Isolation og formering af cirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model

Protocol

Etik Statement: Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i Hunter College of The City University of New York.

1. Pre-eksperiment Procedurer

1. Ved ankomsten til dyret facilitet, der oprindeligt House 3 BALB / c mus til et bur med en filtreret top og flis sengetøj. Sørg for, at musene har fri adgang til mad, Purina gnaver chow, og vand. Sengetøj og mad skal skiftes to gange om ugen, mens bure bør rengøres en gang om ugen.
2. Inducere generel anæstesi på mus med et isofluran fordamper sammen med oxygen ved en konstant strømningshastighed på 1 l pr min. Systemet er selvhjulpne og omfatter en præcision fordamper.
3. Position dyr i en plastik boks, der har præcision fordamperen og gas / bedøvelsesmiddel system tilsluttet til det. Oprindeligt indstillet fordamperen til 2,5, indtil dyret er bevidstløs, på hvilket tidspunkt sænke fordamperen til 2.
4. På det tidspunkt skifteventil linje, forsegling det til boksen og åbne den til næsekeglen.
5. Flyt dyret til forberedelse område, med næse kegle placeret korrekt og tilsluttet (til vedligeholdelse af anæstesi).
6. Forbered 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 muse HCC-celler til implantation per mus. BNL 1ME A.7R.1 bør vokse i medium (10% varmeinaktiveret FBS, 1% penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin) inkubering i en celledyrkningsskål ved 37 ° C i en befugtet inkubator med luft og 5% CO _2.
7. Med en sprøjte med en 20 G nål, at implantere 100 pi PBS indeholdende 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 muse hepatocellulær carcinomceller i en lap af lever fra BALB / c-mus producerer de primære tumorer. Post-implantation, hus BALB / c-mus i et bur med samme hus krav som præ-implantation.
8. Ved den eksperimentelle slutpunkt, kliniske tegn på hepatocellulært carcinom kan observeres som signifikant reduktion i kropstilstandenscore (normalt påvises efter 4 uger). På dette tidspunkt, er der en sandsynlighed for, at primære tumorer har udviklet i leveren, mens metastatiske aflejringer har dannet i lungerne. Derefter påbegynde processen med isolering og formering af cirkulerende tumorceller.

2. Indsamling af fuldblod til Cirkulerende tumorceller Isolation

BEMÆRK: Korrekt desinficeres operationen område og sørg for at det er rod-fri. Autoklavér alle kirurgiske instrumenter eller lægges i blød i et desinfektionsmiddel i henhold til producentens anbefaling

1. Sacrifice mus ved human aflivning ved eksperimentelt slutpunkt (kliniske tegn på tumor udvikling). Euthanization af mus bør involvere CO ₂ kvælning. Observere musene korrekt at bekræfte anæstesi fordeles korrekt. Kuldioxid bør frigives langsomt ind i kammeret over et tidsrum på 5 - 10 minutter, hvilket åndedrætsstop. Følg med intrakardial forblødning og cervical uro. ⁵
2. Brug en 25 G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte til opsamling af helblod. Heparanize sprøjten med 0,01 ml heparin. Punktering straks huden med nålen ringere end den xyphisternum ved ca. 45 ° vinkel. Advance nål langsomt at punktere hjerte, og sænk den vinkel af nålen. Støt holde nålen og sprøjten på plads, og trække ud 500 pi - 1.000 ul fuldblod fra hjertet.
3. Fjern sprøjten og overføre blod i et forud mærket 1,5 ml pyrogenfrit rør. Centrifugeres fuldblod opsamles i 1,5 ml pyrogenfrit rør ved 1.167 x g i 5 min.
   BEMÆRK: Centrifugeringen adskiller prøven af ​​helblod i tre lag: det nederste eller hæmatokrit lag bestående af røde blodlegemer, et mellemliggende tyndt lag af buffy coat, og en top plasma lag.
4. Fjern plasmaet forsigtigt ved pipettering og indsamling heraf i en separat 1,5 ml pyrogenfrit rør til FurthER eksperimenter såsom påvisning af cellefrie nukleinsyrer ^7.
5. Til isolering af cirkulerende tumorceller (CTCs), indsamle buffy coat i en separat 1,5 ml pyrogenfrit rør som forberedelse til røde blodlegemer (RBC) lysis. Dette er nødvendigt for at fjerne resterende røde blodlegemer i buffy coat lag.

3. Opskrift på røde blodlegemer (RBC) Lysis Buffer

1. Lav en 1 L opløsning af RBC lysis buffer.
2. Lav en 500 ml ammoniumchlorid og 500 ml Tris. Derefter blandes for at skabe en 1 L opløsning af RBC lysis buffer med en slutkoncentration på 155 mM ammoniumchlorid og 10 mM Tris.
3. Pufre opløsningen til en pH-værdi på 7,5. Opbevar RBC lysis buffer ved 2-8 ° C, og bringe til stuetemperatur umiddelbart før brug.

