Summary
Metastatisk spredning av kreft er den viktigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall. Vi gir en grundig beskrivelse av vår overlevelse kirurgi metodikk for å etablere en "pasient-like" orthotopic syngenisk musemodellsystem for å studere mekanismene for metastase i organ svulster.
Protocol
Etikk Statement
Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Hunter College of The City University of New York.
Merk: Åtte BALB / c-mus ble anvendt i denne forsøksprosedyre. Fem BALB / c-mus ble implantert med 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus hepatocellulært karsinom celler til å produsere primære svulster. Tre BALB / c-mus uten noen implantasjoner ble anvendt som kontroller. BNL 1ME A.7R.1 er en muse leverkreft cellelinje som ble utledet ved kjemisk transformasjon fra murine ikke-tumorigent hepatocytter cellelinje BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC).
1. Pre-kirurgi
- Sørg for at mus for alle overlevelses operasjoner er sunt. For å sikre at mus er sunt, inspisere tegn på dehydrering ved telting i huden. Ikke bruk mus med noen tegn på sykdom eller distress i disse forsøkene.
- Veie mus for å sikre at de ikke er undervektige. Sørg for at vekten er minst 16-20 gram.
- Forbered 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 muse HCC celler for implantasjon per mus:
- Sug media fra en 10 ml 60% - 70% konfluent cellekultur rett av BNL 1ME A.7R.1 muse HCC celler. Vask to ganger med 5 ml PBS. Tilsett 2 ml trypsin til fatet og inkuber ved 37 ° C i en fuktet inkubator med luft og 5% CO2 i 5 min.
- Deretter ble 10 ul pipettes trypsinert celler i et hemocytometer manual for celletelling under et mikroskop ved forstørrelse på 10X. Telle det totale antall celler som finnes i de fire hjørne store kvadrater og multiplisere fortynningsfaktoren av det totale antall celler. Deretter deler med antall kvadrater telles og multiplisere med 10 6 for cellekonsentrasjonen (celler pr ml).
- Ved hjelp av beregning, å samle 5 millioner celler per mus i sterilt1,5 ml mikrosentrifugerør. Etikett 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Resuspender 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus HCC celler i 100 ul av fosfatbufret saltvann (PBS). Oppbevar disse cellene på is til implantasjon i kirurgi.
- Utføre aktiviteter som er nødvendige for utarbeidelse av mus for kirurgi som anestesi induksjon og hår klipping unna sterilt utstyr og materialer for å unngå forurensning.
- Indusere generell anestesi i mus ved inhalering av isofluran ved hjelp av en isofluran fordamper sammen med oksygen ved en konstant konsentrasjon strømningshastighet på 1 liter per minutt (ca. 2,1%). Merk: Systemet er selvhjulpne, og inkluderer en presisjon fordamper, en oksygentilførsel og en kull beholder som er koblet til en pustekrets nødvendig for gass / bedøvelse scavenging.
- Påse at anestesi er tilstrekkelig til å hindre dyret fra å gjennomgå smerte under operasjonen. Utfør tå-pinch og observere dyret for ikke-ansvarssiveness å bekrefte anestesi.
- På den tiden, slår ventilen linje, segl til boksen og åpne for nesen membran.
- Så snart musen er bedøvet, påfør en liten mengde av et oftalmisk salve til hornhinner som et forebyggende tiltak mot uttørking og skader.
- Deretter flytter dyret til forberedelse området, med nesen membran riktig plassert og koblet (for vedlikehold anestesi). Forberede området for den kirurgiske innsnitt for kirurgi ved hårfjerning på dette preparatet området.
- Sørg for at området kirurgi er på et sted fritt for all annen aktivitet.
- Pass på at arbeidsunderlaget er solid og hensiktsmessig renses, unsoiled og ryddig før operasjonen. Plasser en steril stykke lin eller kirurgisk brett over den.
- Sørg for at det operative feltet er tilgjengelig for kun personer som utfører operasjonen. Sørg for at den kirurgiske rommet er renset og feide med en passende rengjøringsmiddel og sprayet med en passende desictant.
- Sørg for at det også er plassert vekk fra dører og vinduer som luftstrømmer kan spre støv fører til forurensning av området.
- Utfør overlevelse kirurgi med sterile instrumenter. Enten suge instrumenter i et desinfeksjonsmiddel i henhold til produsentens anbefaling eller autoklav. Bruke grunnleggende sterilt utstyr som er klar til bruk.
- Separate instrumenter i henhold til funksjon for å hindre forurensning av sterile områder.
- Barbere omtrent en tomme rundt incisjonsstedet (midtlinjesnitt) for å få tilgang til leveren på dyret. Fjern hår fra dyret vekk fra stedet av kirurgi.
