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Medicine

“以病人为像”肝癌原位同源小鼠模型的癌转移

doi: 10.3791/52858 Published: October 24, 2015

Summary

癌症的转移扩散是癌症相关死亡的主要原因。我们提供了一个深入的描述,我们赖以生存的手术方法,为建立“以病人为像”原位同基因小鼠模型系统研究的实质器官肿瘤转移的机制。

Protocol

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道德守则
所有的动物研究批准了纽约市立大学亨特学院的机构动物护理和使用委员会(IACUC)。

注意:八只BALB / c小鼠在本实验过程中使用。五只BALB / c小鼠植入5×10 6,BNL 1ME A.7R.1小鼠肝癌细胞产生的原发肿瘤。三只BALB / c小鼠,没有植入用作对照。 BNL 1ME A.7R.1是从鼠非致瘤性肝细胞细胞系,BNL CL.2衍生由化学转变该鼠肝癌细胞株。 BNL 1ME A.7R.1从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。

1.预手术

  1. 确保小鼠全部存活手术是健康的。为了确保小鼠是健康的,由皮肤的隆起检查脱水的迹象。不要用小鼠疾病或D的任何证据istress在这些实验中。
  2. 称取小鼠以确保它们不减持。确保重量至少16-20克。
  3. 准备5×10 6 BNL 1ME A.7R.1小鼠肝癌细胞每只小鼠植入:
    1. 抽吸媒体从10ml的60% - BNL 1ME A.7R.1小鼠肝癌细胞70%汇合细胞培养皿。用5ml PBS洗涤两次。加2ml胰蛋白酶的菜和在培养箱与空气和5%的CO 2 5分钟在37℃。
    2. 接着,移液管加入10μl胰蛋白酶消化细胞分化成在显微镜下在10倍的放大倍率的手动血细胞计数用于细胞计数。算在四个大角落正方形中发现的细胞的总数和由细胞的总数乘以稀释因子。然后,通过平方计数的数分裂并通过10 6乘以为细胞浓度(每毫升的细胞)。
    3. 使用的计算,收集每只小鼠在灭菌的5百万个细胞1.5ml微量管。标签的1.5 ml离心管中。
  4. 重悬在100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5×10 6,BNL 1ME A.7R.1小鼠肝癌细胞。保持这些细胞在冰上,直到植入手​​术。
  5. 进行必要的准备小鼠外科手术如麻醉诱导和头发修剪远离消毒设备和材料,以避免污染的活动。
  6. 使用与氧一起的异氟烷蒸发器以1L每分钟(约2.1%)的恒定浓度流速诱导小鼠通过吸入异氟烷麻醉。注意:该系统是自立,和包括一个精密汽化器,氧的供应和链接到所需要的气/麻醉剂清除呼吸回路一活性炭罐。
  7. 确保麻醉足以防止动物从手术过程中经历的疼痛。执行脚趾捏,观察动物的非responsiveness确认麻醉。
  8. 此时,切换阀管线,密封的框和开放到鼻锥。
  9. 只要鼠标被麻醉,敷眼软膏的一个微小的量,以角膜为从干燥和损坏防患于未然。
  10. 接着,将动物以​​制备区域,用鼻锥体正确地放置和连接的(用于维持麻醉)。准备手术切口进行手术通过脱毛的部位,在这个准备区。
  11. 确保手术的区域是在不含所有其他活动的位置。
  12. 确保工作表面坚固,并适当消毒,未弄脏的,易用的手术前。放置一个无菌的一块亚麻或手术托盘在它的。
  13. 确保手术视野仅可用于进行外科手术的人员。确保手术室进行清洗和清扫用合适的清洁剂,并用适当的disinfectant。
  14. 确保它也位于远离门窗作为气流可以传播粉尘导致现场的污染。
  15. 执行生存手术无菌器械。或者,根据制造商的建议,或高压釜浸泡仪器消毒剂。使用基本无菌物品是可以使用了。
  16. 根据功能的不同工具,以帮助防止无菌区域受到污染。
  17. 剃周围的切口(正中切口)站点约1英寸访问动物的肝脏。从动物手术的部位取下的头发了。
  18. 剃须后,擦洗肥皂消毒剂(优碘外科洗手)的区域,并用无菌PBS液清洗多余的消毒液了。执行这几次,与整个磨砂工艺处理大约持续5分钟。卸下并丢弃用过的手套。
  19. 后来,改为防护服,如surgic人长衫,磨砂顶和面罩。接着,把手术手套前,双手消毒用适当的溶液擦洗。注:这是一个必要的步骤,以防止脱落,污染手术部位与潜在的污染物。

