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Immunology and Infection

इन विट्रो में और vivo मॉडल में पोत दीवार के नीचे प्रवाह की स्थिति के लिए बैक्टीरियल आसंजन अध्ययन करने के लिए

Published: June 11, 2015 doi: 10.3791/52862
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Center for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

Abstract

Endovascular संक्रमण और संक्रामक अन्तर्हृद्शोथ पैदा करने के लिए आदेश में, बैक्टीरिया खून बहने की कतरनी तनाव से अवगत कराया जा रहा है जबकि पोत दीवार का पालन करने में सक्षम होने की जरूरत है।

सूक्ष्मजीवों के संवहनी आसंजन के लिए योगदान है कि बैक्टीरियल और मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए, शारीरिक कतरनी की शर्तों के तहत इन संबंधों का अध्ययन है कि उपयुक्त मॉडल की जरूरत है। यहाँ, हम बाह्य मैट्रिक्स के विभिन्न घटकों के लिए बैक्टीरियल आसंजन की जांच करने के लिए या कोशिकाओं endothelial करने की अनुमति देता है कि इन विट्रो प्रवाह चैम्बर मॉडल का वर्णन है, और विकसित किया गया था कि एक intravital माइक्रोस्कोपी मॉडल सीधे vivo में पेटा-संबंधी परिसंचरण को बैक्टीरिया के प्रारंभिक आसंजन कल्पना करने के लिए । इन विधियों प्रवाह के तहत बैक्टीरिया के आसंजन के लिए आवश्यक बैक्टीरियल और मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम कतरनी तनाव की प्रासंगिकता और Staphy के आसंजन के लिए वॉन Willebrand कारक की भूमिका को वर्णनlococcus ऑरियस दोनों में इन विट्रो और इन विवो मॉडल में इस्तेमाल करते हैं।

Protocol

पशु प्रयोगों के यू लोवेन की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

इन विट्रो Perfusions के लिए और vivo प्रयोगों में 1. तैयार कर रहा है जीवाणु

  1. हम एस इस्तेमाल किया ऑरियस इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रयोगों के लिए तनाव न्यूमैन। एस ऑरियस न्यूमैन -80 डिग्री सेल्सियस पर 10% ग्लिसरॉल के साथ मस्तिष्क हार्ट आसव (भी) में जमा हो गया था।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस (आयुध डिपो> 3 600) पर / एन जमे हुए बैक्टीरिया परिमार्जन और 5 एमएल tryptic सोया शोरबा (टीएसबी) ओ में टीका लगाना करने के लिए एक बाँझ पाश का उपयोग करें।
  3. Centrifugation (2,600 जी, आर टी, 5 मिनट) द्वारा बैक्टीरिया धो और 5 मिलीलीटर पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) में बैक्टीरिया गोली resuspend।
  4. इथेनॉल में 5 (6) -carboxy-fluorescein एन hydroxysuccinimidyl एस्टर (carboxy-fluorescein) के एक 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है। प्रयोगशाला ग्रेड पानी में 150 माइक्रोग्राम / एमएल 1 मिलीग्राम / एमएल carboxy-fluorescein समाधान (जैसे, MilliQ पानी) पतला। प्रकाश से ट्यूबों को सुरक्षित रखें-20 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ।
  5. (2600 XG, आरटी, 5 मिनट) बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र। 800 μl पीबीएस में बैक्टीरिया गोली Resuspend और 200 μl या 150 माइक्रोग्राम / एमएल carboxy-fluorescein समाधान के 400 μl (अंतिम एकाग्रता में vivo प्रयोगों के लिए 50 माइक्रोग्राम / एमएल) (छिड़काव प्रयोगों के लिए 30 माइक्रोग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से ट्यूबों को सुरक्षित रखें और एक प्रकार के बरतन पर आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. लेबलिंग के बाद, पीबीएस में 6% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) समाधान के साथ ब्लॉक।
  7. ऑप्टिकल densitometry का उपयोग कर जीवाणुओं (ओवर ड्राफ्ट), एक आयुध डिपो में इन विट्रो प्रयोगों के लिए 0.65 के 600 पतला है (और एक आयुध डिपो में vivo प्रयोगों के लिए 1.8 से 600 (लगभग 3 एक्स 10 8 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) एस ऑरियस के लिए / एमएल के लिए इसी) पीबीएस में एस ऑरियस के लिए लगभग 1 एक्स 10 9 CFU / एमएल) के लिए इसी। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से ट्यूबों को सुरक्षित रखें और बर्फ पर छोड़ दें।

