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Medicine

Un "paciente-Like" ortotópico Singénico modelo de ratón de carcinoma hepatocelular Metástasis

doi: 10.3791/52858 Published: October 24, 2015

Summary

La diseminación metastásica del cáncer es la principal causa de muerte por cáncer. Proporcionamos una descripción en profundidad de nuestra metodología de la cirugía de supervivencia para el establecimiento de un sistema de modelo de ratón singénico "-paciente como" ortotópico para el estudio de los mecanismos de la metástasis en tumores de órganos sólidos.

Protocol

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Declaración de Ética
Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de Hunter College de la City University de Nueva York.

Nota: ocho ratones BALB / c fueron utilizados en este procedimiento experimental. Cinco ratones BALB / c fueron implantados con 5 x 10 6 células de carcinoma hepatocelular BNL 1ME A.7R.1 ratón para producir los tumores primarios. Tres ratones BALB / c sin implantaciones se utilizaron como controles. BNL 1ME A.7R.1 es una línea celular de carcinoma hepatocelular murino que se derivó por transformación química de la no tumorigénicos línea celular de hepatocitos murinos BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC).

1. Pre-cirugía

  1. Asegúrese de que los ratones de todas las cirugías de supervivencia son saludables. Para asegurar que los ratones están sanos, inspeccionar signos de deshidratación por abombamiento de la piel. No utilice los ratones con cualquier evidencia de enfermedad o distress en estos experimentos.
  2. Pesar ratones para asegurarse de que no son de bajo peso. Asegúrese de que el peso es al menos 16-20 gramos.
  3. Preparar 5 × células HCC ratón 10 6 BNL 1ME A.7R.1 para la implantación por ratón:
    1. Aspirar los medios de comunicación a partir de 10 ml de 60% - placa de cultivo de células confluentes 70% de las células de HCC A.7R.1 ratón BNL 1me. Lavar dos veces con 5 ml de PBS. Añadir 2 ml de tripsina al plato y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con aire y 5% de CO 2 durante 5 min.
    2. Posteriormente, pipeta de 10 l tripsinizaron células en un hemocitómetro manual para el recuento de células bajo un microscopio con una ampliación de 10X. Contar el número total de células que se encuentran en los cuatro grandes cuadrados de las esquinas y multiplicar el factor de dilución por el número total de células. Luego, divida por el número de plazas contadas y multiplíquelo por 10 6 para la concentración de células (células por ml).
    3. Usando el cálculo, recolectar 5 millones de células por ratón en estéril1,5 ml tubos de microcentrífuga. Etiqueta de 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
  4. Resuspender las 5 × 10 6 células BNL 1ME A.7R.1 ratón HCC en 100 l de tampón fosfato salino (PBS). Mantenga estas células en hielo hasta la implantación en cirugía.
  5. Realizar las actividades necesarias para la preparación de los ratones para la cirugía, tales como la inducción de la anestesia y el pelo de recorte de distancia de los equipos y materiales estériles para evitar la contaminación.
  6. Inducir la anestesia general en los ratones por inhalación de isoflurano usando un vaporizador de isoflurano junto con oxígeno a una velocidad de flujo constante de 1 concentración de L por minuto (aprox. 2,1%). Nota: El sistema es autosuficiente, e incluye un vaporizador de precisión, un suministro de oxígeno y un filtro de carbón activado que está vinculada a un circuito de respiración necesaria para la recogida de gases / anestésico.
  7. Asegúrese de que la anestesia es la adecuada para evitar que el animal sometido a dolor durante la cirugía. Realizar toe-pinch y observar animales por falta de responsiveness para confirmar la anestesia.
  8. En ese momento, cambiar la línea de la válvula, el sello de la caja y abierto al cono de la nariz.
  9. Tan pronto como el ratón se anestesia, aplique una pequeña cantidad de una pomada oftálmica para las córneas como una medida preventiva de secado y daños.
  10. Posteriormente, mover el animal a la zona de preparación, con el cono de la nariz correctamente colocado y conectado (para la anestesia de mantenimiento). Preparar el sitio de la incisión quirúrgica para la cirugía por la depilación en esta zona de preparación.
  11. Asegúrese de que el área de la cirugía es en un lugar libre de toda otra actividad.
  12. Asegúrese de que la superficie de trabajo es robusto y debidamente desinfectados, inmaculado y libre de desorden antes de la cirugía. Coloque un pedazo estéril de lino o bandeja quirúrgica sobre ella.
  13. Asegúrese de que el campo operatorio es permitida sólo a las personas que llevan a cabo la cirugía. Asegúrese de que la sala de cirugía se limpia y se barrió con un limpiador apropiado y rocía con un disinfe apropiadactant.
  14. Asegúrese de que también se coloca lejos de puertas y ventanas como corrientes de aire puede esparcir el polvo que conduce a la contaminación del sitio.
  15. Realizar la cirugía de supervivencia con instrumentos estériles. De cualquier remojo instrumentos en un desinfectante de acuerdo con la recomendación o autoclave del fabricante. Utilice suministros estériles básicos que están listos para su uso.
  16. Instrumentos separados según su función para ayudar a prevenir la contaminación de las zonas estériles.
  17. Afeitado aproximadamente 1 pulgada alrededor del sitio de la incisión (incisión de línea media) para acceder al hígado del animal. Quitar el pelo del animal lejos del sitio de la cirugía.
  18. Después del afeitado, frote el área con un desinfectante y jabón (betadine quirúrgica matorral) y lavar el exceso de desinfectante de distancia con una solución de PBS estéril. Realizar esto varias veces, con todo el proceso de borrado de una duración aproximada de 5 minutos. Retire y descartados los guantes usados.
  19. Después, cambiar a la ropa de protección, como Surgical vestido, top matorrales y la máscara de la cara. A continuación, desinfectar las manos con solución exfoliante adecuada antes de ponerse los guantes quirúrgicos. Nota: Este es un paso necesario para evitar que la excreción y la contaminación de la zona quirúrgica con contaminantes potenciales.

