Protocol
आचार कथन: सभी जानवरों के अध्ययन न्यूयॉर्क के सिटी विश्वविद्यालय के हंटर कॉलेज के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. पूर्व प्रयोग प्रक्रिया
- जानवरों की सुविधा के लिए आगमन पर, शुरू में एक फ़िल्टर ऊपर और लकड़ी चिप बिस्तर के साथ एक पिंजरे में 3 BALB / ग चूहों घर। चूहों भोजन, Purina कृंतक चाउ, और पानी के लिए मुफ्त का उपयोग किया है कि सुनिश्चित करें। पिंजरों एक सप्ताह में एक बार साफ किया जाना चाहिए, जबकि बिस्तर और भोजन एक सप्ताह में दो बार बदला जाना चाहिए।
- प्रति मिनट 1 एल के एक निरंतर प्रवाह की दर में ऑक्सीजन के साथ-साथ एक isoflurane vaporizer का उपयोग चूहों में सामान्य संज्ञाहरण प्रेरित। सिस्टम आत्मनिर्भर है और एक सटीक vaporizer भी शामिल है।
- इससे जुड़े परिशुद्धता vaporizer और गैस / संवेदनाहारी प्रणाली है कि एक प्लास्टिक के डिब्बे में स्थिति जानवर। जानवर जो बात करने के लिए 2 vaporizer के निचले हिस्से, बेहोश होने तक प्रारंभ में 2.5 vaporizer निर्धारित किया है।
- उस समय, स्विचवाल्व लाइन, बॉक्स के लिए यह सील और नाक शंकु के लिए इसे खोलने।
- नाक शंकु (रखरखाव संज्ञाहरण के लिए) ठीक से रखा जाता है और जुड़ा के साथ तैयारी क्षेत्र में पशु ले जाएँ।
- माउस प्रति आरोपण के लिए 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 माउस एचसीसी कोशिकाओं को तैयार। BNL 1ME A.7R.1 माध्यम में बढ़ रही किया जाना चाहिए (10% गर्मी एफबीएस निष्क्रिय, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 मिमी एल glutamine) हवा और 5% के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति डिश में incubating सीओ 2।
- एक सिरिंज एक 20 जी सुई होने के साथ, BALB / ग चूहों के यकृत की एक पालि में 5 एक्स 10 6 BNL 1ME A.7R.1 माउस हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं से युक्त पीबीएस के प्रत्यारोपण 100 μl प्राथमिक ट्यूमर का उत्पादन करने के लिए। बाद आरोपण, घर पूर्व आरोपण के रूप में एक ही घर आवश्यकताओं के साथ एक पिंजरे में BALB / ग चूहों।
- प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर, हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा के नैदानिक सबूत शरीर की स्थिति में महत्वपूर्ण कमी के रूप में मानने योग्य है(आमतौर पर 4 हफ्तों के बाद पता चला) स्कोर। इस बिंदु पर, मेटास्टेटिक जमा फेफड़ों में गठन किया है, जबकि प्राथमिक ट्यूमर जिगर में विकसित किया है कि वहाँ एक संभावना है। इसके बाद, ट्यूमर कोशिकाओं घूम के अलगाव और प्रचार करने की प्रक्रिया शुरू।
ट्यूमर सेल अलगाव परिसंचारी के लिए पूरे रक्त की 2. संग्रह
नोट: ठीक सर्जरी क्षेत्र साफ है और यह अव्यवस्था से मुक्त है सुनिश्चित करें। सभी सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव या निर्माता की सिफारिश के अनुसार एक कीटाणुनाशक में लेना
- प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर मानवीय इच्छामृत्यु (ट्यूमर के विकास के नैदानिक सबूत) द्वारा चूहों बलिदान। चूहों के euthanization सीओ 2 asphyxiation को शामिल करना चाहिए। संज्ञाहरण पुष्टि करने के लिए ठीक से चूहों का निरीक्षण सही ढंग से वितरित किया जाता है। सांस की गिरफ्तारी के कारण 10 मिनट - कार्बन डाइऑक्साइड 5 की अवधि में चेंबर में धीरे-धीरे जारी किया जाना चाहिए। Intracardiac exsanguination और cervic द्वारा पालन करेंअल अव्यवस्था। 5