2. इन विट्रो छिड़काव प्रयोगों

  1. कांच coverslips की कोटिंग
    1. प्रयोगशाला ग्रेड पानी में वॉन Willebrand कारक (VWF) (Haemate पी, शेयर एकाग्रता 2400 माइक्रोग्राम / एमएल) पतला 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए (आसुत विआयनीकृत)।
    2. 160 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए (निर्माता द्वारा आपूर्ति के रूप में एसकेएफ समाधान, पीएच 2.7-2.9) आइसोटोनिक ग्लूकोज समाधान में कोलेजन पतला।
    3. Parafilm पर कोटिंग के 200 μl छोड़ने और छोटी बूंद के शीर्ष पर coverslip जगह से VWF या कोलेजन के साथ कोट कांच coverslips (24 × 50 मिमी)। छोटी बूंद coverslip की सतह के साथ फैल जाएगा।
    4. आरटी पर 4 घंटे के लिए एक humidified कंटेनर में coverslip सेते हैं। ध्यान से एक कुंद सुई के साथ parafilm से coverslips उठा। प्रवाह कक्ष के नीचे हिस्से में coverslip माउंट।
  2. प्लास्टिक की कोटिंग endothelial कोशिकाओं के साथ स्लिप्स
    1. कोट प्लास्टिक निकल जाता है(1-अच्छी तरह से पीसीए सेल संस्कृति कक्ष, Sarstedt, जर्मनी) पीबीएस में एक 1% जिलेटिन समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। जिलेटिन लेपित प्लास्टिक फिसल जाता है पर बीज मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) और 70-80 confluency% करने के लिए उन्हें बढ़ता है। प्रवाह कक्ष के नीचे हिस्से में प्लास्टिक की पर्ची माउंट।
  3. छिड़काव प्रयोग
    नोट: इन विट्रो छिड़काव मॉडल का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रतिनिधित्व किया है।
    1. विभिन्न शारीरिक प्रवाह की स्थिति अनुकरण करने के लिए 2.5 डाएन / 2 सेमी और 20 डाएन / 2 सेमी के बीच एक लामिना कतरनी तनाव पर एक माइक्रो समानांतर प्लेट प्रवाह चैम्बर में इन विट्रो बैक्टीरियल आसंजन अध्ययन करते हैं।
    2. प्रवाह कक्ष (इन-हाउस डिजाइन) एक धातु फ्रेम और Plexiglas से बाहर कर दिया छिड़काव चैम्बर (पाली (मिथाइल) मेथाक्रिलेट (PMMA)) के होते हैं। एक उच्च सटीकता आसव पम्प (PHD 2000 आसव, हार्वर्ड उपकरण, संयुक्त राज्य अमरीका) को जोड़ने के द्वारा, हम प्रवाह आरए उत्पन्न कर सकते हैं0.0001 μl / मिनट और 220.82 मिलीग्राम / मिनट के बीच टीईएस।
    3. प्रवाह कक्ष के ऊपरी भाग के लिए टयूबिंग कनेक्ट और ट्यूबिंग में मध्यम इंजेक्षन। धीरे नीचे हिस्से के ऊपर प्रवाह कक्ष के ऊपरी भाग जगह है और प्रवाह चैम्बर इकट्ठा। हवा के बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहें। कक्ष लीक नहीं है कि सुनिश्चित करने के लिए और अधिक कोटिंग समाधान निकालने के लिए कक्ष के माध्यम से माध्यम से 1 मिलीलीटर इंजेक्षन। हवा के बुलबुले से बचें।
    4. एक माइक्रोस्कोप ट्रे पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मो-नियंत्रित हीटिंग पैड पर माउस रखें। यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है, सख्त asceptic प्रक्रियाओं के लिए कोई जरूरत नहीं है। गले नस के पास एक चीरा, धीरे ग्रीवा मांसपेशियों के सही पक्ष को हटाने और आसपास के ऊतकों से गले नस अलग।
    5. आसव पम्प और प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी सेट करें। आसव पंप सेटिंग्स सिरिंज व्यास और वांछित प्रवाह दर (धारा 2.4 देखें) पर निर्भर करते हैं। अब से, एक अंधेरे कमरे में काम करते हैं।
    6. VWF कोटिंग:
      1. Fluorescently लेबल बैक्टीरिया के साथ एक सिरिंज भरें और इनलेट ट्यूब से कनेक्ट। हवा के बुलबुले से बचें। 10 मिनट के लिए संचार पंप शुरू करो। आसव समय का इस्तेमाल कतरनी दर और कोटिंग, बैक्टीरिया और मध्यम पर निर्भर करता है और आसंजन की लगातार राज्य का प्रतिनिधित्व करना चाहिए।