2. Cirugía

  1. Proporcionar una fuente de calor externa para el calor durante todo el período de la anestesia. El animal puede experimentar algo de hipotermia debido a la anestesia provoca alteraciones de la termorregulación; por lo tanto, mantener la temperatura corporal.
  2. Coloque el ratón sobre la espalda durante toda la cirugía.
  3. Fijar las extremidades delanteras, patas traseras y la cola del ratón a la mesa de cirugía con trozos de cintas quirúrgicas.
  4. Haga una incisión recta inmediatamente inferior a la xyphisternum.
  5. Usar un retractor quirúrgico auto-retención estéril para exponer el hígado.
  6. Con una jeringa que tiene una aguja 20G, lenta y cuidadosamente inyectar 100 l de PBS que contenía 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1células de ratón HCC en el lóbulo derecho del hígado.
  7. Después de retirar la aguja, aplique un hisopo de algodón estéril durante al menos 1 minuto para detener cualquier sangrado potencial debido a la alta vascularización del hígado.
  8. Cierre el tejido subcutáneo con una sutura absorbible seguido de cierre de la piel utilizando grapas quirúrgicas. Posteriormente, limpiar la herida una vez más con matorrales betadine. Nota: Esto asegurará que el cierre de la herida quirúrgica.
  9. Subcutánea dar 100 l de solución salina normal.

