Protocol
Déclaration éthique: Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) du Hunter College de la City University de New York.
1. Procédures pré-expérimentation
- À l'arrivée à l'animalerie, Maison initialement 3 souris BALB / c à une cage avec une literie de haut et de copeaux de bois filtré. Veiller à ce que les souris ont un accès libre à la nourriture, nourriture pour rongeurs Purina, et de l'eau. Literie et la nourriture doivent être changés deux fois par semaine, alors que les cages doivent être nettoyés une fois par semaine.
- Induire une anesthésie générale chez la souris en utilisant un vaporisateur isoflurane avec de l'oxygène à un débit constant de 1 litre par minute. Le système est autonome et comprend un vaporisateur de précision.
- Position animal dans une boîte en plastique sur lequel le vaporisateur de précision et / système de gaz anesthésique est connecté. Initialement fixé le vaporisateur à 2,5 jusqu'à ce que l'animal est inconscient, à quel point réduire le vaporisateur à 2.
- À ce moment, mettez leLigne de soupape, en le scellant à la surface, et l'ouvrir pour le cône de nez.
- Déplacez l'animal à la zone de préparation, avec le cône de nez placé et raccordé correctement (pour entretien de l'anesthésie).
- Préparer 5 × 10 6 cellules HCC de la souris BNL 1ME A.7R.1 pour l'implantation par souris. BNL 1ME A.7R.1 devrait être de plus en plus dans le milieu (10% de FBS inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) l'incubation dans une boîte de culture de cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec de l'air et 5% CO 2.
- Avec une seringue ayant une aiguille G 20, l'implant 100 pi de PBS contenant 5 x 10 6 cellules de carcinome hépatocellulaire de souris BNL 1ME A.7R.1 dans un lobe de le foie des souris BALB / c pour produire les tumeurs primaires. Post-implantation, maison, les souris BALB / c dans une cage avec les mêmes exigences de maison comme pré-implantatoire.
- Au point de fin d'expérimentation, des signes cliniques de carcinome hépatocellulaire est observable comme réduction significative de la condition corporellemarquer (généralement détectée après 4 semaines). À ce stade, il est probable que les tumeurs primaires ont développé dans le foie tandis que les dépôts métastatiques ont formé dans les poumons. Par la suite, commence le procédé de l'isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes.
2. Collecte de sang total pour la circulation des cellules tumorales Isolement
REMARQUE: correctement filtrées la zone de la chirurgie et assurez-vous qu'il est sans encombrement. Autoclave tous les instruments chirurgicaux ou faire tremper dans un désinfectant selon les recommandations du fabricant
- Sacrifiez souris par euthanasie au expérimentale point final (signes cliniques de développement de la tumeur). Euthanasie des souris devrait impliquer CO 2 asphyxie. Observez la souris correctement pour confirmer l'anesthésie est correctement distribué. Le dioxyde de carbone doit être libéré lentement dans la chambre sur une période de 5 à 10 min, ce qui provoque un arrêt respiratoire. Suivez par exsanguination intracardiaque et cervical dislocation. 5
- Utiliser une aiguille 25 G fixée à une seringue de 1 ml pour la collecte de sang total. Heparanize la seringue avec 0,01 ml d'héparine. Ponction immédiatement la peau avec l'aiguille inférieur au xyphisternum à environ 45 ° d'angle. Avancez lentement aiguille pour percer le cœur, puis abaissez l'angle de l'aiguille. Maintenir fermement l'aiguille et la seringue en place, et d'en tirer 500 pi - 1000 ul de sang entier du cœur.
- Retirez la seringue et l'aiguille et transférer le sang dans un tube apyrogène 1,5 ml pré-étiquetés. Centrifuger le sang total recueilli dans tube de 1,5 ml apyrogène à 1167 g pendant 5 min.
REMARQUE: La centrifugation sépare l'échantillon de sang en trois couches: la couche inférieure ou de l'hématocrite constitué de globules rouges, une couche mince intermédiaire de couche leuco-plaquettaire, et une couche supérieure de plasma. - Retirer soigneusement le plasma par pipetage et la collecte dans un tube de 1,5 ml apyrogène séparé pour Furthexpériences telles que la détection des acides nucléiques sans cellules 7 RE.
