Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutti gli studi su animali sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) di Hunter College della City University di New York.

1. Procedure di pre-esperimento

1. All'arrivo alla struttura animale, inizialmente ospitare 3 topi BALB / c ad una gabbia con un letto di top e trucioli di legno filtrata. Assicurarsi che i topi hanno libero accesso a cibo, Purina roditori chow, e acqua. Biancheria da letto e cibo devono essere cambiati due volte a settimana, mentre le gabbie devono essere puliti una volta a settimana.
2. Un'anestesia generale in topi usando un vaporizzatore isoflurano con ossigeno ad un flusso costante di 1 L per min. Il sistema è autosufficiente e comprende un vaporizzatore di precisione.
3. Posizione animale in una scatola di plastica che ha il vaporizzatore precisione e gas / sistema anestetico ad esso collegato. Inizialmente impostare il vaporizzatore di 2,5 fino a quando animale è incosciente, a questo punto abbassare il vaporizzatore a 2.
4. A quel tempo, accendere illinea di valvole, sigillandolo alla casella e aprendo al cono.
5. Spostare l'animale alla zona di preparazione, con l'ogiva posizionato correttamente e collegato (per anestesia di mantenimento).
6. Preparare 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 cellule del mouse HCC per l'impianto per il mouse. BNL 1ME A.7R.1 dovrebbero crescere in mezzo (10% FBS inattivato al calore, 1% di penicillina / streptomicina e 2 mM L-Glutammina) incubazione in un piatto di coltura cellulare a 37 ° C in un incubatore umidificato con aria e 5% CO _2.
7. Con una siringa con un ago G 20, impianto 100 pl di PBS contenente 5 x 10 ⁶ Bnl 1ME A.7R.1 cellule di carcinoma epatocellulare topo in un lobo di fegato di topi BALB / c per produrre i tumori primari. Post-impianto, la casa dei topi BALB / c in una gabbia con gli stessi requisiti di case come pre-impianto.
8. Al punto finale sperimentale, evidenza clinica di carcinoma epatocellulare è osservabile come riduzione significativa condizione corporeapunteggio (solitamente rilevata dopo 4 settimane). A questo punto, vi è un rischio che i tumori primari hanno sviluppato nel fegato mentre i depositi metastatici sono formati nei polmoni. Successivamente, avviare il processo di isolamento e propagazione delle cellule tumorali circolanti.

2. Raccolta di sangue intero per far circolare tumore isolamento delle cellule

NOTA: validato correttamente l'area chirurgia e assicurarsi che sia privo di disordine. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici o immergersi in una disinfettante secondo la raccomandazione del costruttore

1. Sacrifice topi eutanasia umana a sperimentale end-point (evidenza clinica di sviluppo del tumore). Euthanization di topi dovrebbe coinvolgere CO ₂ asfissia. Osservare i topi correttamente per confermare l'anestesia è distribuito correttamente. Il biossido di carbonio dovrebbe essere rilasciato lentamente nella camera per un periodo di 5 - 10 min, causando arresto respiratorio. Seguire per dissanguamento intracardiaca e cervicoAl dislocazione. ⁵
2. Utilizzare un ago 25 G attaccato ad una siringa da 1 ml per la raccolta di sangue intero. Heparanize la siringa con 0,01 ml di eparina. Puntura immediatamente la pelle con l'ago inferiore al xyphisternum a circa 45 °. Avanzare lentamente l'ago per perforare il cuore, e quindi abbassare l'angolo dell'ago. Costantemente tenere l'ago e la siringa sul posto, e tirare fuori 500 ml - 1000 ml di sangue intero dal cuore.
3. Rimuovere la siringa e l'ago e trasferire il sangue in una provetta apirogena 1,5 ml di pre-etichettati. Centrifugare il sangue intero raccolto in 1,5 ml provetta apirogena a 1.167 g per 5 min.
   NOTA: La centrifugazione separa il campione di sangue intero in tre strati: lo strato inferiore o ematocrito costituito da globuli rossi, un sottile strato intermedio di buffy coat, e uno strato superiore di plasma.
4. Rimuovere il plasma accuratamente pipettando e raccolta in una provetta da 1,5 ml apirogena esente separato per Further esperimenti come il rilevamento degli acidi nucleici cell-free ^7.
5. Per l'isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC), raccogliere il buffy coat in un tubo di 1,5 ml apirogena separata in preparazione dei globuli rossi (RBC) lisi. Ciò è necessario rimuovere RBC residue nello strato buffy coat.

3. Ricetta per globuli rossi (RBC) Lysis Buffer

1. Fare una soluzione 1 L di tampone di lisi RBC.
2. Fare un 500 ml di cloruro di ammonio e 500 ml di Tris. Quindi mescolare per creare una soluzione 1 L di tampone di lisi degli eritrociti con una concentrazione finale di 155 mM di cloruro di ammonio e 10 mM di Tris.
3. Buffer la soluzione a pH 7,5. Conservare il tampone di lisi RBC a 2-8 ° C, e portare a RT immediatamente prima dell'uso.