- पूरे रक्त के संग्रह के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक 25 जी सुई का प्रयोग करें। 0.01 मिलीलीटर हेपरिन के साथ सिरिंज Heparanize। Xyphisternum पर लगभग 45 डिग्री के कोण से हीन सुई के साथ तुरंत पंचर त्वचा। दिल पंचर करने के लिए धीरे-धीरे सुई अग्रिम, और फिर सुई के कोण कम है। तेजी से जगह में सुई और सिरिंज पकड़ है, और 500 μl बाहर आकर्षित - दिल से पूरे रक्त के 1,000 μl।
- सिरिंज और सुई निकालें और एक पूर्व लेबल 1.5 मिलीलीटर pyrogen मुक्त ट्यूब में रक्त हस्तांतरण। 5 मिनट के लिए 1167 XG पर 1.5 मिलीलीटर pyrogen मुक्त ट्यूब में एकत्र पूरे रक्त अपकेंद्रित्र।
नोट: centrifugation के तीन परतों में पूरे रक्त के नमूने को अलग करती है: लाल रक्त कोशिकाओं, बफी कोट की एक मध्यवर्ती पतली परत, और एक शीर्ष प्लाज्मा परत से मिलकर नीचे या hematocrit परत। - Pipetting द्वारा ध्यान से प्लाज्मा निकालें और Furth के लिए एक अलग 1.5 मिलीलीटर pyrogen मुक्त ट्यूब में यह संग्रहइस तरह के सेल मुक्त न्यूक्लिक एसिड 7 का पता लगाने के रूप में एर प्रयोगों।
- घूम ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) के अलगाव के लिए, लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) सेल के लिए तैयार करने में एक अलग 1.5 मिलीलीटर pyrogen मुक्त ट्यूब में बफी कोट इकट्ठा। इस बफी कोट परत में अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए आवश्यक है।
लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) बफर के लिए 3. पकाने की विधि
- आरबीसी lysis बफर के एक 1 एल समाधान करें।
- एक अमोनियम क्लोराइड की 500 मिलीलीटर और Tris की 500 मिलीलीटर बनाओ। फिर अमोनियम क्लोराइड की 155 मिमी और Tris 10 मिमी के अंतिम एकाग्रता के साथ आरबीसी lysis बफर के एक 1 एल समाधान बनाने के लिए मिश्रण।
- 7.5 के पीएच का हल बफर। 2-8 डिग्री सेल्सियस पर आरबीसी lysis बफर स्टोर, और तुरंत पहले उपयोग करने के लिए आरटी के लिए लाने के लिए।
बफी कोट 4. आरबीसी lysis
- एकत्र बफी कोट युक्त बाँझ pyrogen मुक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूब आरबीसी lysis बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
- द्वारा ट्यूब की सामग्री मिक्सकई बार inverting। बेंच पर आरटी पर 5 मिनट के लिए ट्यूब के मिश्रित सामग्री सेते हैं। जी एक्स 1167 पर 5 मिनट के लिए मिश्रित सामग्री अपकेंद्रित्र।
- Centrifugation के बाद, एक सफेद गोली प्राप्त किया जाएगा। गोली किसी व्यवधान के बिना धीरे धीरे और सावधानी से 10% ब्लीच में लाल सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 3.5 - गोली श्वेताभ नहीं है, तो फिर से 3.1 कदम। 10 आरबीसी lysis बफर में ऊष्मायन समय बढ़ाने से - 15 मिनट भी सहायक हो सकता है।
- 10% ब्लीच में जैविक कचरे के परिशोधन 24 घंटे के बाद पूरा हो गया है एक बार सुरक्षित रूप से जैविक अपशिष्ट निपटान के।
सेल संस्कृति में 5. प्रचार
नोट: ट्यूमर कोशिकाओं को आमतौर पर तेजी से कोशिकाओं डिश में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की मूल मिश्रण में प्रचुर मात्रा में हैं कि सफेद रक्त कोशिकाओं से बढ़ रहे हैं। मध्यम के बार-बार बदलने के लिए, और CTCs के बाद मार्ग के बाद, सभी सफेद रक्त कोशिकाओं को हटा रहे हैं और CTCs की एक अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी बनी हुई है।
- के बाद10% ब्लीच में सतह पर तैरनेवाला discarding, सेल संस्कृति में प्रचार के लिए पूरी संस्कृति के माध्यम में कम से कम एक बार 1 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में श्वेताभ गोली धोने, और resuspend।