- Etter barbering, skrubbe området med en såpedesinfeksjonsmiddel (Betadine kirurgisk kratt) og vaske overflødig desinfiserende unna med steril PBS løsning. Utfør dette flere ganger, med hele scrub prosessen varig ca 5 min. Ta ut og forkastet de brukte hansker.
- Etterpå endre til verneklær som surgical kappe, skrubb toppen, og ansiktsmaske. Deretter desinfisere hendene med skikkelig skrubb løsning før du tar på operasjonshansker. Merk: Dette er et nødvendig skritt for å hindre Shedding og forurenser kirurgiske området med potensielle forurensninger.
2. kirurgi
- Gi en ekstern varmekilde for varme i hele perioden av anestesi. Dyret kan oppleve noen hypotermi fordi anestesi forårsaker forstyrrelser av termoregulering; derfor, vedlikeholde kroppstemperaturen.
- Lå musen på ryggen gjennom hele operasjonen.
- Fest forgrunnen lemmer, baklemmene og hale av musen til operasjonen bordet med biter av kirurgiske tapes.
- Lag en rett linje snitt umiddelbart dårligere til xyphisternum.
- Bruk en steril selv beholde kirurgisk retractor å eksponere leveren.
- Med en sprøyte med en 20G nål, sakte og forsiktig injisere 100 mL PBS som inneholder 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1mus HCC celler i den høyre flik av leveren.
- Når nålen er fjernet, bruke en steril bomullspinne i minst 1 min for å stoppe eventuell blødning på grunn av høy vaskularitet i leveren.
- Lukk underhud med en absorberbare sutur fulgt av hudlukking hjelp kirurgiske klipp. Deretter rense såret igjen med betadine skrubb. Merk: Dette vil sikre nedleggelsen av operasjonssåret.
- Subkutant gi 100 ul normal saltvannsoppløsning.
3. Post-kirurgi
- Umiddelbart etter operasjonen, overføre musen til et rent bur med en post-kirurgi legitimasjon for å varsle vaktmester på musen tilstand. Skaffe mat og vann. Merk: I vår erfaring, en mus som nettopp har gjennomgått kirurgi vil klare seg best hvis plassert alene med våt mat og vann til den innledende 24-timers periode etter operasjonen.
- Holde dyret varm med en varmelampe som genererer varme ikke overgå 38 ºC. USE et termometer for å måle temperaturen til musen er helt frisk.
- Huset dyret i et bur helst med papir sengetøy for å sikre komfort.
- Etter innledende utvinning, overvåke dyret etter tegn til ubehag, blødning, smerte og ubehag. Gi buprenorfin (0,05 -0,1 mg / kg) for å lindre smerte. Nøye overvåke aktiviteten, oppførsel og utseende, samt vann og matforbruk i omtrent 2 timer. Hvis ambulerende, flytter dyret tilbake til området for vanlig normal bolig av mus og fortsette å overvåke på 6-12 timers mellomrom i 24 timer etter operasjonen. Utfør en vekt sjekk hvis ønskelig.
- Men hvis dyret har problemer restituerte, ta nødvendige støttende pleie handlinger. Dersom musene ikke klarer å komme seg, humant avlive mus via CO 2 kvelning og halshugging. Følg godkjente institusjonelle retningslinjer for aktiv dødshjelp.
- Post-kirurgi, sjekk for kliniske tegn på HCC som vanligvis observable som betydelig reduksjon i kroppskondisjon poengsum. Merk: På dette punktet har en primærtumor sannsynlig utviklet i leveren og metastatisk innskudd har sannsynligvis utviklet seg i lungene.
- På dette punktet, ofre alle mus (forsøks- og kontroll) som er involvert i forsøket med humane eutanasi. Utsette musene til karbondioksidasfyksiering: meget langsomt frigjøre karbondioksid inn i kammeret i løpet av en periode på 5 -10 min. Dette vil føre til respirasjonsstans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leveren hos Balb / c-mus ble implantert med 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus HCC celler. Kliniske tegn på HCC utvikling var observerbar 63 dager etter operasjonen. Følgelig mus ble humant avlivet. Nekropsi ble utført på de avlives musene. Lungene og leveren ble resekterte og en forsiktig grov undersøkelse ble utført for å identifisere makroskopiske svulster. I en mus, ble en overfladisk svulst observert på overflaten av leveren med noen tilknytning til bukveggen (figur 1A). I en andre mus, ble et unormalt utseende lever observert. Den unormalt veldig sterkt ser ut som en overfladisk svulst (figur 1B). Som forventet, mus i kontrollgruppen uten implantasjon av BNL 1ME A.7R.1 HCC celler utviklet ingen svulster, som dokumentert av en lever (figur 1D) og lungene (figur 1E) fra en kontroll mus. Også lungene fra musene med svulster så noe unormalt, displaying områder av hemoragisk nekrose (figur 1C). Basert på tidligere erfaring, kan disse lungene båtplass metastatiske innskudd 3.