3. Después de la cirugía

  1. Inmediatamente después de la cirugía, transferir el ratón a una jaula limpia con una tarjeta de identificación después de la cirugía para notificar a los cuidadores de la condición del ratón. Proporcionar alimentos y agua. Nota: En nuestra experiencia, un ratón que acaba sometido a cirugía le irá mejor si alojados solo con comida húmeda y agua durante el período de 24 horas después de la cirugía inicial.
  2. Mantenga el animal caliente con una lámpara de calor que genera calor no supera 38 ºC. Use una termómetro para medir la temperatura hasta que el ratón está totalmente recuperado.
  3. Casa del animal en una jaula de preferencia con ropa de cama de papel para garantizar la comodidad.
  4. Después de la recuperación inicial, el seguimiento del animal para detectar signos de incomodidad, sangrado, dolor y angustia. Dar buprenorfina (0.05 -0.1 mg / kg) para aliviar el dolor. Supervisar de cerca la actividad, el comportamiento y apariencia, así como el agua y el consumo de alimentos durante aproximadamente 2 h. Si ambulatoria, mover el animal de nuevo a la zona de una vivienda normal regular de los ratones y seguir vigilando a los 6-12 hr intervalos de 24 horas después de la cirugía. Realizar una comprobación de peso si se desea.
  5. Sin embargo, si el animal está teniendo problemas de recuperación, tomar las medidas adecuadas para el cuidado de apoyo. Si los ratones no pueden recuperarse, con humanidad eutanasia a los ratones a través de asfixia con CO2 y dislocación cervical. Siga las pautas institucionales aprobados para la eutanasia.
  6. Después de la cirugía, compruebe si hay evidencia clínica de HCC que suele ser observable reducción tan significativa en la condición corporal. Nota: En este punto, un tumor primario ha desarrollado probablemente en el hígado y depósitos metastásicos probable que se han desarrollado en los pulmones.
  7. En este punto, sacrificar todos los ratones (experimental y control) que participan en el experimento por eutanasia humanitaria. Someter los ratones a la asfixia con dióxido de carbono: liberar muy lentamente el dióxido de carbono en la cámara durante un período de 5 -10 min. Esto provocará un paro respiratorio.

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Representative Results

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Los hígados de ratones Balb / c se implantaron con 5 × 10 6 células de HCC ratón BNL 1ME A.7R.1. La evidencia clínica de desarrollo de HCC fue observable de los 63 días posteriores a la cirugía. En consecuencia, los ratones fueron sacrificados humanitariamente. La necropsia se realizó en los ratones sacrificados. Los pulmones y el hígado fueron resecados y un examen cuidadoso bruto se realizó para identificar tumores macroscópicos. En un ratón, se observó un tumor superficial en la superficie del hígado con un poco de unión a la pared abdominal (Figura 1A). En un segundo ratón, se observó un hígado anormalmente de aspecto. La anormalidad se ve muy fuertemente como un tumor superficial (Figura 1B). Como se esperaba, los ratones del grupo de control sin implantación de células BNL 1ME A.7R.1 HCC desarrollaron ningún tumor, como se evidencia por un hígado (Figura 1D) y los pulmones (Figura 1E) a partir de un ratón control. También, los pulmones de los ratones con tumores parecían algo anormal, pantallaing áreas de necrosis hemorrágica (Figura 1C). Basándose en la experiencia anterior, estos pulmones pueden albergar depósitos metastásicos 3.

Figura 1
Figura 1. El examen macroscópico de tumor y la metástasis. Ratones Balb / c se implantaron con 5 x 10 6 células tumorales BNL 1ME A.7R.1 y sacrificados 63 días más tarde. Tumores representativos hepáticos observados fueron fotografiados y se muestra aquí. (A y B) ambos muestran tumores hepáticos superficiales. (C) es pulmones de las células tumorales ratones implantados. (D) muestra el hígado de un ratón de control. (E) indica pulmones de un control ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 2. Esquema de la metodología de un modelo de ratón singénico ortotópico "-paciente como" de metástasis de carcinoma hepatocelular. Una vez anestesiado, el hígado del ratón se implanta con células 5 X 106 BNL 1ME carcinoma hepatocelular A.7R.1 ratón (HCC). Cuando la evidencia clínica de HCC es observable, animal es sacrificado por eutanasia humanitaria (sometido a la asfixia de dióxido de carbono, seguido por desangramiento intracardiaca percutánea y dislocación cervical). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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En este artículo se da una descripción detallada del método que se informó recientemente por Ogunwobi y colegas del éxito del establecimiento de un modelo de ratón singénico ortotópico de HCC metástasis (Figura 2) 3. La tasa de absorción de los tumores para este procedimiento es generalmente alto. Hemos observado previamente una tasa de absorción del tumor de 100% 3. Sin embargo, la tasa de absorción puede ser variable en función de la competencia del investigador. En un experimento reciente realizado por un nuevo estudiante de posgrado en formación, la tasa de absorción del tumor era tan baja como 40%. Aunque la mayoría de los experimentos se terminan a las 4 - 6 semanas debido a declinar en la condición corporal, creemos que la experiencia con la implantación subcutánea de las mismas células en los mismos ratones que los tumores primarios pueden ser establecidos por 2 - 3 semanas. Por lo general, esperamos ver nódulo un tumor de un experimento exitoso. Y aunque esperamos metástasis de pulmón a desarrollarse entre 4 - 6 semanas, es conceivcapaz que el tumor en el hígado puede tener lugar mucho antes.