- धोने के पूरा हो जाने के बाद गोली को पूरा BNL 1ME A.7R.1 संस्कृति के माध्यम से (एफबीएस निष्क्रिय 10% गर्मी, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 मिमी एल Glutamine) के 1 मिलीलीटर जोड़ने और संस्कृति के माध्यम में गोली resuspend।
- एक सेल संस्कृति डिश में कोशिकाओं के resuspended मिश्रण बीज। हवा और 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति डिश सेते हैं।
- हर दो से तीन दिनों के सेल संस्कृति के माध्यम से बदलें। 5-7 दिनों के बाद, CTCs सेल संस्कृति डिश का पालन किया और प्रसार शुरू कर दिया है जाएगा। इन कोशिकाओं को 25 अंश से परे है और दोहराया ठंड और विगलन चक्र 5 के बाद व्यवहार्य रहेगा।
हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा के 6. सत्यापन ट्यूमर कोशिका लाइन परिसंचारी
- एपी प्रदर्शन करनाचेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित पद्धति olymerase, उपन्यास सीटीसी सेल लाइनों मूल प्रत्यारोपित BNL 1ME A.7R.1 एचसीसी लाइन की तरह माउस कोशिकाओं रहे हैं स्थापना की है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए माउस β ग्लोबिन जीन का केवल एक विशिष्ट डीएनए खंड बढ़ाना। विधि मूल वर्णित है और Steube एट अल द्वारा मान्य किया गया था। 5,8
- एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रोटीन 3-तरह 3 (CREB3L3) बाध्यकारी hepatocyte विशिष्ट मार्कर शिविर उत्तरदायी तत्व के लिए immunostaining प्रदर्शन करते हैं। यह स्थापित CTCs वास्तव में कर रहे मूल प्रत्यारोपित BNL 1ME A.7R.1 सेल लाइन की तरह Hepatocytes कि उपन्यास की पुष्टि करेगा। 5
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Representative Results
यहाँ वर्णित कार्यप्रणाली CTCs अलग किया जा सकता है कि दिखाया गया है। चूहे नम्रता से प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर euthanized थे। प्रक्रिया शामिल कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation, इंट्रा-हृदय exsanguination, और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था। प्रक्रिया का महत्वपूर्ण कदम का एक योजनाबद्ध चित्रा 2 में सचित्र हैं। इंट्रा-हृदय exsanguination द्वारा एकत्र पूरे रक्त के नमूनों ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग संसाधित किया गया। जिसके बाद, centrifugation आरबीसी सेल के अधीन था कि बफी कोट परत निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह तो पीबीएस में धोया गया था कि एक सफेद गोली इकट्ठा करने के लिए एक और centrifugation कदम के द्वारा पीछा किया, और सेल संस्कृति में प्रचार के लिए पूरा सेल संस्कृति माध्यम में resuspended था। ऊपर आ सकता है कि एक मुद्दा प्राप्त गोली रंग में स्पष्ट नहीं किया जा सकता है। यह अतिरिक्त समय के प्रदर्शन से संभवतः 15 मिनट, या - यह समस्या आसानी से 10 करने के लिए यह वृद्धि से आरबीसी lysis बफर में ऊष्मायन समय संशोधित करके हल किया जा सकता है।BNL 1ME A.7R.1 कोशिकाओं की तुलना में तीन अलग-अलग चूहों चित्रा 1 में दिखाया जाता है से CTCs की छवियों प्रतिनिधि संस्कृति में प्रचारित किया जा रहा है। तेजी से प्रसार और आकृति विज्ञान वरीयता प्राप्त कोशिकाओं CTCs कर रहे हैं की पहचान में मदद मिलेगी। हालांकि, कदम 5.1 में वर्णित ऐसी पीसीआर और immunostaining के रूप में सत्यापन तकनीक - 5.2 एक व्यवहार्य सीटीसी लाइन की स्थापना की पुष्टि के लिए आवश्यक हैं।
