Protocol
윤리 선언문 : 모든 동물 실험은 뉴욕 시립 대학의 헌터 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 사전 실험 절차
- 동물 시설에 도착하면, 처음에 필터링 상단과 우드 칩 침구와 케이지에 3 BALB / c 마우스를 수용. 쥐가 음식, 퓨리나 설치류 우, 물을 무료로 이용하실 수 있습니다 있는지 확인합니다. 케이지가 일주일에 한 번 청소해야합니다 동안 침구와 음식은 일주일에 두 번 변경해야합니다.
- 분당 1 L의 일정한 유속으로 산소와 함께 기화기 이소 플루 란을 이용하여 마우스의 전신 마취를 유도한다. 이 시스템은 자립하고 정밀 기화기를 포함한다.
- 연결된 정밀 기화기와 가스 / 마취제 시스템을 갖는 플라스틱 상자에 위치 동물. 동물이 시점에서 2 기화기을 절감, 의식이 될 때까지 처음에 2.5 기화기를 설정합니다.
- 이 때, 스위치밸브 라인, 박스로 밀봉하고 노즈콘에 개방.
- 노우즈 콘 (유지 마취)의 설치 위치와 접속하여, 준비 공간에 동물을 이동.
- 마우스 당 주입 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 마우스의 간세포 암 세포를 준비합니다. BNL 1ME A.7R.1 매체에서 성장한다 (10 % 열 불 활성화 FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2 mM의 글루타민 L) 및 5 %의 공기와 가습 된 배양기에서 37 ℃에서 세포 배양 접시에서 배양 CO 2.
- 주사기 20 G 바늘을 갖는, BALB / c 마우스의 간의 로브로 5 × 106 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포를 함유하는 PBS의 임플란트 100 μL은 차 종양을 생성한다. 착상 후, 집 착상 전 같은 집의 요구 사항에 케이지의 BALB / c 마우스.
- 실험 종료 시점에서, 간세포 암종의 임상 적 증거는 신체 상태의 상당한 감소로서 관찰 할(일반적으로 사주 후 감지) 점수. 이 시점에서, 증착물은 전이성 폐에서 형성 한 주 동안 종양 간에서 개발 한 것을 가능성이있다. 그 후, 종양 세포 순환의 분리 및 전파의 과정을 시작.
종양 세포 분리를 순환 전혈 2. 컬렉션
참고 : 제대로 수술 영역을 소독하고 혼란없는 있는지 확인합니다. 모든 수술 도구를 압력솥 또는 제조업체의 권장 사항에 따라 살균제에 담가
- 실험 종료 시점에서 인도적인 안락사 (종양 개발의 임상 적 증거)에 의해 쥐를 희생. 마우스의 Euthanization은 이산화탄소 질식을 포함한다. 마취를 확인하기 위해 적절하게 마우스를 관찰하는 것은 제대로 배포됩니다. 호흡 정지의 원인을 10 분 - 이산화탄소 5 걸쳐 챔버 내로 서서히 방출한다. 심장 내 방혈 및 cervic에 의해 수행알 전위. (5)
- 전체 혈액의 수집을 위해 1 ML의 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 사용합니다. 0.01 ㎖의 헤파린 주사기 Heparanize. xyphisternum 약 45 ° 각도로 떨어지는 바늘 즉시 찔린 피부. 심장에 구멍을 천천히 바늘을 전진하고 바늘의 각도를 낮 춥니 다. 꾸준히 장소에 바늘과 주사기를 개최, 500 ㎕를 끌어 - 마음에서 전체 혈액의 1,000 μl를.
- 주사기와 바늘을 제거하고 미리 라벨링 1.5 ML의 발열이없는 튜브에 혈액을 전송합니다. 5 분 동안 1,167 XG에 1.5 ml의 무 발열원 튜브에 수집 전혈을 원심 분리기.
주 : 원심 세 층으로 전체 혈액 샘플을 분리한다 : 적혈구, 버피 코트의 중간 박막과 상부 플라즈마 층으로 이루어진 하부 층 또는 헤마토크리트. - 피펫 조심스럽게 플라즈마를 제거하고 푸르트에 대해 별도의 1.5 ml의 발열이없는 튜브로 수집휴대없는 핵산 (7)의 검출과 같은 어 실험.