- Pour l'isolement de cellules tumorales circulantes (CTC), de recueillir la couche leucocytaire dans un tube de 1,5 ml apyrogène séparée en préparation de globules rouges (RBC) lyse. Cela est nécessaire pour éliminer les globules rouges résiduels dans la couche leuco-plaquettaire.
3. Recette pour Red Blood Cell (RBC) tampon de lyse
- Ajouter une solution à 1 L de tampon de lyse RBC.
- Faire un 500 ml de chlorure d'ammonium et 500 ml de Tris. Puis mélanger pour créer une solution à 1 L de tampon de lyse RBC avec une concentration finale de 155 mM de chlorure d'ammonium et 10 mM de Tris.
- Tamponner la solution à un pH de 7,5. Conservez le tampon de lyse RBC à +2 et +8 ° C, et porter à RT immédiatement avant l'utilisation.
4. RBC Lysis de Buffy Coat
- Ajouter 1 ml de tampon de lyse RBC au tube de 1,5 ml apyrogène stérile contenant la couche leucocyto-plaquettaire collectée.
- Mélanger le contenu du tube parinverser plusieurs fois. Incuber le contenu mélangé du tube pendant 5 min à température ambiante sur le banc. Centrifuger les contenus mixtes pendant 5 min à 1167 x g.
- Après centrifugation, un culot blanchâtre sera obtenu. Jeter le surnageant rougeâtre lentement et avec précaution dans l'eau de Javel à 10% sans aucune interruption au culot. Si la pastille est pas blanchâtre, refaire les étapes 03.01 à 03.05. L'augmentation de la durée d'incubation dans un tampon de lyse RBC à 10 - 15 min peut également être utile.
- Éliminer en toute sécurité les déchets biologiques, une fois la décontamination des déchets biologiques dans 10% de javel est complète après 24 h.
5. Propagation dans la culture cellulaire
REMARQUE: Les cellules tumorales sont généralement des cellules en croissance rapide des globules blancs qui sont abondants dans le mélange initial de cellules ensemencées dans le plat. Suite à changement répété de support, et les passages subséquents de CTC, les globules blancs sont éliminés et une population relativement pur de CTC reste.
- Aprèsélimination du surnageant dans 10% d'agents blanchissants, laver le culot dans une solution saline blanchâtre ml tamponnée au phosphate (PBS) au moins une fois, et remettre en suspension dans un milieu de culture complet pour une propagation dans la culture cellulaire.
- Une fois lavage est terminée, ajouter 1 ml de milieu de culture complet A.7R.1 BNL 1ME (10% de FBS inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) à la pastille et remise en suspension du culot dans du milieu de culture.
- Ensemencer le mélange remis en suspension de cellules dans une boîte de culture cellulaire. Incuber la boîte de culture cellulaire à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec de l'air et 5% de CO 2.
- Changer le milieu de culture cellulaire toutes les deux à trois jours. Après cinq à sept jours, CTC aura adhéré à la boîte de culture cellulaire et a commencé à proliférer. Ces cellules vont rester viable au-delà de 25 passages et après plusieurs cycles gel et de dégel 5.