Las buenas técnicas quirúrgicas y condiciones asépticas son esenciales para el éxito de este método de cirugía de supervivencia. Los ratones utilizados para la cirugía de la supervivencia deben ser saludables. Con un peso pre y post-cirugía es una buena práctica. El peso medio antes de la cirugía de los ratones utilizados en o más reciente experimento fue de 18 gramos, y en el punto final experimental (63 días después del implante quirúrgico) su peso promedio fue de sólo 22 gramos. Un aumento de sólo 4 gramos de peso durante ese período de tiempo es probable porque había cierta disminución en el aumento de peso debido a una enfermedad sistémica del tumor. Habríamos tenido una evaluación más objetiva de esto tenía que mide el peso del ratón una vez o dos veces por semana durante todo el experimento. Esto se recomienda las mejores prácticas.

Como se resume en la Figura 2, los ratones deben ser anestesiados adecuadamente antes de la cirugía y durante todo el período de la cirugía para evitar el dolor una angustia nd. El área debe estar libre de todo el desorden, y el acceso sólo debe estar disponible para aquellos que realiza la cirugía. Tanto el área de la cirugía, así como los instrumentos utilizados todos deben ser estériles.

Un paso vital para el éxito de la implantación es la preparación de las células de HCC ratón BNL 1ME A.7R.1 para ser implantado. Durante la preparación, es crucial para evitar la contaminación de la colección de las células a partir de cultivos de células confluentes platos. Estos pasos deben realizarse en una campana de cultivo de células en condiciones estériles. Un recuento de células se debe también hace para asegurar 5 × 10 6 células BNL 1ME A.7R.1 ratón HCC se han recogido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por ratón estéril que se resuspendió en 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Tinción con azul de tripano también se puede realizar opcionalmente para confirmar la viabilidad de las células. Estas células deben mantenerse en hielo no más de 2 horas antes de la implantación en los hígados de los ratones.

_content "> La implantación de las células de cáncer se debe manejar con cuidado debido a la delicada naturaleza del hígado (Figura 2). Durante la inyección de las células cancerosas, evitar un pinchazo muy profundo que pueda resultar en la aguja pasando por todo el hígado . Es esencial para inyectar las células cancerosas lenta y cuidadosamente. Por otro lado, muy poco profunda de una punción con la aguja antes de la inyección probablemente causar derrame de las células cancerosas inyectadas a cabo en la cavidad peritoneal. Además, después de retirar la aguja, siempre hay un potencial del órgano sangrado debido a su alta vascularización. Por lo tanto, se recomienda la aplicación de un bastoncillo de algodón estéril durante al menos 1 min. Cuidado y atención asegurarán la mayor tasa de éxito de la implantación. El animal también debe proporcionar un fuente externa de calor a través del procedimiento que la hipotermia es una de las principales preocupaciones que causa alteraciones de la termorregulación durante la anestesia. Después de la cirugía, el animal debe ser supervisada paracualquier signo de malestar o dolor en ese momento la atención adecuada se deben administrar. Si el ratón no es capaz de recuperarse de la cirugía, debe ser sacrificado humanitariamente.