2.手术

  1. 提供一个外部热源温暖整个麻醉的整个时期。动物可能会遇到一些低体温是因为麻醉导致体温调节障碍;因此,维持体温。
  2. 莱鼠标在整个手术的背面。
  3. 修复前肢,后肢和鼠标尾部的手术台与手术磁带件。
  4. 做一个直线切口立即逊于xyphisternum。
  5. 使用无菌的自固手术用牵引器具,以暴露肝脏。
  6. 与具有注射器20G针,缓慢而小心地注入含有5×10 6,BNL 1ME A.7R.1 100微升PBS小鼠肝癌细胞到肝脏的右叶。
  7. 除去针后,应用消毒棉签至少1分钟,以停止任何潜在的出血由于肝脏高血管。
  8. 关闭皮下组织与可吸收缝合线之后皮肤缝合手术用夹子。随后,优碘擦洗一次清理伤口。注意:这将确保手术伤口闭合。
  9. 皮下给予100微升生理盐水。

3.后手术

  1. 立即手术后,鼠标转移到一个干净的笼子与手术后的身份证,以通知的鼠标状态照料。提供食物和水。注:根据我们的经验,刚刚动过手术的境遇最好的,如果单独住用湿的食物和水的最初24小时内术后鼠标。
  2. 保持动物温暖,热灯产生的热量不超过38ºC。 ü瑟温度计来测量温度,直到鼠标完全恢复。
  3. 众议院的动物关在笼子里最好用纸张的床上用品,以确保舒适。
  4. 初步恢复后,监测动物的不适,出血,疼痛和痛苦的迹象。给予丁丙诺啡(0.05 -0.1毫克/千克),以减轻疼痛。密切监控活动,行为和外观,以及水和食物消耗量为约2小时。如果动态,将动物回区域老鼠经常正常的住房,并持续监控在6-12小时,间隔24小时后手术。如果需要执行重量检查。
  5. 但是,如果动物是有问题休养,采取适当的支持治疗措施。如果小鼠无法恢复,人道安乐死通过CO 2窒息和颈椎脱位鼠标。按照安乐死认可机构的指导方针。
  6. 手术后,检查肝癌的临床证据通常是observab乐为显著减少,体况评分。注意:在这一点上,初级肿瘤可能已经开发了在肝脏和转移性沉积物在肺部有可能开发的。
  7. 此时,牺牲参与本实验由人道的安乐死所有小鼠(实验和对照)。若使小鼠二氧化碳窒息:非常缓慢地释放二氧化碳进入室在一段5 -10分钟。这将导致呼吸骤停。

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Representative Results

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Balb / c小鼠的肝脏植入5×10 6,BNL 1ME A.7R.1小鼠肝癌细胞。肝癌发展的临床证据是观察到63天后手术。因此,将小鼠安乐死。尸体剖检在安乐死的小鼠进行的。肺和肝脏切除和仔细肉眼检查以鉴定宏观肿瘤。在一个鼠标,浅表肿瘤观察到一些附着到腹壁图1A)的肝脏的表面上。在第二个鼠标,异常好看肝脏进行了观察。异常非常强烈地看起来像一个浅表肿瘤图1B)。正如预期的那样,小鼠,对照组,没有植入BNL 1ME A.7R.1肝癌细胞开发无肿瘤,如由来自对照小鼠肝脏图1D)和肺图1E)。此外,从小鼠肿瘤肺看起来有些异常,显示出血性坏死的荷兰国际集团的区域图1C)。根据以往的经验,这些肺中,可能窝藏转移存款3。