- 순환 성 종양 세포 (CTCS)의 분리를 위해, 적혈구 (RBC)의 용해에 대비 별도의 1.5 ml의 무 발열원 튜브에 버피 코트를 수집한다. 이를 버피 코트 층에 잔류 적혈구를 제거 할 필요가있다.
적혈구 (RBC) 용해 버퍼 3. 레시피
- RBC 용해 버퍼의 1 L 솔루션을합니다.
- 염화 암모늄 500 mL 및 트리스 500 mL로한다. 이어서 염화 암모늄 155 mM의 트리스 10 mM의 최종 농도와 적혈구 용해 완충액 1 L의 용액을 만들기 위해 혼합한다.
- 7.5의 pH로 완충 용액. 2-8 ℃에서 적혈구 용해 완충 용액을 저장하고, 직전에 사용하고 RT로 가져온다.
버피 코트 4. 적혈구 용해
- 수집 된 버피 코트를 포함하는 무균 무 발열원 1.5 ㎖의 튜브에 적혈구 용해 완충액 1 ㎖를 추가한다.
- 하여 튜브의 내용물을 혼합여러 번 반전. 벤치에 RT에서 5 분 동안 튜브의 내용물을 혼합하여 배양한다. 1,167 X g에서 5 분간 원심 분리하여 혼합 내용.
- 원심 분리 후, 펠릿 백탁이 얻어 질 것이다. 펠릿에 대한 중단하지 않고 차분히 10 % 표백제에 붉은 상층 액을 버린다. 3.5 - 펠릿 백탁 없으면 다시 DO 3.1 단계. 10 RBC 용해 완충액에서 항온 배양 시간을 증가 - 15 분 또한 도움이 될 수있다.
- 10 % 표백제의 생물학적 폐기물의 오염 제거는 24 시간 후 완료되면 안전하게 생물학적 폐기물을 폐기하십시오.
세포 배양 5. 전파
주 : 종양 세포는 전형적으로 세포를 빠르게 접시에 세포를 접종 원래 믹스 풍부 백혈구 증가하고있다. 매체의 반복 변경 CTCS 후속 통로 다음, 모든 백혈구 제거되고 CTCS의 비교적 순수한 인구가 남아있다.
- 후10 % 표백제로 상등액을 버리고, 세포 배양 물에서 증식을 위해 완전 배양 배지에서 적어도 한 번은 1 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS)에 백탁 펠렛을 세척하고 재현 탁.
- 세척이 완료되면, 펠렛을 완전 BNL 1ME A.7R.1 배지 (FBS 불 활성화 된 10 %의 열, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2mM의 글루타민) 1 ㎖를 추가하고 배지에 펠렛을 재현 탁.
- 세포 배양 접시에 세포를 재현 탁 믹스 시드. 공기 및 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포 배양 접시를 배양한다.
- 모든 2~3일 세포 배양 배지를 변경한다. 5-7일 후 CTCS는 세포 배양 접시에 부착 및 증식 시작한다. 이 세포들은 25 유로 이상 반복 동결 융해 사이클 (5) 후 가능한 유지됩니다.
간세포 암의 6 검증은 종양 세포 라인을 순환
- AP를 수행연쇄 반응 (PCR) 기반 방법 olymerase, 소설 CTC 세포주 원래 주입 BNL 1ME A.7R.1 HCC 라인처럼 마우스 세포 인 확립 확인하는 마우스 β 글로빈 유전자의 단지 하나의 특정 DNA 세그먼트를 증폭. 방법은 원래 기술과 Steube 등에 의해 확인되었다. 5,8
- 특정 항체를 사용하여 단백질 3 추천 (CREB3L3)를 결합 간세포 특이 마커 캠프 응답 요소에 대한 면역 염색 수행합니다. 이 설립 CTCS가 참으로 원래의 이식 BNL 1ME A.7R.1 세포주처럼 간세포 그 소설을 확인합니다. (5)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기서 설명한 방법론은 CTCS가 분리 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 마우스는 인도적 실험 엔드 포인트에서 안락사시켰다. 프로세스 관련 이산화탄소 질식, 심장 내 방혈 및 경추 탈구. 과정의 주요 단계를 개략적으로는도 2에 도시되어있다. 내부 - 심장 방혈로 수집 전혈 시료는 전술 프로토콜을 이용하여 처리 하였다. 그 후, 원심 분리 RBC 용해시켰다 버피 코트 층을 결정하는데 사용 하였다. 이 후 PBS로 세척 하였다 백탁 펠렛을 수집하는 또 다른 원심 분리 단계에 이어, 세포 배양에서 전파 완전한 세포 배양 배지에 재현 탁 하였다. 올 수있는 문제가 얻어 펠렛은 색상이 명확하지 않을 수 있습니다. 이를 추가 시간을 행하여 아마도 15 분, 또는 -이 문제는 쉽게 10로 증가시켜 적혈구 용해 완충액에서 배양 시간을 변경함으로써 해결 될 수있다.BNL 1ME A.7R.1의 세포에 비해 세 가지 다른 생쥐는도 1에 도시되어 CTCS에서의 대표적인 이미지는 배양으로 전파된다. 빠른 증식과 형태는 시드 세포가 CTCS 인 경우 식별하는 데 도움이됩니다. 그러나, 단계 5.1에 기재된 예컨대 PCR과 같은 면역 검증 기법 - 5.2 CTC 가능한 라인의 설정을 확인하기 위해 필요하다.
