Protocol
Etikk Uttalelse: Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Hunter College of The City University of New York.
1. Pre-eksperimentet Prosedyrer
- Ved ankomst til dyret anlegget, først huse 3 BALB / c-mus i et bur med en filtrert topp og treflis sengetøy. Sørg for at musene har fri tilgang til mat, Purina gnagerfor, og vann. Sengetøy og mat bør endres to ganger i uken, mens bur bør rengjøres en gang i uken.
- Indusere generell anestesi i mus ved hjelp av en isofluran fordamper sammen med oksygen ved en konstant strømningshastighet på 1 l pr min. Systemet er selvforsynte og innbefatter en presisjonsfordamper.
- Stilling dyr i en plastboks som har presisjonen fordamper og gass / bedøvende system koblet til den. Utgangspunktet satt vaporizer til 2,5 før dyret er bevisstløs, og da senke fordamper til to.
- På den tiden, slårventil linje, tetting til boksen og åpne det til nesen membran.
- Flytt dyret til forberedelse området, med nesen membran plassert riktig og koblet (for vedlikehold anestesi).
- Forbered 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus HCC celler for implantasjon per mus. BNL 1ME A.7R.1 skal vokse i medium (10% varmeinaktivert FBS, 1% penicillin / streptomycin og 2 mM L-Glutamin) inkubering i en cellekulturskål ved 37 ° C i en fuktet inkubator med luft og 5% CO 2.
- Med en sprøyte med en 20 G nål, for å implantat 100 ul PBS inneholdende 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mus hepatocellulær carcinoma celler inn i en flik av leveren hos BALB / c-mus fremstille de primære svulster. Post-implantasjon, huset de BALB / c mus i et bur med samme hus krav som pre-implantasjon.
- På den eksperimentelle endepunktet, er observer som betydelig reduksjon i kroppens tilstand kliniske tegn på leverkreftscorer (vanligvis oppdaget etter 4 uker). På dette punktet, er det en sannsynlighet for at primærsvulster har utviklet seg i leveren, mens metastatiske er dannet avleiringer i lungene. Deretter starte prosessen med isolering og formering av sirkulerende tumorceller.
2. Innsamling av Whole Blood for Sirkulasjons Tumor Cell Isolation
MERK: Riktig renses operasjonen området og sørge for at det er ryddig. Autoklav alle kirurgiske instrumenter eller suge i et desinfeksjonsmiddel i henhold til produsentens anbefaling
- Ofre mus ved human avlivning ved eksperimentelle endepunktet (kliniske tegn på svulst utvikling). Euthanization av mus bør involvere CO 2 kvelning. Observere mus riktig å bekrefte anestesi er riktig fordelt. Karbondioksid bør slippes sakte inn i kammeret i løpet av en periode på 5 - 10 min, forårsaker respirasjonsstans. Følg med intrakardiell exsanguination og cervical forvridning. 5
- Bruke en 25 G nål festet til en 1 ml sprøyte for innsamling av helblod. Heparanize sprøyten med 0,01 ml heparin. Punktering huden umiddelbart med nålen dårligere til xyphisternum ved ca 45 ° vinkel. Avansere nålen sakte å punktere hjertet, og senk vinkelen på nålen. Stadig holde nålen og sprøyten på plass, og trekke ut 500 mL - 1000 mL fullblod fra hjertet.
- Fjern sprøyten og nålen og overføre blod inn i en pre-merket 1,5 ml pyrogenfrie tube. Sentrifuger fullblod samlet i 1,5 ml pyrogenfritt rør ved 1167 xg i 5 min.
MERK: sentrifugering separerer hele blodprøven i tre lag: det nederste eller hematokritt lag bestående av røde blodlegemer, et mellomliggende tynt lag av buffy coat og et topp plasmasjikt. - Fjern plasma nøye ved pipettering og samle det i en egen 1,5 ml pyrogenfrie tube for Furtheh eksperimenter slik som påvisning av cellefrie nukleinsyrer 7.
- For isolering av sirkulerende tumorceller (CTCS), samle buffy coat i et separat 1,5 ml pyrogenfritt rør som forberedelse for røde blodceller (RBC) lysering. Dette er nødvendig for å fjerne rester av RBCs i buffy coat-laget.