की एक orthotopic syngeneic माउस मॉडल से सेल संस्कृति में ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) परिसंचारी की चित्रा 1. प्रचार hepatocellular कार्सिनोमा मेटास्टेसिस। प्रकोष्ठों BNL 1ME A.7R.1 संस्कृति के माध्यम में 15 मिमी x 60 मिमी सेल संस्कृति बर्तन में प्रचारित किया गया। Proliferating ट्यूमर कोशिकाओं पकवान का पालन किया और तीन अलग-अलग चूहों से दिखाए जाते हैं। ट्यूमर कोशिकाओं को निरंतर मार्ग के माध्यम से व्यवहार्य बना रहा है। CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC08291 के चरण विपरीत छवि1 और CTCOLUF2419 BNL 1ME A.7R.1 कोशिकाओं (40x बढ़ाई) की तुलना में 40x बढ़ाई (ऑब्जेक्टिव लेंस) पर ले जाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
अलग और प्रचार माउस कर्क मॉडल प्रणाली से परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं की प्रक्रिया चित्रा 2. योजनाबद्ध। हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा के नैदानिक सबूत शरीर हालत स्कोर में महत्वपूर्ण कमी के रूप में मनाया गया था, जब पूरे रक्त चूहों से एकत्र किया गया था। कई centrifugations, आरबीसी सेल, और कई धोने कदम के बाद, CTCs प्रचार के लिए सेल संस्कृति बर्तन में वरीयता प्राप्त थे। ट्यूमर सेल प्रसार कई दिनों के बाद मनाया गया। वह क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कर रहे हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Salt 1 g | VWR | 89508-852 | |
| BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS | VWR | 89511-254 | 1.5 ml pyrogen-free eppendorf Tubes |
| Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in | VWR | BD305125 | 25 G Needle |
| Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack | VWR | BD309659 | 1 ml syringe tip |
| Syringe 1 ml leur lok Pk 100 | VWR | BD309628 | 1 ml syringe |
| VWR Forceps Tissue 6 | VWR | 82027-446 | Forceps |
| Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100 | VWR | 25608-924 | Cyromold |
| Cryo-oct compund 4 oz | VWR | 25608-930 | Oct compound |
| VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72 | VWR | 48311-703 | Slides |
| VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm | VWR | 48-382-128 | Cover Glass |
| VWR Slide Box True North Fm Pu | VWR | 89140-278 | Slide Box |
| Super HT PAP Pen | VWR | 89427-058 | PAP pen |
| Water RNASe and DNAse free 2 L | VWR | 101454-204 | Nuclease Free Water |
| Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g | VWR | 97061-796 | Tris Buffer |
| Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg | VWR | 97062-048 | Ammonium Chloride Buffer |
| Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene | VWR | 353002 | Tissue Culture Dish |
| Clorox Germicidal Bleach, Regular | VWR | 89501-620 | Clorox Bleach |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml) | Thermo Fischer Scientific | 21-040-CV | PBS, 1x |
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 10-017-CV | DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer Scientific | 35-010-CV | FBS |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Thermo Fischer Scientific | 30-002-Cl | Penicillin Streptomycin |
| Sorvall Biofuge pico | Thermo Fischer Scientific | 75002411 | 13,000 rpm Centrifuge |
References
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