Protocol
بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع الدراسات على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من كلية هنتر في جامعة مدينة نيويورك.
1. إجراءات ما قبل التجربة
- ولدى وصوله إلى منشأة الحيوان، إيواء البداية 3 BALB / ج الفئران إلى قفص مع كبار ورقائق الخشب الفراش تصفيتها. تأكد من أن الفئران لديها حرية الوصول إلى المواد الغذائية، بورينا طعام القوارض والمياه. يجب تغيير الفراش والطعام مرتين في الأسبوع، بينما يجب تنظيف الأقفاص مرة واحدة في الأسبوع.
- حمل التخدير العام في الفئران باستخدام المرذاذ الأيزوفلورين جنبا إلى جنب مع الأكسجين بمعدل تدفق ثابت من 1 L لكل دقيقة. هذا النظام هو الاعتماد على الذات ويشمل المرذاذ الدقة.
- الحيوان الموقف في مربع من البلاستيك الذي يحتوي على المرذاذ الدقة والغاز / نظام مخدر لأنها مرتبطة. حددت في البداية المرذاذ إلى 2.5 حتى الحيوان فاقد الوعي، وعند هذه النقطة خفض المرذاذ إلى 2.
- في ذلك الوقت، والتبديلخط صمام، وختم على مربع وفتحه للمخروط الأنف.
- نقل الحيوان إلى منطقة التحضير، مع مخروط الأنف وضعها بشكل صحيح ومتصل (للتخدير الصيانة).
- إعداد 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 خلايا فأر HCC لزرع في الماوس. BNL 1ME A.7R.1 يجب نموا في المتوسط (10٪ الحرارة المعطل FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و2 مم L-الجلوتامين) تفرخ في طبق زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع الهواء و5٪ CO 2.
- مع حقنة ذات إبرة 20 G، زرع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 خلايا فأر سرطان الكبد في الفص من كبد BALB / ج الفئران لإنتاج الأورام الأولية. بعد الزرع، منزل BALB / ج الفئران في قفص مع متطلبات المنزل بنفس ما قبل الزرع.
- في نقطة النهاية التجريبية، الأدلة السريرية لسرطان الكبد يمكن ملاحظته كما خفض كبير في حالة الجسمتسجيل (الكشف عن عادة بعد 4 أسابيع). عند هذه النقطة، هناك احتمال أن الأورام الأولية قد وضعت في الكبد بينما شكلت ودائع المنتشر في الرئتين. بعد ذلك، تبدأ عملية عزل ونشر تعميم الخلايا السرطانية.
2. جمع الدم الكامل للاعارة ورم عزل الخلايا
ملاحظة: تطهير الوجه الصحيح في منطقة الجراحة والتأكد من أنها خالية من الفوضى. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية أو نقع في مطهر وفقا لتوصية الشركة الصانعة
- التضحية الفئران عن طريق القتل الرحيم إنسانية في التجريبية نقطة النهاية (الأدلة السريرية التنمية ورم). Euthanization من الفئران ينبغي أن تشمل CO 2 الاختناق. مراقبة الفئران بشكل صحيح لتأكيد التخدير يتم توزيعها بشكل صحيح. ينبغي الإفراج عن ثاني أكسيد الكربون ببطء في الغرفة على مدى فترة من 5-10 دقيقة، مما تسبب في توقف التنفس. متابعة من قبل استنزاف داخل القلب وcervicآل التفكك. 5
- استخدام إبرة 25 G تعلق على حقنة 1 مل لجمع الدم الكامل. Heparanize الحقنة مع 0.01 مل الهيبارين. ثقب الجلد على الفور مع إبرة أقل شأنا من xyphisternum في حوالي 45 درجة زاوية. دفع الإبرة ببطء لثقب في القلب، ومن ثم خفض زاوية الإبرة. عقد على نحو مطرد الإبر والمحاقن في المكان، واستخلاص 500 ميكرولتر - 1000 ميكرولتر من الدم الكامل من القلب.
- إزالة المحاقن والإبر ونقل الدم إلى 1.5 مل خالية من مولد الحمى أنبوب المسمى مسبقا. أجهزة الطرد المركزي الدم كله تم جمعها في 1.5 مل خالية من مولد الحمى الأنبوب في 1167 x ج لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: الطرد المركزي يفصل عينة دم كاملة إلى ثلاث طبقات: الطبقة السفلية أو الهيماتوكريت تتكون من خلايا الدم الحمراء، وهي طبقة رقيقة المتوسطة من معطف الشهباء، وطبقة البلازما أعلى. - إزالة البلازما بعناية من قبل pipetting وجمع مثل هذه المعلومات في أنبوب الحرة مولد الحمى 1.5 مل منفصل لفورثتجارب إيه مثل الكشف عن خالية من الخلايا الأحماض النووية 7.