의 동소 이식 동계 마우스 모델에서 세포 배양에 종양 세포 (CTCS)를 순환 그림 1. 전파 간세포 암 전이. 세포는 BNL 1ME A.7R.1 배양 배지에서 15mm X 60mm 세포 배양 접시에 전파되었다. 증식 종양 세포는 접시에 부착하고 별도의 세 가지 마우스에서 표시됩니다. 종양 세포는 연속적 통로를 통해 실행 가능한 남아있다. CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC08291의 위상 대비 이미지1 CTCOLUF2419가 BNL 1ME의 A.7R.1 세포 (40X 배율)에 비해 40 배의 배율 (대물 렌즈)에서 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
단리 및 전파하는 마우스 암 모델 시스템에서 종양 세포 순환 절차도 2 회로도. 간암 임상 증거가 신체 상태 점수 상당한 감소로 관찰 한 결과, 전혈은 마우스로부터 수거 하였다. 몇 회 원심, 적혈구 용해, 여러 세척 단계 후, CTCS는 전파 세포 배양 접시에 씨앗을 품고 있었다. 종양 세포의 증식이 며칠 후에 관찰 하였다. 그 클릭하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 다시.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Heparin Sodium Salt 1 g | VWR | 89508-852 | |
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS | VWR | 89511-254 | 1.5 ml pyrogen-free eppendorf Tubes |
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in | VWR | BD305125 | 25 G Needle |
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack | VWR | BD309659 | 1 ml syringe tip |
Syringe 1 ml leur lok Pk 100 | VWR | BD309628 | 1 ml syringe |
VWR Forceps Tissue 6 | VWR | 82027-446 | Forceps |
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100 | VWR | 25608-924 | Cyromold |
Cryo-oct compund 4 oz | VWR | 25608-930 | Oct compound |
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72 | VWR | 48311-703 | Slides |
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm | VWR | 48-382-128 | Cover Glass |
VWR Slide Box True North Fm Pu | VWR | 89140-278 | Slide Box |
Super HT PAP Pen | VWR | 89427-058 | PAP pen |
Water RNASe and DNAse free 2 L | VWR | 101454-204 | Nuclease Free Water |
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g | VWR | 97061-796 | Tris Buffer |
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg | VWR | 97062-048 | Ammonium Chloride Buffer |
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene | VWR | 353002 | Tissue Culture Dish |
Clorox Germicidal Bleach, Regular | VWR | 89501-620 | Clorox Bleach |
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml) | Thermo Fischer Scientific | 21-040-CV | PBS, 1x |
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 10-017-CV | DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer Scientific | 35-010-CV | FBS |
Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Thermo Fischer Scientific | 30-002-Cl | Penicillin Streptomycin |
Sorvall Biofuge pico | Thermo Fischer Scientific | 75002411 | 13,000 rpm Centrifuge |
References
- Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
- van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future. Cancers. 6, 1195-1207 (2014).
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).
- George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. "Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer. Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS one. 8, e63765 (2013).
- Cheng, B., et al. Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture. International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).
- Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction. Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).
- Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S.
Cancer micrometastases. Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009). - Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).
- Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).
- De Giorgi, U., et al. Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).
- Eloubeidi, M. A., et al. Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications. The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).
- O'Toole, D., et al. Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration. Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).