Figur 1. Undersøkelse av tumor og metastase. Balb / c-mus ble implantert med 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 tumorceller og avlives 63 dager senere. Representative levertumorer ble observert ble fotografert og vist her. (A og B) viser begge overflatiske levertumorer. (C) er lungene fra tumorceller implantert mus. (D) viser leveren hos en kontroll mus. (E) angir lungene til en kontroll musen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk av metodikk for en "pasient-like" orthotopic syngenisk musemodell for leverkreft metastaser. Når bedøvd, er muselever implantert med 5 X 106 BNL 1ME A.7R.1 mus leverkreft (HCC) celler. Når kliniske tegn på HCC er observerbare, blir dyret avlivet ved human avlivning (utsatt for karbondioksid kvelning, etterfulgt av perkutan intrakardiell exsanguination og halshugging). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen en inngående beskrivelse av metoden er gitt som nylig ble rapportert av Ogunwobi og kolleger av vellykket etablering av en orthotopic syngenisk musemodell for HCC metastase (figur 2) 3. Den tar sats av svulster for denne prosedyren er generelt høy. Vi har tidligere observert en tumor ta hastighet på 100% 3. Imidlertid kan den ta sats være variabel avhengig av kompetansen til etterforskeren. I en nylig eksperiment utført av en ny utdannet student undertrening, svulsten take hastigheten var så lav som 40%. Selv om de fleste forsøk er avsluttet ved 4 - 6 uker på grunn av nedgang i kroppens tilstand score, tror vi av erfaring med subkutan implantasjon av de samme cellene i samme mus som primære svulster kan etableres etter 2 - 3 uker. Vi forventer vanligvis å se en svulst nodule fra et vellykket eksperiment. Og selv om vi forventer lungemetastaser til å utvikle mellom 4 - 6 uker, er det conceivi stand til at tumor i leveren kan finne sted mye tidligere.
Gode kirurgiske teknikker og aseptiske forhold er avgjørende for å lykkes i dette overlevelse kirurgi metoden. Mus som brukes for å overleve kirurgi bør være sunn. Veiing før og etter operasjonen er en god praksis. De gjennomsnittlige pre-kirurgi vekter av musene som brukes i eller siste forsøket var 18 gram, og i den eksperimentelle endepunktet (63 dager etter kirurgisk implantering) deres gjennomsnittlige vekt var bare 22 gram. En gevinst på bare 4 g av vekten i løpet av denne tidsperioden er sannsynligvis fordi det ikke var noen reduksjon i vektøkning på grunn av systemisk sykdom fra svulsten. Vi ville ha hatt en mer objektiv vurdering av dette hadde vi målt mus vekt én gang eller to ganger i uken gjennom hele forsøket. Dette anbefales beste praksis.
Som oppsummert i figur 2, bør være tilstrekkelig musene bedøvet før operasjonen og hele perioden for kirurgi for å unngå smerte en nd nød. Området skal være fri for alt rotet, og tilgang skal kun være tilgjengelig for de som utfører operasjonen. Både kirurgi området samt instrumentene som brukes bør alle være sterile.
Et viktig skritt for å lykkes med implantasjon er utarbeidelsen av BNL 1ME A.7R.1 musen HCC celler til å bli implantert. Under fremstillingen, er det avgjørende for å unngå forurensning av samlingen av cellene fra sammenflytende cellekulturer retter. Disse trinn skal utføres i en cellekultur hette under sterile betingelser. En celletelling skal også gjøres for å sikre 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus HCC celler er samlet i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør per mus som blir resuspendert i 100 ul fosfatbufret saltvann (PBS). Trypan blå flekker kan også eventuelt være utført for å bekrefte levedyktigheten av cellene. Disse cellene skal holdes på is ikke lengre enn 2 timer før implantasjonen i leveren hos mus.