- لعزل تعميم الخلايا السرطانية (CTCs)، وجمع معطف الشهباء إلى منفصل 1.5 مل خالية من مولد الحمى أنبوب استعدادا لخلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل. وهذا أمر ضروري لإزالة كرات الدم الحمراء المتبقية في طبقة معطف الشهباء.
3. وصفة لخلايا الدم الحمراء (RBC) الاحتياطي تحلل
- جعل حل 1 L من RBC تحلل العازلة.
- جعل 500 مل من كلوريد الأمونيوم و 500 مل من تريس. ثم تخلط لإيجاد حل 1 L من RBC تحلل العازلة مع تركيز النهائي من 155 ملم من كلوريد الأمونيوم و 10 ملي تريس.
- العازلة الحل لدرجة الحموضة من 7.5. تخزين العازلة تحلل RBC في 2-8 درجة مئوية، وتقديمهم إلى RT مباشرة قبل الاستعمال.
4. RBC تحلل من معطف بافي
- إضافة 1 مل من RBC تحلل العازلة للخالية من مولد الحمى العقيمة 1.5 مل أنبوب يحتوي على معطف الشهباء التي تم جمعها.
- خلط محتويات الأنبوب بواسطةعكس عدة مرات. احتضان محتويات مختلطة من الأنبوب لمدة 5 دقائق على RT على مقاعد البدلاء. أجهزة الطرد المركزي محتويات المختلطة لمدة 5 دقائق في 1167 ز س.
- بعد الطرد المركزي، وسيتم الحصول على بيليه بيضاء. تجاهل طاف المحمر ببطء وبعناية في المبيض بنسبة 10٪ دون أي تعطيل لبيليه. إذا كان بيليه ليست بيضاء، وإعادة افعل الخطوات 3،1-3،5. زيادة فترة حضانة في RBC العازلة تحلل إلى 10-15 دقيقة قد يكون من المفيد أيضا.
- التخلص الآمن من النفايات البيولوجية مرة واحدة إزالة التلوث من النفايات البيولوجية في التبييض 10٪ كاملة بعد 24 ساعة.
5. نشر في خلية الثقافة
ملاحظة: الخلايا السرطانية يتم عادة بسرعة تنمو الخلايا خلايا الدم البيضاء التي تنتشر بكثرة في المزيج الأصلي الخلايا المزروعة في طبق. بعد التغيير المتكرر للمتوسطة، والممرات لاحقة من CTCs، تتم إزالة كافة خلايا الدم البيضاء ويبقى السكان نقية نسبيا من CTCs.
- بعدالتخلص من طاف في التبييض 10٪، وغسل بيليه بيضاء في 1 المالحة الفوسفات مخزنة مل (PBS) مرة واحدة على الأقل، وresuspend في كامل مستنبت للنشر في ثقافة الخلية.
- بمجرد الانتهاء من غسل، إضافة 1 مل من BNL 1ME مستنبت A.7R.1 (10٪ الحرارة المعطل FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و2mm و L-الجلوتامين) إلى بيليه و resuspend بيليه في مستنبت.
- البذور مزيج معلق للخلايا في طبق ثقافة الخلية. احتضان طبق زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع الهواء و 5٪ CO 2.
- تغيير خلية ثقافة المتوسط كل 2-3 أيام. بعد 5-7 أيام، وسوف CTCs انضمت إلى الطبق زراعة الخلايا والتي المتكاثرة. ستبقى هذه الخلايا قابلة للحياة إلى ما بعد 25 الممرات وبعد تكرار تجميد والذوبان دورات 5.
