. I en nyligen experiment som utförs av en ny doktorand under utbildning, var utnyttjandetakten tumören så låg som 40%. Även om de flesta experiment avslutas vid 4 - 6 veckor på grund av nedgång i kondition poäng, vi tror av erfarenhet med subkutan implantation av samma celler i samma möss som primära tumörer kan fastställas med 2 - 3 veckor. Vi förväntar oss vanligen att se en tumör knuta från ett lyckat experiment. Och även om vi förväntar oss lungmetastas utvecklas mellan 4 - 6 veckor, är det conceivkan att tumör i levern kan ske mycket tidigare.
Bra kirurgiska tekniker och aseptiska förhållanden är avgörande för framgången för denna överlevnad kirurgi metod. Möss som används för överlevnad kirurgi bör vara friska. Vägning före och efter operation är en god praxis. De genomsnittliga pre-kirurgi vikterna hos mössen som används i eller senaste experiment var 18 gram, och vid den experimentella slutpunkten (63 dagar efter kirurgisk implantation) deras genomsnittliga vikten var endast 22 gram. En vinst på endast 4 gram i vikt under denna tidsperiod är sannolikt eftersom det fanns en viss nedgång i viktökning på grund av systemisk sjukdom från tumören. Vi skulle ha haft en mer objektiv bedömning av detta hade vi mätte mus vikt en eller två gånger i veckan under hela experimentet. Detta rekommenderas bästa praxis.
Som sammanfattas i figur 2, bör möss vara tillräckligt sövd innan operationen och under hela perioden av kirurgi för att undvika smärtan nd nöd. Området bör vara fri från all röran och tillgång bör endast vara tillgängliga för dem som utför operationen. Både operationen området samt de instrument som används bör alla vara steril.
En viktig steg för att lyckas med implantation är framställningen av BNL 1ME A.7R.1 mus HCC celler som skall implanteras. Under förberedelserna, är det viktigt att undvika kontaminering av samlingen av cellerna från sammanflytande cellkulturer rätter. Dessa steg bör utföras i en cellkultur huva under sterila betingelser. En cellräkning bör också göras för att se 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus HCC-celler har samlats i en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör per mus som återsuspenderas i 100 pl fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Trypanblått färgning kan också eventuellt utföras för att bekräfta livsdugligheten hos cellerna. Dessa celler bör hållas på is inte längre än 2 h före implantation i levrarna hos möss.
_content "> Implanteringen av cancercellerna bör hanteras med försiktighet på grund av den känsliga naturen av levern (Figur 2). Under injektion av cancercellerna, undvika alltför djup en punktering som kan resultera i att nålen går igenom hela levern . Det är viktigt att injicera cancercellerna långsamt och försiktigt. Å andra sidan kommer för grunt en punktering med nålen före injektion sannolikt förorsaka spill av cancercellerna som injicerats ut in i peritonealhålan. Dessutom, efter avlägsnande av nålen, Det finns alltid en potential på orgeln blödning ut på grund av dess höga vaskularitet. Därför tillämpar en steril bomullstopp under minst 1 minut rekommenderas. Skötsel och uppmärksamhet kommer att säkerställa den högsta implantation framgång. Djuret ska också lämnas en extern värmekälla hela förfarandet som hypotermi är ett stort problem som orsakar störningar i värmereglering under anestesi Post-kirurgi., bör djuret övervakas förnågra tecken på obehag eller smärta vid vilken tidpunkt lämplig vård ges. Om musen inte kan återhämta sig från operationen, bör det humant avlivas.Som cancermetastaser är den främsta orsaken till dödsfall i cancer, är det viktigt att beskriva mekanismerna för hematogen spridning 2-4. Nya cirkulerande tumörceller etablerades från denna orthotopic syngena musmodell av HCC metastaser 3. Dessutom CTCs härrör från denna modell genomgående visar ökad tumörinitiering och metastaserande förmåga 3. De cirkulerande tumörceller som isolerats med hjälp av denna metod kan visa sig vara mycket viktigt, eftersom de hjälper till att reda ut specifika molekylära faktorer, markörer och möjliga terapeutiska mål för cancermetastas 2-4. Denna metod har redan upptäckt att det är ökad uppreglering av hepatocyttillväxtfaktor (HGF) och dess receptor, c-Met i cirkulerande tumörceller i jämförelse medprimärtumörceller av HCC 3. Dessa resultat bygger på tidigare arbete visar att en viktig aspekt av tumörmetastaser är den cellulära processen för epitel-mesenkymala övergång 2-4,10. Ytterligare kännetecknande cirkulerande tumörceller med hjälp av denna nya modell kommer att öka vår förståelse av de intrikata mekanismer för faktorer som främjar processen vilket leder till utvecklingen av mer effektiv hantering av HCC 1-3,10.
För närvarande är de mest använda djurtumörmodeller är mus xenografttumörmodeller där humana tumörceller implanteras i immunbrist möss. Den modell som beskrivs i den här artikeln har viktiga fördelar eftersom det är syngen och är därför lämplig för att studera rollen av immunsystemet i tumörmetastas 3. Denna modell har visat sig vara mycket reproducerbar för att isolera, odling, och studera livsdugliga cirkulerande tumörceller 3. Det har därför tremenbelt potential för att utvärdera kliniska tillämpningar som screening, diagnos, prognostisering, terapi övervakning och upptäckten av nya terapeutiska strategier. En begränsning av den metod som beskrivs ovan är att en betydande del av BNL 1ME A.7R.1 mus HCC celler implanteras i möss kommer att vara oförmögna att överleva och således endast en liten del av cellerna kommer att vara livskraftiga och skickliga på att införa tumörer vid sekundära platser 3. Vi står för denna begränsning genom initial implantation av 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus HCC celler per mus.
Sammanfattningsvis, detta orthotopic syngena musmodell av metastaserad fast organ cancer ger en bra plattform för att belysa de biologiska mekanismerna bakom metastaserande förmåga att cirkulerande tumörceller i blodet hos patienter 3 cancerpatienter. Detta i sin tur kommer sannolikt att kasta nya insikter mekanismerna för cancermetastas eftersom cancermetastaser sker främst via hematogenous spred 11-13. Nya insikter därmed fått in mekanismer cancermetastaser kommer att vara avgörande för utvecklingen av nya positiva kliniska tillämpningar 3,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz | (RS-5040) | Tip 0.20 x 0.12 mm |
| Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip | Roboz | (RS-5111) | 1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm |
| Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs) | Roboz | (RS-6501) | Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm |
| Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs) | Roboz | (RS-6503) | Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm |
| Jameson Caliper (Measures tumors) | Roboz | (RS-6466) | 80 mm/3 inch scale, chrome plated |
| Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp | Roboz | (RS-5852) | 23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings |
| Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures | Roboz | (RS-9861-36) | |
| Scalpel handle | Roboz | (RS-9884) | Solid |
| Littauer Stitch Sissors | Roboz | (RS-7074) | Length 4.5 inches |
| Brown needle holder, for easy suture tying | Roboz | (RS-7960) | Convex jaw, fine serrations |
| Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier | Roboz | (RS-9262) | safe, secure alternative method of wound closure |
| Instrument tray and lid | Roboz | RT-1350S | |
| Mini-clipper with detachable blade | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | For fast decontamination of micro-dissecting instruments. Instruments decontaminate within 15 sec. |
| Microinjection needles | VWR | BD305125 | 25G Needle |
References
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765 (2013).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
- Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
- Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
- Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
- Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).