图1
图1大体检查肿瘤和转移。的Balb / c小鼠植入5×10 6,BNL 1ME A.7R.1肿瘤细胞和安乐死63个天以后。观察拍照,并在这里显示代表肝脏肿瘤。(A和B)都显示出肤浅的肝脏肿瘤。(C)是肺部移植小鼠的肿瘤细胞。(D)显示对照小鼠的肝脏。(E)表示控制的肺鼠标。 请点击此处查看该图的放大版本。


图2.一个“患者样”原位同源小鼠肝癌转移的模型的方法学。一旦麻醉,小鼠肝脏被注入5×106 BNL 1ME A.7R.1小鼠肝细胞癌(HCC)的细胞。当肝癌的临床证据是可观察的,动物是人道的安乐死(经二氧化碳窒息,其次是经皮腔内放血和颈椎脱位)处死。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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在这篇文章中进行了深入描述的方法的是考虑到最近报道Ogunwobi和成功地建立了肝癌转移的原位同基因小鼠模型的同事2)3。肿瘤的接受率在此过程中普遍偏高。我们先前观察到的100%3肿瘤接受率。然而,接受率可以根据研究者的能力是可变的。在由下一个训练新研究生完成的最新的实验中,将肿瘤接受率较低,为40%。尽管大多数实验终止于4 - 由于在体况评分下降6周,我们认为从与同一细胞皮下植入到了原发肿瘤可以通过2建立相同的小鼠的经历 - 3周。我们通常希望看到一种肿瘤结节从一个成功的实验。虽然我们预计肺转移至4之间发展 - 6周,这是conceiv能够肿瘤在肝脏可能发生得更早。

好的外科技术和无菌条件是必不可少的,此生存手术方法的成功。用于生存手术的老鼠应该是健康的。称重前,后手术是一个很好的做法。用在小鼠的平均手术前的重量或最近的实验为18克,并且在实验结束点(63天后手术植入)其平均重量只有22克。只有4克的重量在这段时间内增益可能是因为当时在体重增加略有下降,由于从肿瘤的全身性疾病。我们将不得不我们测量小鼠体重一次或每周两次在整个实验中这是一个比较客观的评价了。这是建议的最佳实践。

作为总结在图2中,小鼠应适当的手术手术,以避免疼痛的期间之前和整个麻醉第二困扰。该区域应无杂波,并获得应该只提供给那些进行手术。无论是手术区域以及所使用的仪器都应该是无菌的。

植入成功的一个重要步骤是BNL 1ME A.7R.1小鼠肝癌细胞的制备被植入。在制备过程中,关键的是要避免从汇合的细胞培养物的菜肴的单元的集合的污染。这些步骤应在无菌条件下的细胞培养罩来进行。甲细胞计数也应完成,以确保5×10 6,BNL 1ME A.7R.1小鼠HCC细胞已收集在每只小鼠被重新悬浮在100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的无菌1.5 ml离心管。台盼蓝染色,也可任选地进行,以确认细胞的活力。这些细胞应保持在冰上不再超过植入小鼠的肝脏之前2小时。

_content“>癌细胞的植入应小心处理由于肝脏的细腻性图2),在注射了癌细胞的,避免过深的穿刺可能导致针经历整个肝脏那它必须缓慢且小心地注入癌细胞。在另一方面,过浅一个与注射前的穿刺很可能会导致注入出来进入腹膜腔的癌细胞的溢出。另外,删除针后,总是有器官渗出的电位由于其高血管,因此,施加消毒棉签为至少1分钟,推荐。护理和注意力将确保植入的成功率最高的动物也应提供一个外部热源在整个过程作为低温是一个主要问题在麻醉期间引起体温紊乱。手术后,动物应被监视不适或疼痛的迹象,此时适当的护理应给予。如果鼠标无法从手术中恢复体力,应该安乐死。