3. Oppskrift på røde blodceller (RBC) Lysis Buffer
- Foreta en 1 l løsning av RBC lysis buffer.
- Gjør en 500 ml salmiakk og 500 ml Tris. Bland deretter for å skape en 1 l løsning av RBC lysis buffer med en endelig konsentrasjon på 155 mM av ammoniumklorid og 10 mM Tris.
- Bufre oppløsningen til en pH-verdi på 7,5. Oppbevar RBC lysis buffer på 2-8 ° C, og bringe til RT umiddelbart før bruk.
4. RBC Lysis av Buffy Coat
- Tilsett 1 ml av RBC lyseringsbuffer til det sterile pyrogenfri 1,5 ml rør som inneholder det oppsamlede buffy coat.
- Blande innholdet i røret ettersnu flere ganger. Inkuber de blandet innholdet i røret i 5 min ved romtemperatur på benken. Sentrifuger blandede innholdet i 5 min ved 1167 x g.
- Etter sentrifugering blir et hvitaktig pellet oppnås. Kast rødlig supernatanten sakte og forsiktig inn 10% blekemiddel uten avbrudd i pelleten. Hvis pellet ikke er hvitaktig, trinn 3.1 re-do - 3.5. Økning av inkubasjonstiden i RBC lyseringsbuffer til 10 - 15 minutter, kan også være nyttig.
- Trygg kast det biologiske avfallet gang dekontaminering av biologisk avfall i 10% blekemiddel er ferdig etter 24 timer.
5. Formering i cellekultur
MERK: Kreftceller er vanligvis raskt voksende celler hvite blodceller som er rikelig i den opprinnelige blanding av celler seeded i formen. Etter gjentatt forandring av medium, og etterfølgende avsnitt av CTCS, er alle de hvite blodcellene fjernet og en relativt ren populasjon av CTCS gjenstår.
- Etterforkaste supernatanten til 10% blekemiddel, vaske hvitaktig pellet i 1 ml fosfat-buffret saltvann (PBS) minst en gang, og resuspender i fullstendig kulturmedium for forplantning i cellekultur.
- Når vaskingen er fullført, tilsett 1 ml komplett BNL 1ME A.7R.1 kulturmedium (10% varmeinaktivert FBS, 1% penicillin / streptomycin og 2 mM L-Glutamin) til pelleten og resuspender pelleten i kulturmediet.
- Seed den resuspenderte blanding av celler i en cellekulturskål. Inkuber cellekulturskål ved 37 ° C i en fuktet inkubator med luft og 5% CO2.
- Endre cellekulturmediet hver to til tre dager. Etter fem til syv dager, vil CTCS har levd opp til cellekulturen fatet og begynte voksende. Disse cellene vil være levedyktig utover 25 passasjer og etter gjentatte frysing og tining sykluser 5.
6. Kontroll av leverkreft Sirkulasjons Tumor Cell Linje
- Utfør apolymerase kjedereaksjon (PCR) -basert metode for å forsterke bare en bestemt DNA-segment av mus β-globin-genet for å bekrefte at de nye etablerte CTC cellelinjer er museceller som opprinnelig implanterte BNL 1ME A.7R.1 HCC linje. Metoden ble opprinnelig beskrevet og validert av Steube et al. 5,8
- Utføre farging for hepatocytt-spesifikk markør cAMP-responsive element bindende protein 3-lignende 3 (CREB3L3) ved hjelp av et spesifikt antistoff. Dette vil bekrefte at romanen etablerte CTCS er faktisk leverceller som den opprinnelige implantert BNL 1ME A.7R.1 cellelinje. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodikken er beskrevet her, har vist at CTCS kan isoleres. Musene ble humant avlivet ved eksperimentelle endepunktet. Prosessen involverte karbondioksid kvelning, intra-hjerte exsanguination, og halshugging. En skjematisk viktige trinn i fremgangsmåten er illustrert i figur 2. Hele blodprøver tatt ved intra-hjerteblodtapping ble bearbeidet ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor. Etter som sentrifugering ble anvendt for å bestemme buffy coat-lag som ble utsatt for RBC lysis. Dette ble deretter fulgt av et sentrifugeringstrinn for å samle et hvitaktig pellet som ble vasket i PBS og resuspendert i fullstendig cellekulturmedium for forplantning i cellekultur. Et problem som kan komme opp er at den oppnådde pellet ikke kan være klar farge. Dette problem kan lett løses ved å modifisere inkubasjonstiden i RBC lyseringsbuffer ved å øke den til 10 - 15 min, eller eventuelt ved å utføre det ytterligere ganger.Representative bilder av CTCS blir dyrket i kultur fra tre forskjellige mus er vist i figur 1, sammenlignet med BNL 1ME A.7R.1 celler. Rask spredning og morfologi vil bidra til å identifisere hvis celler seeded er CTCS. Imidlertid verifikasjon teknikker så som PCR og immunfarging som beskrevet i trinn 5.1 - 5.2 er nødvendig for å bekrefte etablering av en levedyktig CTC linje.