4. RBC Lisi di Buffy Coat

1. Aggiungere 1 ml di tampone di lisi RBC al tubo di 1,5 ml apirogena sterile contenente il buffy coat raccolto.
2. Mescolare il contenuto della provetta dainvertendo più volte. Incubare si mescola della provetta per 5 minuti a RT in panchina. Centrifugare il contenuto misti per 5 min a 1167 x g.
3. Dopo centrifugazione, si otterrà un pellet biancastra. Scartare il surnatante rossastro lentamente e con attenzione in candeggina al 10%, senza alcuna interruzione al pellet. Se il pellet non è biancastra, rifare i passaggi 3,1-3,5. Aumentando il tempo di incubazione in tampone di lisi RBC a 10 - 15 min può anche essere utile.
4. Gettare i rifiuti biologici, una volta la decontaminazione dei rifiuti biologici nel 10% di candeggina è completo dopo 24 ore.

5. Propagazione in coltura cellulare

NOTA: Le cellule tumorali sono in genere in rapida crescita delle cellule dei globuli bianchi che sono abbondanti nel mix originale di cellule seminate nel piatto. A seguito di ripetute cambio di medium, e successive passaggi di CTC, tutti i globuli bianchi vengono rimossi e una popolazione relativamente puro di CTC rimane.

1. Doposcartando il supernatante in 10% di candeggina, lavare il pellet biancastra in 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), almeno una volta, e risospendere in mezzo di coltura completo per la propagazione in coltura cellulare.
2. Dopo lavaggio è completato, aggiungere 1 ml di mezzo completo di coltura A.7R.1 BNL 1ME (10% FBS inattivato al calore, 1% di penicillina / streptomicina e 2 mM L-Glutammina) al pellet e risospendere il pellet nel mezzo di coltura.
3. Seme il mix risospeso di cellule in un piatto di coltura cellulare. Incubare il piatto di coltura cellulare a 37 ° C in un incubatore umidificato con aria e 5% di CO _2.
4. Modificare il mezzo di coltura cellulare ogni due o tre giorni. Dopo cinque a sette giorni, CTC avrà aderito al piatto di coltura cellulare e ha iniziato a proliferare. Queste cellule rimangono vitali oltre 25 passaggi e dopo congelamento e scongelamento ripetuti cicli di ^5.

6. Verifica di carcinoma epatocellulare circolazione Tumor Cell Line

1. Eseguire apolymerase reazione a catena (PCR) basata su metodo, di amplificare un solo segmento di DNA specifico del gene β-globina topo per confermare che il romanzo ha stabilito linee cellulari CTC sono cellule di topo, come la linea di BNL impiantato 1ME A.7R.1 HCC originale. Metodo è stato originariamente descritto e validato da Steube et al. ^5,8
2. Eseguire immunostaining per la specifica per epatociti marcatore cAMP elemento sensibile binding protein 3-simile 3 (CREB3L3) utilizzando un anticorpo specifico. Ciò conferma che il romanzo CTC stabiliti sono infatti epatociti come la impiantato linea cellulare BNL 1ME A.7R.1 originale. ⁵

Representative Results

La metodologia qui descritta ha dimostrato che CTC possono essere isolati. I topi sono stati umanamente eutanasia alla sperimentale punto finale. Il processo ha coinvolto anidride carbonica per asfissia, dissanguamento intra-cardiaca, e dislocazione cervicale. Uno schema di passi principali della procedura sono illustrati in Figura 2. Campioni di sangue intero prelevato da dissanguamento intra-cardiaca sono stati elaborati usando il protocollo descritto sopra. Dopo di che, la centrifugazione è stata utilizzata per determinare il livello di buffy coat che è stato sottoposto alla lisi RBC. Questo è stato seguito da un altro passo centrifugazione per raccogliere un pellet biancastro lavata in PBS e risospese in mezzo completo di coltura cellulare per la propagazione in coltura cellulare. Un problema che può venire è che il pellet ottenuto non può essere chiaro a colori. Questo problema può essere facilmente risolto modificando il tempo di incubazione in tampone di lisi RBC previsto portandolo a 10 - 15 min, o eventualmente effettuando cronometra aggiuntivi.Immagini rappresentative della CTC propagate in coltura da tre diversi topi sono mostrati in figura 1 rispetto alle cellule A.7R.1 BNL 1ME. Rapida proliferazione e morfologia contribuiranno a identificare se cellule seminate sono CTC. Tuttavia, le tecniche di verifica come la PCR e immunostaining descritte ai punti 5.1 - 5.2 sono necessari per confermare la creazione di una linea di CTC praticabile.

Figura 1. Propagazione di cellule tumorali circolanti (CTC) in coltura cellulare da un ortotopico Singenico modello murino della carcinoma epatocellulare Le cellule sono state propagate a 15 mm x 60 mm piatti di coltura di cellule in BNL 1ME A.7R.1 terreno di coltura Metastasi.. Cellule tumorali proliferanti rispettate servire e sono indicati da tre topi separati. Le cellule tumorali sono rimasti vitali attraverso continui passaggi. Fase di contrasto immagine CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 e CTCOLUF2419 sono state prese a 40X di ingrandimento (lente obiettivo) rispetto alle cellule A.7R.1 BNL 1ME (40x). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Schema della Procedura di isolamento e la diffusione della cellule tumorali circolanti da un modello di sistema Cancro del mouse. Quando evidenza clinica di carcinoma epatocellulare è stata osservata come significativa riduzione del punteggio di condizione corporea, il sangue intero è stato raccolto da topi. Dopo diversi centrifugazioni, RBC lisi, e diversi passaggi di lavaggio, i CTC sono state seminate in piatti di coltura cellulare per la propagazione. Proliferazione delle cellule tumorali è stata osservata dopo alcuni giorni. Cliccate luinuovamente per vedere una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Needle
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml syringe tip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13,000 rpm Centrifuge