_content "> The implantasjon av kreftcellene skal håndteres med forsiktighet på grunn av den skjøre naturen av leveren (figur 2). Under injeksjon av kreftceller, unngå for dyp en punktering som kan føre til at nålen går gjennom hele leveren .: Det er viktig å injisere kreftceller langsomt og forsiktig. På den annen side vil for grunt en punktering med nålen før injeksjon sannsynlig forårsake utslipp av kreftceller injisert ut i bukhulen. Også, etter fjerning av nålen, det er alltid en potensiell av orgelet blødning ut på grunn av sin høye vascularity. Derfor søker en steril bomullspinne i minst 1 min anbefales. Stell og oppmerksomhet vil sikre den høyeste frekvensen av implantasjon suksess. Dyret bør også gis en ekstern varmekilde gjennom hele fremgangsmåten som hypotermi er et stort problem som forårsaker forstyrrelser av termoregulering under anestesi post-kirurgi., bør dyret overvåkes fornoen tegn til ubehag eller smerte på hvilket tidspunkt riktig behandling bør gis. Hvis musen ikke er i stand til å komme seg fra operasjonen, bør det bli humant avlivet.Som kreft metastase er den primære årsaken til dødsfall fra kreft, er det avgjørende å avgrense mekanismene for hematogenous formidling 2-4. Nye sirkulerende tumorceller ble etablert fra denne orthotopic syngenisk musemodell for HCC metastase tre. Videre CTCS avledet fra denne modellen konsekvent viser økt startfasen og metastatisk evne 3. De sirkulerende tumorceller isolert ved hjelp av denne metoden kan vise seg å være svært viktig som de bidrar til å løse spesifikke molekylære faktorer, tusjer og mulige terapeutiske mål for kreft metastase 2-4. Denne metodikken har allerede funnet at det er økt oppregulering av hepatocytt-vekstfaktor (HGF), og dens reseptor, c-Met i sirkulerende tumorceller sammenlignetprimærtumorceller av HCC tre. Disse resultatene bygger på tidligere arbeid viser at et viktig aspekt ved tumormetastaser er den cellulære prosessen med epitelial-mesenchymale overgang 2-4,10. Ytterligere kjennetegn sirkulerende tumorceller ved hjelp av denne romanen modellen vil øke vår forståelse av de intrikate mekanismene for faktorer som fremmer prosessen og dermed fører til utvikling av mer effektiv styring av HCC 1-3,10.
For tiden er de mest brukte dyretumormodeller er xenograft musetumormodeller, karakterisert ved at humane tumorceller implantert i immunmangelfull mus. Modellen som er beskrevet i denne artikkelen, har viktige fordeler fordi det er syngen, og er derfor egnet for å studere rollen til immunsystemet i tumormetastase 3. Denne modellen har vist seg å være meget reproduserbar for isolering, dyrking, og studere av levedyktige sirkulerende tumorceller 3. Det har derfor tremenDous potensial for å vurdere kliniske applikasjoner som screening, diagnostisering, prognostication, terapi overvåking og oppdagelsen av nye terapeutiske strategier. En begrensning av den metodologi som er beskrevet ovenfor er at en betydelig del av BNL 1ME A.7R.1 HCC museceller implantert i mus vil være ute av stand til å overleve og således bare en liten del av cellene vil være levedyktige og flinke til å innføre tumorer hos sekundære områder 3. Vi står for denne begrensningen ved første implantasjon av 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 muse HCC celler per mus.
Som konklusjon, gir dette orthotopic syngenisk musemodell for metastatisk solid organ kreft en god plattform for å belyse de biologiske mekanismene bak metastatisk evne av sirkulerende tumorceller i blodet hos kreftpasienter 3. Dette i sin tur vil trolig kaste romanen innsikt i mekanismene for kreft metastase fordi kreft metastase skjer primært via hematogenous spre 11-13. Ny innsikt således oppnådd i mekanismene for kreft metastase vil være avgjørende for utvikling av nye gunstige kliniske applikasjoner 3,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz | (RS-5040) | Tip 0.20 x 0.12 mm |
| Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip | Roboz | (RS-5111) | 1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm |
| Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs) | Roboz | (RS-6501) | Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm |
| Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs) | Roboz | (RS-6503) | Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm |
| Jameson Caliper (Measures tumors) | Roboz | (RS-6466) | 80 mm/3 inch scale, chrome plated |
| Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp | Roboz | (RS-5852) | 23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings |
| Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures | Roboz | (RS-9861-36) | |
| Scalpel handle | Roboz | (RS-9884) | Solid |
| Littauer Stitch Sissors | Roboz | (RS-7074) | Length 4.5 inches |
| Brown needle holder, for easy suture tying | Roboz | (RS-7960) | Convex jaw, fine serrations |
| Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier | Roboz | (RS-9262) | safe, secure alternative method of wound closure |
| Instrument tray and lid | Roboz | RT-1350S | |
| Mini-clipper with detachable blade | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | For fast decontamination of micro-dissecting instruments. Instruments decontaminate within 15 sec. |
| Microinjection needles | VWR | BD305125 | 25G Needle |
References
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765 (2013).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
- Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
- Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
- Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
- Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).