6. التحقق من سرطان الكبد تداول ورم خط الخلية
- أداء ا ف بolymerase سلسلة من ردود الفعل (PCR) طريقة المستندة إلى تضخيم جزء DNA معين واحد فقط من الجين الماوس β-غلوبين للتأكد من أن الرواية أنشأت خطوط الخلايا CTC هي خلايا فأر مثل الأصلي زرع خط BNL 1ME A.7R.1 HCC. وقد وصفت في الأصل طريقة والتصديق عليها من قبل Steube وآخرون 5،8
- أداء المناعية للعنصر استجابة الكبدية محددة علامة مخيم البروتين مثل 3 3 (CREB3L3) ملزمة باستخدام الأجسام المضادة المحددة. وهذا يؤكد أن الرواية CTCs المنشأة هي في الواقع خلايا الكبد مثل زرع خط الخلية BNL 1ME A.7R.1 الأصلي. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد أظهرت المنهجية الموضحة هنا أن CTCs يمكن عزل. الموت الرحيم كانت الفئران معاملة إنسانية في التجريبية نقطة النهاية. الكربون الاختناق عملية المشاركة ثاني أكسيد، استنزاف داخل القلب، وخلع عنق الرحم. ويوضح التخطيطي من الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء في الشكل 2. تم تجهيز عينات الدم الكامل التي جمعتها استنزاف داخل القلب باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه. وبعد ذلك، تم استخدام الطرد المركزي لتحديد طبقة معطف الشهباء التي تعرضت للتحلل RBC. ثم أعقب ذلك خطوة الطرد المركزي أخرى لجمع بيليه بيضاء التي تم غسلها في برنامج تلفزيوني، ومعلق في كامل مستنبت خلايا لنشر الثقافة في الخلية. وهي القضية التي قد تأتي هي أن بيليه الحصول عليها قد لا تكون واضحة في اللون. هذه المشكلة يمكن حلها بسهولة عن طريق تعديل فترة حضانة في RBC العازلة تحلل عن طريق زيادة إلى 10-15 دقيقة، أو ربما عن طريق تنفيذ ذلك مرات إضافية.صور الممثل CTCs التي يجري نشرها في الثقافة من ترد ثلاثة الفئران مختلفة في الشكل 1 بالمقارنة مع خلايا A.7R.1 BNL 1ME. سوف انتشار السريع والتشكل تساعد في تحديد إذا الخلايا المزروعة هي CTCs. ومع ذلك، تقنيات التحقق مثل PCR والمناعية هو موضح في الخطوات 5.1 - هناك حاجة إلى 5.2 لتأكيد إنشاء خط CTC قابلة للحياة.
الشكل 1. نشر تعميم الخلايا السرطانية (CTCs) في خلية الثقافة من نموذج الفأر مثلي مسانج من سرطان الكبد ورم خبيث. تم نشر خلايا في 15 ملم × 60 ملم أطباق زراعة الخلايا في BNL 1ME A.7R.1 مستنبت. تنتشر الخلايا السرطانية إلى التقيد طبق، وهي واردة من ثلاثة الفئران منفصلة. ظلت الخلايا السرطانية قابلة للحياة من خلال ممرات مستمرة. المرحلة صورة النقيض من CTCOL1MEA081211، CTCOL1MEACTC08291أخذت 1 وCTCOLUF2419 في 40X التكبير (عدسة الهدف) بالمقارنة مع خلايا A.7R.1 BNL 1ME (40X التكبير). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تخطيطي لإجراءات عزل ونشر تعميم الخلايا السرطانية من نظام السرطان نموذج الفأر، وعندما لوحظ الأدلة السريرية لسرطان الخلايا الكبدية كما خفض كبير في حالة الجسم النتيجة، تم جمع الدم كله من الفئران. بعد عدة centrifugations، RBC تحلل، وعدة خطوات غسل، وكانت المصنفة في CTCs في أطباق زراعة الخلايا للنشر. ولوحظ انتشار الخلايا السرطانية بعد عدة أيام. يرجى النقر انهإعادة لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Salt 1 g | VWR | 89508-852 | |
| BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS | VWR | 89511-254 | 1.5 ml pyrogen-free eppendorf Tubes |
| Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in | VWR | BD305125 | 25 G Needle |
| Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack | VWR | BD309659 | 1 ml syringe tip |
| Syringe 1 ml leur lok Pk 100 | VWR | BD309628 | 1 ml syringe |
| VWR Forceps Tissue 6 | VWR | 82027-446 | Forceps |
| Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100 | VWR | 25608-924 | Cyromold |
| Cryo-oct compund 4 oz | VWR | 25608-930 | Oct compound |
| VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72 | VWR | 48311-703 | Slides |
| VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm | VWR | 48-382-128 | Cover Glass |
| VWR Slide Box True North Fm Pu | VWR | 89140-278 | Slide Box |
| Super HT PAP Pen | VWR | 89427-058 | PAP pen |
| Water RNASe and DNAse free 2 L | VWR | 101454-204 | Nuclease Free Water |
| Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g | VWR | 97061-796 | Tris Buffer |
| Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg | VWR | 97062-048 | Ammonium Chloride Buffer |
| Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene | VWR | 353002 | Tissue Culture Dish |
| Clorox Germicidal Bleach, Regular | VWR | 89501-620 | Clorox Bleach |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml) | Thermo Fischer Scientific | 21-040-CV | PBS, 1x |
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 10-017-CV | DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer Scientific | 35-010-CV | FBS |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Thermo Fischer Scientific | 30-002-Cl | Penicillin Streptomycin |
| Sorvall Biofuge pico | Thermo Fischer Scientific | 75002411 | 13,000 rpm Centrifuge |
References
- Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
- van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future. Cancers. 6, 1195-1207 (2014).
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).
- George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. "Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer. Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS one. 8, e63765 (2013).
- Cheng, B., et al. Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture. International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).
- Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction. Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).
- Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S.
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).
- Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).
- De Giorgi, U., et al. Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).
- Eloubeidi, M. A., et al. Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications. The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).
- O'Toole, D., et al. Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration. Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).