      2. 10 मिनट के बाद, इनलेट ट्यूब के लिए पीबीएस के साथ एक सिरिंज से जुड़ने और संचार पंप शुरू करने से अनबाउंड बैक्टीरिया दूर धोने।
      3. धोने की प्रक्रिया के बाद विभिन्न स्थानों पर कम से कम 15 छवियों या फिल्मों ले। बैक्टीरिया पर ध्यान केंद्रित करने के लिए छोटे और संभावित रूप से मुश्किल है। इन विट्रो प्रवाह प्रयोग करने से पहले, उचित फोकल हवाई जहाज़ एक coverslip पर fluorescently लेबल बैक्टीरिया की एक बूंद रखने और प्रवाह कक्ष में coverslip रखने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इसके बाद उपयुक्त फोकल हवाई जहाज़ के लिए खोज और सेटिंग्स को बचाने के।
        नोट: इन विट्रो प्रवाह प्रयोग के दौरान, वाशिंग चरण के दौरान छवियों पर कब्जा (शुरू होने के बाद ± 5 मिनट) यह सुनिश्चित करता है कि केवलपक्षपाती बैक्टीरिया के लिए संकेत कब्जा कर लिया है।
    7. कोलेजन कोटिंग:
      1. बस छिड़काव शुरू करने से पहले fluorescently लेबल बैक्टीरिया से 60 माइक्रोग्राम / एमएल VWF जोड़ें। 60 माइक्रोग्राम / एमएल VWF के साथ पूरक fluorescently लेबल बैक्टीरिया या fluorescently लेबल बैक्टीरिया के साथ एक सिरिंज भरें और इनलेट ट्यूब से कनेक्ट। हवा के बुलबुले से बचें। दोहराएँ 2.3.5.2 2.3.5.3 कदम
    8. अन्तःस्तर कोशिका:
      1. सीए 2 + -ionophore A23187 के एक 0.1 मिमी समाधान के साथ छिड़काव द्वारा endothelial कोशिकाओं को सक्रिय एक साथ छिड़काव से 10 मिनट के लिए जीवाणु छिड़काव के रूप में ही कतरनी दर पर DMEM में (शेयर समाधान डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में भंग 10 मिमी) 0.1 मिमी। दोहराएँ 2.3.5.3 करने के लिए 2.3.5.2 कदम।
  4. इस प्रकार के रूप कतरनी दर और कतरनी तनाव की गणना।
    कतरनी दर = प्रश्न 6 / क 2
    कहां है: प्रश्न: डब्ल्यू मिलीग्राम / मिनट में दर, प्रवाह: CM में चौड़ाई, एच: CM में ऊंचाई
    कतरनी तनाव (τ) = कतरनी चूहापूर्व चिपचिपापन (μ)
    कहां μ: मध्यम: 0.01 dynes एक्स सेकंड / 2 सेमी, पूरे रक्त: 0.04 dynes एक्स सेकंड / 2 सेमी
  5. छवि विश्लेषण
    1. एक काले और सफेद कैमरे के साथ एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग जीना छवियों प्राप्त करें और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विकसित करना। 1.5 सेकंड का समय जोखिम का प्रयोग करें। बेतरतीब ढंग से प्रवाह कक्ष की लेपित सतह पर फैले हुए कई स्नैपशॉट (कम से कम 15) लो और उपयुक्त फ़ाइल प्रारूप में उन्हें बचाने के लिए।
    2. ImageJ के साथ छवि विश्लेषण करते हैं। और ब्याज की सुविधाओं में ग्रे स्केल छवियों segmenting, निचले और ऊपरी सीमा मूल्यों को निर्धारित करने के लिए दहलीज को परिभाषित - छवि (घटाना पृष्ठभूमि प्रक्रिया) से चिकनी निरंतर पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए पृष्ठभूमि घटाना। दहलीज तक ही सीमित क्षेत्र उपाय।
    3. बैक्टीरियल आसंजन की तुलना करें, सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, जैसे फ्लोरोसेंट क्षेत्र, के रूप में व्यक्त किया। एक तरह से एनोवा या टी का उपयोग समूहों की तुलना करेंwo के पूंछ वाले विद्यार्थी के टी परीक्षण। मतलब (SEM) के मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में सभी मूल्यों को रिपोर्ट करें। महत्वपूर्ण <0.05 के पी मूल्य पर विचार करें (* पी <0.05; ** पी <0.01; *** पी <0.001)।

विवो Mesenteric छिड़काव मॉडल में 3.