6. La vérification du carcinome hépatocellulaire circulation Tumor Cell Line
- Effectuer APolymerase réaction en chaîne (PCR) à base, pour amplifier un seul segment d'ADN spécifique du gène β-globine souris pour confirmer que le roman a créé des lignées de cellules de la CCT sont des cellules de souris, comme la ligne BNL 1ME A.7R.1 HCC implanté originale. Méthode a été décrite et validée par Steube et al. 5,8
- Effectuer immunocoloration pour le spécifique hépatocytes marqueur AMPc protéine de liaison 3-like 3 (CREB3L3) en utilisant un anticorps spécifique élément sensible. Cela confirmera ce roman CTC sont en effet établies hépatocytes comme la ligne originale implanté des cellules BNL 1ME A.7R.1. 5
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Representative Results
La méthodologie décrite ici a montré que les CTC peuvent être isolés. Les souris ont été euthanasiés au expérimentale point final. Le processus impliqué asphyxie du dioxyde de carbone, l'exsanguination intra-cardiaque et dislocation cervicale. Un schéma d'étapes de cette intervention sont illustrées sur la figure 2. Des échantillons de sang total prélevé par exsanguination intracardiaque ont été traitées selon le protocole décrit ci-dessus. Après quoi, la centrifugation a été utilisée pour déterminer la couche leucocyto-plaquettaire qui a été soumis à la lyse RBC. Ceci a été suivi par une autre étape de centrifugation pour recueillir un culot blanchâtre qui a été lavé dans du PBS et remises en suspension dans du milieu complet de culture cellulaire pour la propagation dans la culture cellulaire. Un problème qui peut arriver est que le culot obtenu peut ne pas être de couleur claire. Ce problème peut être résolu facilement en modifiant le temps d'incubation dans un tampon de lyse RBC en le portant à 10 - 15 minutes, ou éventuellement par l'exécutant fois supplémentaires.Des images représentatives de CTC se propageant en culture à partir de trois souris différents sont représentés sur la figure 1 par rapport aux cellules de A.7R.1 BNL 1ME. La prolifération rapide et la morphologie aideront à identifier si les cellules sont ensemencées CTC. Cependant, les techniques de vérification comme PCR et immunologique décrites dans les étapes 5.1 - 5.2 sont nécessaires pour confirmer la mise en place d'une ligne de la CCT viable.
Figure 1. Propagation de cellules tumorales circulantes (CTC) dans Cell Culture à partir d'un modèle de souris orthotopique Syngénique de carcinome hépatocellulaire Métastases. Les cellules ont été propagées dans 15 mm x 60 mm boîtes de culture de cellules dans un milieu de culture BNL 1ME A.7R.1. Cellules tumorales proliférantes respectées à plat et sont présentés à partir de trois souris distincts. Les cellules tumorales sont restées viables à travers des passages continus. Image en contraste de phase de CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 et CTCOLUF2419 ont été prises à un grossissement de 40X (d'objectif) par rapport aux cellules A.7R.1 BNL 1ME (40X grossissement). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma de la procédure d'isolement et de la propagation des cellules tumorales circulantes à partir d'un modèle de système cancer souris. Lorsque la preuve clinique du carcinome hépatocellulaire a été observée comme une réduction significative du score d'état corporel, le sang total ont été collectées à partir de souris. Après plusieurs centrifugations, RBC lyse, et plusieurs étapes de lavage, les CTC ont été ensemencées dans des boîtes de culture cellulaire pour la propagation. Prolifération de cellules tumorales n'a été observée après plusieurs jours. S'il vous plaît cliquer ilre pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Salt 1 g | VWR | 89508-852 | |
| BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS | VWR | 89511-254 | 1.5 ml pyrogen-free eppendorf Tubes |
| Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in | VWR | BD305125 | 25 G Needle |
| Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack | VWR | BD309659 | 1 ml syringe tip |
| Syringe 1 ml leur lok Pk 100 | VWR | BD309628 | 1 ml syringe |
| VWR Forceps Tissue 6 | VWR | 82027-446 | Forceps |
| Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100 | VWR | 25608-924 | Cyromold |
| Cryo-oct compund 4 oz | VWR | 25608-930 | Oct compound |
| VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72 | VWR | 48311-703 | Slides |
| VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm | VWR | 48-382-128 | Cover Glass |
| VWR Slide Box True North Fm Pu | VWR | 89140-278 | Slide Box |
| Super HT PAP Pen | VWR | 89427-058 | PAP pen |
| Water RNASe and DNAse free 2 L | VWR | 101454-204 | Nuclease Free Water |
| Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g | VWR | 97061-796 | Tris Buffer |
| Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg | VWR | 97062-048 | Ammonium Chloride Buffer |
| Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene | VWR | 353002 | Tissue Culture Dish |
| Clorox Germicidal Bleach, Regular | VWR | 89501-620 | Clorox Bleach |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml) | Thermo Fischer Scientific | 21-040-CV | PBS, 1x |
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 10-017-CV | DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer Scientific | 35-010-CV | FBS |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Thermo Fischer Scientific | 30-002-Cl | Penicillin Streptomycin |
| Sorvall Biofuge pico | Thermo Fischer Scientific | 75002411 | 13,000 rpm Centrifuge |
References
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- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).
- George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. "Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer. Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).
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