作为癌转移是癌症死亡的首要原因,至关重要的是要描绘血传播2-4的机制。新型循环肿瘤细胞,建立了从肝癌转移3这原位同基因小鼠模型。而且,从这个模型得出的检验中心一致表明增加肿瘤发生和转移的能力,3。的循环肿瘤细胞用此方法分离可能被证明是非常重要的,因为它们有助于揭开特定分子因素,标志物和癌症转移2-4的可能的治疗目标。这种方法已经确定,由于相比有增加的肝细胞生长因子(HGF)及其受体,c-Met的上调在循环肿瘤细胞肝癌3的原发肿瘤细胞。这些结果建立在先前的工作证明了肿瘤转移的一个重要方面是上皮-间质转化2-4,10的细胞过程。使用这种新型模式的进一步特征循环肿瘤细胞会增加我们的促进从而导致肝癌1-3,10更有效地管理发展的过程因素 ​​的复杂机制的理解。

目前,最广泛使用的动物肿瘤模型是小鼠异种移植肿瘤模型,其中人肿瘤细胞被植入免疫缺陷小鼠。这篇文章中描述,该模型具有重要的优点,因为它是同基因的,因此,适用于研究在肿瘤转移3的免疫系统的作用。该模型已被证明是用于分离,培养,和可行的循环肿瘤细胞的3就读高度重现。因此,它已经tremendous潜力评价像筛查,诊断,预测,治疗监测和发现新的治疗策略的临床应用。上述方法的一个限制是,BNL 1ME A.7R.1小鼠肝癌细胞植入小鼠显著部分将是不能存活的并且因此细胞中,只有一小部分将是可行的,并擅长于引入的肿瘤在辅助站点3。我们考虑这个限制由5×10 6,BNL 1ME A.7R.1每只小鼠小鼠肝癌细胞最初植入。

最后,转移性实体器官癌此原位同源小鼠模型提供了用于阐明在癌症患者3的血液循环肿瘤细胞的转移能力潜在的生物学机制的良好平台。这反过来可能会流下新的见解癌症转移的机制,因为癌细胞转移,通过HEMA主要发生togenous蔓延11-13。从而获得了进入癌细胞转移的机制,新的见解将是新颖有益的临床应用3,14,15的发展是至关重要的。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Tweezer  Roboz (RS-5040) Tip 0.20 x 0.12 mm
Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip Roboz (RS-5111) 1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm
Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs) Roboz (RS-6501) Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm
Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs) Roboz (RS-6503) Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm
Jameson Caliper (Measures tumors) Roboz (RS-6466) 80 mm/3 inch scale, chrome plated 
Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp Roboz (RS-5852) 23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings
Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures Roboz (RS-9861-36)
Scalpel handle  Roboz (RS-9884) Solid
Littauer Stitch Sissors Roboz (RS-7074) Length 4.5 inches
Brown needle holder, for easy suture tying Roboz (RS-7960) Convex jaw, fine serrations
Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier Roboz (RS-9262) safe, secure alternative method of wound closure
Instrument tray and lid Roboz RT-1350S
Mini-clipper with detachable blade Roboz (RS-5903)
Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer Roboz Ds-400, Ds-401, DS-501 For fast decontamination of micro-dissecting instruments.   Instruments decontaminate within 15 sec. 
Microinjection needles VWR BD305125 25G Needle

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References

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Das, D. K., Durojaiye, V., Ilboudo, A., Naidoo, M. K., Ogunwobi, O. A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis. J. Vis. Exp. (104), e52858, doi:10.3791/52858 (2015).More

Das, D. K., Durojaiye, V., Ilboudo, A., Naidoo, M. K., Ogunwobi, O. A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis. J. Vis. Exp. (104), e52858, doi:10.3791/52858 (2015).

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