  1. माउस की तैयारी / सर्जरी
    1. आंत्र आंदोलन को सीमित करने के क्रम में प्रयोग से पहले रात माउस तेजी से।
    2. Buprenorphine के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन सर्जरी से पहले (0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन (BW)) 20-30 मिनट से एक 6-8 सप्ताह पुरानी माउस (C57BL / 6) पूर्व ऑपरेटिव एनलजेसिया दीजिए।
    3. इंट्रा-पेरिटोनियल ketamine का इंजेक्शन (125 मिलीग्राम / किग्रा BW) और xylazine (12.5 मिलीग्राम / किग्रा BW) द्वारा माउस anesthetize। पेडल पलटा द्वारा जाँच करें। सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सक मरहम लागू करें।
    4. एक माइक्रोस्कोप ट्रे पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मो-नियंत्रित हीटिंग पैड पर माउस रखें। यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है, सख्त ascepti के लिए कोई जरूरत नहीं हैसी प्रक्रियाओं। गले नस के पास एक चीरा, धीरे ग्रीवा मांसपेशियों के सही पक्ष को हटाने और आसपास के ऊतकों से गले नस अलग।
    5. Fluorescently लेबल बैक्टीरिया या अन्य समाधान के अर्क के लिए सही गले नस में एक 2 फ्रेंच नसों में कैथेटर डालें। एक midline पेट चीरा के माध्यम से पेरिटोनियल गुहा खोलें और mesenterium प्रसार करने के लिए कपास swabs का उपयोग करें और mesenteric arteriolar और venular परिसंचरण कल्पना करने के लिए।
    6. एक पारदर्शी थाली पर सही पक्ष पर माउस रखें और टेप के साथ प्रवेशनी सुरक्षित। हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए एक गर्म पैक का प्रयोग करें। ऊतक के निर्जलीकरण को रोकने के लिए, आंतों पर 500 μl 0.9% सोडियम क्लोराइड ड्रॉप।
  2. Mesenteric परिसंचरण को बैक्टीरियल आसंजन के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
    1. एक अंधेरे कमरे में कार्य करें। जहाजों स्थिर करना और एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत उन्हें कल्पना करने के लिए कपास swabs का प्रयोग करें।
    2. Topically एक 10 मिमी समाधान ओ के 5 μl लागू होते हैंएफ सीए 2 + -ionophore A23187 DMSO में भंग कर दिया। 10 सेकंड के बाद, कंठ कैथेटर के माध्यम से बैक्टीरिया से लेबल 100 μl (चरण 1 देखें) इंजेक्षन। समय चूक छवियों ले लो। प्रयोग के बाद समाप्त हो गया, संस्थागत अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार माउस euthanize।
  3. छवि विश्लेषण
    1. एक काले और सफेद कैमरे का उपयोग कर और किसी भी इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विकसित कब्जा कर लिया एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते हुए लाइव छवियों प्राप्त करते हैं। स्वचालित जोखिम समय और उपकरणों का इस्तेमाल किया के लिए विशिष्ट विपरीत अनुकूलन लागू करें।
    2. 1,000 छवियों / सेकंड की 40 चक्र का उपयोग कर - टूलबार में 'अधिग्रहण' उपकरण (टाइम बहुआयामी अधिग्रहण) का उपयोग करते समय चूक छवियों मोल। एक उपयुक्त छवि फ़ाइल स्वरूप में छवियों को बचाने।
    3. छवि प्रति फ्लोरोसेंट संकेत के क्षेत्र को मापने के लिए ImageJ विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रक्रिया छवियों। एफ में ग्रे स्केल छवियों segmenting, निचले और ऊपरी सीमा मूल्यों को निर्धारित करने के लिए दहलीज को परिभाषित करेंब्याज की eatures। ब्याज (रक्त वाहिका) के क्षेत्र की पहचान और सीमा और ब्याज के क्षेत्र तक ही सीमित क्षेत्र को मापने। बैक्टीरियल आसंजन की तुलना करें, किसी भी सांख्यिकीय या रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर फ्लोरोसेंट क्षेत्र के रूप में व्यक्त किया।

Representative Results

VWF एस ऑरियस आसंजन, subendothelial मैट्रिक्स और endothelial कोशिकाओं एक कतरनी तनाव निर्भर घटना है