Figur 1. Utbredelse av sirkulerende tumorceller (CTCS) i cellekultur fra en ortotopiske syngeniske musemodell for leverkreft metastaser. Cellene ble dyrket i 15 mm x 60 mm cellekultur retter i BNL 1ME A.7R.1 dyrkingsmedium. Prolifererende tumorceller levd å rett og er vist fra tre separate mus. Tumorceller har vært levedyktig gjennom kontinuerlige passasjer. Fase kontrast bilde av CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 og CTCOLUF2419 ble tatt på 40X forstørrelse (objektiv) i forhold til BNL 1ME A.7R.1 celler (40X forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk av Prosedyre for isolering og forplanter seg sirkulerende tumorceller fra en mus Cancer modellsystem. Når kliniske tegn på leverkreft ble observert som signifikant reduksjon i kropps tilstand resultatet, ble fullblod oppsamlet fra mus. Etter flere sentrifuger, RBC lyse, og flere vasketrinn ble CTCS sådd i cellekultur retter for forplantning. Tumorcelleproliferasjon ble observert etter flere dager. Klikk hanre for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Heparin Sodium Salt 1 g | VWR | 89508-852 | |
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS | VWR | 89511-254 | 1.5 ml pyrogen-free eppendorf Tubes |
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in | VWR | BD305125 | 25 G Needle |
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack | VWR | BD309659 | 1 ml syringe tip |
Syringe 1 ml leur lok Pk 100 | VWR | BD309628 | 1 ml syringe |
VWR Forceps Tissue 6 | VWR | 82027-446 | Forceps |
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100 | VWR | 25608-924 | Cyromold |
Cryo-oct compund 4 oz | VWR | 25608-930 | Oct compound |
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72 | VWR | 48311-703 | Slides |
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm | VWR | 48-382-128 | Cover Glass |
VWR Slide Box True North Fm Pu | VWR | 89140-278 | Slide Box |
Super HT PAP Pen | VWR | 89427-058 | PAP pen |
Water RNASe and DNAse free 2 L | VWR | 101454-204 | Nuclease Free Water |
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g | VWR | 97061-796 | Tris Buffer |
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg | VWR | 97062-048 | Ammonium Chloride Buffer |
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene | VWR | 353002 | Tissue Culture Dish |
Clorox Germicidal Bleach, Regular | VWR | 89501-620 | Clorox Bleach |
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml) | Thermo Fischer Scientific | 21-040-CV | PBS, 1x |
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 10-017-CV | DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer Scientific | 35-010-CV | FBS |
Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Thermo Fischer Scientific | 30-002-Cl | Penicillin Streptomycin |
Sorvall Biofuge pico | Thermo Fischer Scientific | 75002411 | 13,000 rpm Centrifuge |
References
- Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
- van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future. Cancers. 6, 1195-1207 (2014).
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).
- George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. "Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer. Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS one. 8, e63765 (2013).
- Cheng, B., et al. Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture. International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).
- Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction. Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).
- Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S.
Cancer micrometastases. Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009). - Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).
- Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).
- De Giorgi, U., et al. Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).
- Eloubeidi, M. A., et al. Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications. The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).
- O'Toole, D., et al. Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration. Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).