4. RBC Lyse af buffy coat

1. Der tilsættes 1 ml RBC lysepuffer til sterilt pyrogenfrit 1,5 ml rør indeholdende den opsamlede buffy coat.
2. Blande indholdet i røret vedinverterende flere gange. Inkubér blandet indholdet af reagensglasset i 5 minutter ved stuetemperatur på bænken. Centrifuger det blandede indhold i 5 minutter ved 1.167 x g.
3. Efter centrifugering vil en hvidlig pellet opnås. Kassér den rødlige supernatanten langsomt og forsigtigt i 10% blegemiddel uden afbrydelse pillen. Hvis pillen ikke er hvidlig, re-do trin 3,1-3,5. Forøgelse af inkubationstiden i RBC lysepuffer til 10 - 15 min kan ligeledes være nyttige.
4. Sikker bortskaffe det biologiske affald, når dekontaminering af biologisk affald i 10% blegemiddel er fuldstændig efter 24 timer.

5. Formering i cellekultur

BEMÆRK: Tumorceller typisk hurtigt voksende celler hvide blodlegemer, der er rigelige i den oprindelige blanding af celler udsået i skålen. Efter gentagen skift af medium og efterfølgende passager af CTCs, er alle de hvide blodlegemer fjernes og en relativt ren population af CTCs tilbage.

1. Efterbortkastning af supernatanten i 10% blegemiddel, vaske hvidligt pellet i 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) mindst en gang, og resuspender i komplet dyrkningsmedium til opformering i cellekultur.
2. Når vask er fuldført, tilsættes 1 ml komplet BNL 1ME A.7R.1 dyrkningsmedium (10% varmeinaktiveret FBS, 1% penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin) til pelleten, og pellet resuspenderes i dyrkningsmediet.
3. Pode resuspenderet blanding af celler i en celledyrkningsskål. Inkubér celledyrkningsskål ved 37 ° C i en befugtet inkubator med luft og _5% CO2.
4. Skift celledyrkningsmediet hver to til tre dage. Efter fem til syv dage, vil CTCs har overholdt cellen dyrkningsskål og begyndte prolifererende. Disse celler vil forblive levedygtige ud over 25 passager og efter Gentagen nedfrysning og optøning cyklusser ^5.

6. Verifikation af hepatocellulært carcinom Cirkulerende tumorcellelinje

1. Udfør apolymerase kædereaktion (PCR) -baseret fremgangsmåde til amplifikation kun én specifik DNA segment af muse β-globin genet for at bekræfte, at det hidtil ukendte etableret CTC cellelinier er museceller som den oprindelige implanteret BNL 1ME A.7R.1 HCC linje. Metoden blev oprindeligt beskrevet og valideret af Steube et al. ^5,8
2. Udfør immunfarvning for hepatocyt-specifik markør cAMP responsivt element bindende protein 3-lignende 3 (CREB3L3) ved anvendelse af et specifikt antistof. Dette vil bekræfte, at romanen etablerede CTCs faktisk hepatocytter som den originale implanteret BNL 1ME A.7R.1 cellelinje. ⁵

Representative Results

Den her beskrevne metode har vist, at CTCs kan isoleres. Mus blev humant aflivet ved eksperimentelt slutpunkt. Processen involverede kuldioxid kvælning, intra-hjerte-afblødning og cervikal dislokation. En skematisk afbildning af de vigtigste trin i proceduren er vist i figur 2. Hele blodprøver ved intra-kardiale forblødning blev behandlet under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor. Hvorefter blev centrifugering anvendes til at bestemme buffy coat lag, der blev udsat for RBC-lyse. Dette blev derefter efterfulgt af en anden centrifugeringstrin til at indsamle en hvidlig pellet, der blev vasket i PBS og resuspenderet i komplet celledyrkningsmedium til opformering i cellekultur. Et problem, der kan komme op er, at opnåede pellet ikke kan være klare i farven. Dette problem kan let løses ved at ændre inkubationstiden i RBC lysepuffer ved at øge det til 10 - 15 min, eller eventuelt ved at udføre det yderligere gange.Repræsentative billeder af CTCs blive formeret i kultur fra tre forskellige mus er vist i figur 1 sammenlignet med BNL 1ME A.7R.1 celler. Hurtig spredning og morfologi vil hjælpe med at identificere, hvis celler podet er CTCs. Men verifikation teknikker såsom PCR og immunfarvning er beskrevet i trin 5.1 - er 5.2 nødvendige for at bekræfte oprettelsen af ​​en levedygtig CTC linje.

Figur 1. Formering af cirkulerende tumorceller (CTCs) i cellekultur fra en ortotopisk Syngene musemodel af hepatocellulært carcinom metastaser. Cellerne blev opformeret i 15 mm x 60 mm cellekultur retter i BNL 1ME A.7R.1 dyrkningsmediet. Prolifererende tumorceller levet op til parabol og er vist fra tre separate mus. Tumor celler er forblevet levedygtige gennem løbende passager. Fase kontrast billede af CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 og CTCOLUF2419 blev taget ved 40X forstørrelse (objektiv) i sammenligning med BNL 1ME A.7R.1 celler (40X forstørrelse). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Skematisk af forretningsordenen for at isolere og Plantemateriale Cirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model System. Hvornår blev observeret kliniske tegn på hepatocellulært carcinom som signifikant reduktion i huld score, var fuldblod tappet fra mus. Efter flere centrifugeringer, RBC lysering, og flere vasketrin blev CTCs podet i cellekultur retter til formering. Tumorcelleproliferation blev observeret efter flere dage. Klik hanre for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Needle
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml syringe tip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13,000 rpm Centrifuge