एस के बीच बातचीत में कतरनी तनाव की भूमिका पर जोर ऑरियस और VWF, हम अलग अलग कतरनी दरों पर लेपित coverslips (इन विट्रो छिड़काव मॉडल की एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन एस ऑरियस के 1। आसंजन 250 सेकंड से बढ़ रही है कतरनी दर के साथ वृद्धि हुई VWF को चित्रा में दी गई है -1 2,000 VWF से अधिक perfusions प्रदर्शन किया सेकंड -1 (चित्रा 2), उच्च कतरनी बलों को बाधित लेकिन VWF करने के लिए बैक्टीरिया के आसंजन को सुदृढ़ नहीं है कि यह दर्शाता है।

कोलेजन को बैक्टीरियल आसंजन को VWF के योगदान की जांच करने के लिए, subendothelial मैट्रिक्स के मुख्य घटक है, हम fluorescently एस लेबल वाले perfused VWF की उपस्थिति या अनुपस्थिति में कोलेजन से अधिक ऑरियस। VWF, एस के आसंजन के अभाव में एकोलेजन को ureus कतरनी दरों में वृद्धि के साथ कम किया है। हालांकि, VWF माध्यम में मौजूद था, जब एस के आसंजन ऑरियस कतरनी दर (चित्रा 3) में वृद्धि के साथ वृद्धि हुई है।

इन विट्रो प्रवाह मॉडल भी प्रवाह के तहत कोशिकाओं endothelial करने के लिए बैक्टीरिया के आसंजन की जांच करने के लिए हमें की अनुमति देता है। हम HUVECs साथ fluorescently एस लेबल वाले perfused कतरनी दरों पर 500 से 2,000 सेकंड के लिए ऑरियस -1। जहां संकेत, HUVECs VWF की रिहाई के कारण को, एक सीए 2 + -ionophore के साथ सक्रिय थे। Endothelial सेल सक्रियण और बाद VWF रिहाई, एस की वृद्धि की आसंजन ठेठ "स्ट्रिंग की तरह" पैटर्न का गठन जो ऑरियस (चित्रा -4 ए), के fluorescently एक रेखीय-बढ़ाकर VWF अणु साथ बैक्टीरिया के बंधन का सुझाव कतरनी बल (चित्रा 4 बी) की दिशा में गठबंधन बैक्टीरियल समूहों, लेबल।

प्रारंभिक इन विवोपेटा-संबंधी नसों में बैक्टीरियल आसंजन VWF द्वारा मध्यस्थता है

एस के बाद से vivo में सक्रिय पोत दीवार के लिए बैक्टीरियल आसंजन जांच करने के लिए - (- / Vwf) ऑरियस VWF का पालन करने में सक्षम है, हम (Vwf / + +) और VWF की कमी चूहों wildtype चूहों का इस्तेमाल किया। पेटा-संबंधी नसों की वास्तविक समय videomicroscopy fluorescently एस लेबल वाले परिसंचारी के vivo में दृश्य की अनुमति दी ऑरियस (vivo छिड़काव मॉडल के योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा 5 में प्रतिनिधित्व किया है)।

सीए 2 + -ionophore द्वारा अन्तःचूचुक के औषधीय सक्रियण के बाद, हम WT चूहों के पोत दीवार के लिए अलग-अलग बैक्टीरिया और जीवाणुओं के समुच्चय का तेजी से स्थानीय संचय मनाया (पूरक वीडियो 1 और 2)। बैक्टीरिया की लगभग कोई आसंजन Vwf -deficie की सक्रिय पोत दीवार पर मनाया गयाNT चूहों (पूरक वीडियो 3) WT चूहों में आसंजन के साथ तुलना में (चित्रा 6)। VWF के अभाव एस की क्षमता कम हो जाती है ऑरियस सक्रिय पोत दीवार का पालन करना।