Como la metástasis del cáncer es la principal causa de mortalidad por cáncer, es crucial para delinear los mecanismos de diseminación hematógena 2-4. Las células tumorales circulantes Novel se establecieron a partir de este modelo de ratón singénico ortotópico de HCC metástasis 3. Por otra parte, los CTCs derivados de este modelo consistentemente muestran un aumento de la iniciación del tumor y la capacidad metastásica 3. Las células tumorales circulantes aislados utilizando este método puede llegar a ser muy importante, ya que ayudan a desentrañar los factores moleculares específicos, marcadores y posibles objetivos terapéuticos de la metástasis del cáncer 2-4. Esta metodología ya ha identificado que hay un aumento de la regulación al alza del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y su receptor, c-Met en células tumorales circulantes en comparación conlas células del tumor primario de HCC 3. Estos resultados se basan en el trabajo previo que demuestra que un aspecto importante de la metástasis tumoral es el proceso celular de epitelio-mesenquimal transición 2-4,10. Otros característicos células tumorales circulantes utilizando este novedoso modelo aumentará nuestra comprensión de los mecanismos complejos de factores que promueven el proceso que conduce al desarrollo de una gestión más eficaz de HCC 1-3,10.

En la actualidad, los modelos de tumor animal más ampliamente usados ​​son los modelos de xenoinjerto de tumor de ratón en el que las células tumorales humanas se implantan en ratones inmunodeficientes. El modelo descrito en este artículo tiene importantes ventajas, ya que es singénico y es, por lo tanto, adecuado para estudiar el papel del sistema inmune en la metástasis tumoral 3. Este modelo ha demostrado ser altamente reproducible para el aislamiento, cultivo, y el estudio de las células tumorales circulantes viables 3. Es, por lo tanto, ha tremenpotencial dous para evaluar las aplicaciones clínicas como la detección, el diagnóstico, el pronóstico, monitoreo de la terapia y el descubrimiento de nuevas estrategias terapéuticas. Una limitación de la metodología descrita anteriormente es que una porción significativa de células de HCC A.7R.1 ratón BNL 1ME implantado en los ratones será incapaz de sobrevivir y por lo tanto sólo una pequeña porción de las células será viable y expertos en la introducción de los tumores en 3 sitios secundarios. Nos cuenta esta limitación mediante la implantación inicial de 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 células HCC ratón por ratón.

En conclusión, este modelo de ratón singénico ortotópico de cáncer de órgano sólido metastásico ofrece una buena plataforma para elucidar los mecanismos biológicos que subyacen a la capacidad metastásica de las células tumorales circulantes en la sangre de pacientes con cáncer de 3. A su vez, es probable que arrojar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la metástasis del cáncer debido a la metástasis del cáncer se produce principalmente a través de hematogenous extendió 11-13. Nuevos conocimientos así obtenidos en los mecanismos de la metástasis del cáncer serán fundamentales para el desarrollo de nuevas aplicaciones clínicas beneficiosas 3,14,15.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Tweezer  Roboz (RS-5040) Tip 0.20 x 0.12 mm
Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip Roboz (RS-5111) 1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm
Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs) Roboz (RS-6501) Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm
Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs) Roboz (RS-6503) Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm
Jameson Caliper (Measures tumors) Roboz (RS-6466) 80 mm/3 inch scale, chrome plated 
Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp Roboz (RS-5852) 23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings
Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures Roboz (RS-9861-36)
Scalpel handle  Roboz (RS-9884) Solid
Littauer Stitch Sissors Roboz (RS-7074) Length 4.5 inches
Brown needle holder, for easy suture tying Roboz (RS-7960) Convex jaw, fine serrations
Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier Roboz (RS-9262) safe, secure alternative method of wound closure
Instrument tray and lid Roboz RT-1350S
Mini-clipper with detachable blade Roboz (RS-5903)
Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer Roboz Ds-400, Ds-401, DS-501 For fast decontamination of micro-dissecting instruments.   Instruments decontaminate within 15 sec. 
Microinjection needles VWR BD305125 25G Needle

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References

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Un "paciente-Like" ortotópico Singénico modelo de ratón de carcinoma hepatocelular Metástasis
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Das, D. K., Durojaiye, V., Ilboudo, A., Naidoo, M. K., Ogunwobi, O. A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis. J. Vis. Exp. (104), e52858, doi:10.3791/52858 (2015).More

Das, D. K., Durojaiye, V., Ilboudo, A., Naidoo, M. K., Ogunwobi, O. A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis. J. Vis. Exp. (104), e52858, doi:10.3791/52858 (2015).

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