चित्र 1
चित्रा 1. इन विट्रो प्रवाह मॉडल का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इन विट्रो प्रवाह मॉडल ऐसे subendothelial मैट्रिक्स को बैक्टीरियल आसंजन के रूप में विभिन्न कतरनी निर्भर तंत्र के अध्ययन की अनुमति देता है जो एक multifunctional मॉडल है, लेकिन यह भी गठन thrombus। माइक्रो समानांतर प्रवाह कक्ष प्रोटीन और endothelial कोशिकाओं के विभिन्न कोटिंग्स के साथ एक coverslip (प्लास्टिक या कांच) पर रखा गया है। अलग बैक्टीरिया (नारंगी और ग्रे डॉट्स) के आसंजन विश्लेषण किया जा सकता है, और प्लाज्मा प्रोटीन, प्लेटलेट्स और पूरे रक्त की उपस्थिति के प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है। प्लेटलेट्स (नीले अंडाकार) या fibrinog के लिए फ्लोरोसेंट मार्करोंएन (नीले तार) बैक्टीरियल और मेजबान कारकों भेद करने के लिए विभिन्न अवरोधक (काले अंडाकार) के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है। एस के जीवाणु आसंजन के प्रतिनिधि छवियाँ VWF की उपस्थिति (नीचे) में कोलेजन कोटिंग या अनुपस्थिति (ऊपर) के लिए ऑरियस (पैमाने बार 100 माइक्रोन है) दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एस चित्रा 2. आसंजन कतरनी दरों में वृद्धि के साथ VWF बढ़ जाती है ऑरियस। लेपित VWF से अधिक माइक्रो समानांतर प्रवाह कक्ष छिड़काव (मिलीग्राम / 50 माइक्रोग्राम) के साथ fluorescently एस लेबल किया मध्यम में 250 सेकंड -1 (एसईसी -1) 2,000 के कतरनी दर (N> 5) में ऑरियस न्यूमैन। सभी परिणाम SEM के ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। * पी <0.05, ** पी <0.01।

चित्र तीन
एस चित्रा 3. आसंजन subendothelium को ऑरियस कतरनी और VWF निर्भर है। साथ fluorescently एस लेबल वाले लेपित कोलेजन (160 माइक्रोग्राम / एमएल) से अधिक माइक्रो समानांतर प्रवाह कक्ष छिड़काव मध्यम में 250 सेकंड से 2,000 -1 की कतरनी दर (N> 5) में ऑरियस न्यूमैन। जहां संकेत VWF (60 माइक्रोग्राम / एमएल) के माध्यम में उपस्थित थे। सभी परिणाम SEM के ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। ** पी <0.01।

चित्रा 4
एस चित्रा 4 आसंजन सक्रिय endothelial कोशिकाओं को ऑरियस endothelial कोशिकाओं से अधिक कतरनी निर्भर है। माइक्रो समानांतर प्रवाह कक्ष छिड़काव है। (ए) मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं सीए 2 + -ionophore एक साथ सक्रिय थेके fluorescently एस नामक एक 10 मिनट के छिड़काव द्वारा पीछा 23,187 (0.1 मिमी) मध्यम में 500 सेकंड से 2,000 -1 की कतरनी दर (N> 5) में ऑरियस न्यूमैन। सभी परिणाम SEM के ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। * पी <0.05। एस के साथ सक्रिय HUVECs से अधिक सूक्ष्म समानांतर प्रवाह कक्ष छिड़काव (बी) छवि 1,000 सेकंड के एक कतरनी दर -2। एस पर ऑरियस ऑरियस VWF multimers करने के लिए आसंजन (पैमाने बार 100 माइक्रोन है), सुझाव ± 200 माइक्रोन लंबाई के तार रूपों। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5 में विवो mesenteric छिड़काव मॉडल का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन। एक सही गले नस कैथेटर (पीली लाइन) स्त्राव के प्रशासन के लिए डाला जाता हैescently लेबल वाले बैक्टीरिया (नारंगी डॉट्स), अतिरिक्त एनेस्थेटिक्स या ऐसी दवा inhibitors और एंटीबॉडी के रूप में अन्य घटकों। पेरिटोनियल गुहा खोला है और mesenterium एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे रक्त वाहिकाओं (शिराओं और धमनियों) कल्पना करने के लिए फैला हुआ है। VWF की रिहाई लाती है जो एक सीए 2 + -ionophore ने अन्तःचूचुक के औषधीय सक्रियण के बाद, बैक्टीरिया गले नस कैथेटर के माध्यम से इंजेक्ट किया जा सकता है। वास्तविक समय intravascular वीडियो माइक्रोस्कोपी fluorescently लेबल बैक्टीरिया परिसंचारी के vivo दृश्य और बैक्टीरिया प्लेटलेट थ्रोम्बी के परिणामस्वरूप गठन। की अनुमति देता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 एस के प्रारंभिक आसंजन ऑरियस/ - - चूहों। vivo में सक्रिय अन्तःचूचुक C57BL / 6- Vwf / + + और ​​C57BL / 6- Vwf साथ VWF में विवो शिरापरक mesenteric छिड़काव मॉडल द्वारा मध्यस्थता है करने के लिए। आसंजन के fluorescently एस लेबल किया / - - चूहों स्थानीय स्तर पर सक्रिय पोत दीवार को ऑरियस Vwf में काफी कम है। सभी परिणाम SEM के ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। *** पी <0.001, एन> 7।

वीडियो चित्रा 1
वीडियो 1: एस के वास्तविक समय आसंजन ऑरियस Vwf / + + चूहों में सक्रिय पोत दीवार के लिए। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।


वीडियो 2: वास्तविक समय कुल गठन और एस के embolization ऑरियस Vwf / + + चूहों में। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो चित्रा 3
वीडियो: 3 एस की वास्तविक समय आसंजन / - - चूहों / - -। Vwf / + + और ​​Vwf के साथ चूहों में विवो mesenteric छिड़काव मॉडल ऑरियस Vwf में सक्रिय पोत दीवार के लिए। एक सीए 2 + -ionophore (10 मिमी) के पांच μl appli थाकल्पना की संवहनी बिस्तर से इस क्षेत्र के लिए एड। Carboxy-fluorescein लेबल एस के निलंबन ऑरियस कंठ कैथेटर के माध्यम से इंजेक्ट किया गया था। mesenteric परिसंचरण एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना की गई थी। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

कतरनी तनाव पोत दीवार के लिए जल्दी बैक्टीरियल आसंजन के लिए और Endovascular या endocardial वनस्पति और मेटास्टेटिक संक्रमण 4,5 के बाद की पीढ़ी के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। हम शारीरिक कतरनी तनाव के तहत endovascular संक्रमण के रोगजनन अध्ययन करने के लिए इन विट्रो में और vivo मॉडल में पूरक का वर्णन किया। इन मॉडलों हमें प्रमुख एस के रूप में वॉन Willebrand कारक बाध्यकारी प्रोटीन (vWbp) की पहचान करने के लिए अनुमति दी है ऑरियस प्रोटीन VWF 4 को उजागर एक घायल संवहनी दीवार के साथ प्रवाह के तहत बातचीत करने के लिए।

Endovascular संक्रमण, और विशेष रूप से संक्रामक अन्तर्हृद्शोथ, बल्कि इसलिए भी कि स्थानीय और दूर ('मेटास्टैटिक') जटिलताओं की, क्योंकि न केवल पूति प्रेरित अंग विफलता और मौत की चिंता का विषय हैं। संक्रामक अन्तर्हृद्शोथ और मेटास्टेटिक संक्रमण पैदा करने के लिए, बैक्टीरिया पोत दीवार का पालन करना और इस प्रकार रक्त बहने की कतरनी तनाव का विरोध किया है। अधिकांशबैक्टीरिया पर अध्ययन कारकों स्थिर परिस्थितियों में प्रदर्शन किया गया है डाह। हालांकि, इन स्थापित बातचीत बैक्टीरिया मेजबान परस्पर क्रिया में नया, पहले से अपरिचित कारकों प्रकट कर सकते हैं प्रवाह शर्तों के तहत कतरनी बलों और पढ़ाई का सामना नहीं कर सकता है।

माइक्रो समानांतर प्रवाह कक्ष का उपयोग करना, और हम दूसरों संवहनी आसंजन के लिए VWF के महत्व को दिखाया गया है। कतरनी तनाव के तहत, उत्तरोत्तर करेंगी आराम कर अपनी गोलाकार संरचना से VWF, और उसके GPIB रिसेप्टर 6 के माध्यम से प्लेटलेट्स के साथ सूचना का आदान प्रदान A1 के डोमेन को उजागर करता है। प्रवाह कक्षों बड़े पैमाने पर प्लेटलेट समारोह 7 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

उल्लेखनीय है, यह भी एस प्रवाह के तहत ऑरियस आसंजन कतरनी पर सामने आ रहा है कि ए 1 डोमेन VWF आवश्यकता है, और विशेष रूप से। हम vWbp VWF बाध्यकारी मध्यस्थता की पहचान की। vWbp एस के लिए योगदान देता है कि एक coagulase है मेजबान के प्रोथ्रोम्बिन सक्रिय द्वारा ऑरियस pathophysiology। Staphylothrombin, Resएक जीवाणु coagulase और प्रोथ्रोम्बिन की जटिल ulting, अघुलनशील आतंच 8,9 में फाइब्रिनोजेन धर्मान्तरित। हमारे अध्ययन vWbp केवल प्रोथ्रोम्बिन सक्रिय नहीं करता है कि दिखाया गया है, लेकिन प्रवाह 4,10,11 के तहत रक्त वाहिकाओं के लिए आसंजन बढ़ाने के जो बैक्टीरिया-आतंच प्लेटलेट समुच्चय, का गठन हो सके है।

इन विट्रो प्रवाह चैम्बर मॉडल सेलुलर या मैट्रिक्स घटकों के लिए बैक्टीरियल आसंजन में विभिन्न खिलाड़ियों के अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। बैक्टीरियल विषैलापन कारकों विशिष्ट सतह प्रोटीन व्यक्त म्यूटेंट या अहानिकर बैक्टीरिया का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, pharmacologic inhibitors या अवरुद्ध एंटीबॉडी प्रवाह कक्ष में माध्यम से जोड़ा जा सकता है। ऐसे बाह्य मैट्रिक्स के विभिन्न घटकों के रूप में मेजबान कारकों की भूमिका अलग कोटिंग्स के साथ coverslips का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है। coverslips के भी सक्रियण स्थिति विशिष्ट stimulators जोड़कर संग्राहक किया जा सकता है, जिनमें से endothelial कोशिकाओं के साथ कवर किया जा सकता है। आपासंवहनी दीवार से आर टी, मेजबान रक्त कोशिकाओं और प्लाज्मा प्रोटीन का योगदान बह मध्यम करने के लिए इन कारकों को जोड़कर अध्ययन किया जा सकता है। इस प्रकार, बढ़ती जटिलता के विभिन्न स्थितियों बैक्टीरिया विवो में पोत दीवार का पालन करने की अनुमति देते हैं कि बातचीत को जानने के लिए लामिना का प्रवाह के मानकीकृत शर्तों के अधीन अध्ययन किया जा सकता है।

इन विट्रो मॉडल में पहचान की सहभागिता बाद में एक जटिल जीव में उनकी प्रासंगिकता का परीक्षण करने के लिए एक पशु मॉडल में अध्ययन कर रहे हैं। प्रवाह के तहत गतिशील बातचीत का अध्ययन करने के लिए vivo मॉडल में अन्य ऐसे हैम्स्टर पृष्ठीय skinfold चैम्बर 12 और cremaster मॉडल के रूप में 13, वर्णित किया गया है। इसकी तुलना में, यहाँ वर्णित mesenteric छिड़काव मॉडल, संभावना चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि की मेजबानी भिन्न करने के लिए और औषधीय हस्तक्षेप का मूल्यांकन करने के लिए, क्योंकि प्रयोग के अपने आसानी के कई लाभ प्रदान करता है।

अंत में, मॉडल वर्णितएस की न केवल सतह प्रोटीन अध्ययन करने की संभावना की पेशकश ऑरियस, लेकिन अलग मेजबान पृष्ठभूमि में कई अन्य सूक्ष्मजीवों के बेहतर नाड़ी संक्रमण के रोगजनन को समझने के लिए।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम Fonds वूर Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N द्वारा समर्थित किया गया था; बाल चिकित्सा कार्डियोलॉजी, UZ बेल्जियम, बेल्जियम के लिए "एड़ी Merckx अनुसंधान अनुदान" और "Sporta अनुसंधान अनुदान" (जे.सी.); आण्विक और संवहनी जीवविज्ञान के लिए केंद्र लोवेन विश्वविद्यालय से "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (गोवा 2009/13) और बोहरिंगर-Ingelheim से एक शोध अनुदान से, Programmafinanciering केयू लोवेन (पीएफ / 10/014) के द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion (BHI) BD Plastipak  237500
Tryptic Soy Broth (TSB) Oxoid CM0129
Phosphate Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-169 D-PBS
5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester  Sigma-Aldrich 21878-25MG-F fluorescent labeling 
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) Roch 10 735 086 001
Haemate-P CSL Behring PL 15036/0010 VWF
Horm collagen Takeda 10500 collagen
1-well PCA cell culture chambers Sarstedt 94.6140.102 plastic slips
Temgesic Reckitt Benckiser 283716 bruprenorphine
Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) Eurovet BE-V136516 ketamin
XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) VMD Arendonk BE-V170581 xylazine
2 french intravenous catheter green Portex 200/300/010
0,9% Sodium chloride (NaCl) Baxter Healthcare W7124
cotton swabs International Medical Product 300230
Ca2+-ionophore solution A23187 Sigma-Aldrich C7522-10 MG
26 gauge 1 ml syringe   BD Plastipak  300013
26 gauge 1 ml syringe  with needle BD Plastipak  300015 intra-peritoneal injection
Centrifuge 5810-R Eppendorf 5811 000.320
Glass cover slips (24x50) VWR BB02405A11 Thickness No, 1
PHD 2000 Infusion Harvard Apparatus 702100 High-accuracy Harvard infusion pump
Axio-observer DI Carl-Zeiss Inverted fluorescence microscope
ImageJ National Institute of Health Analysis software
Graphpad Prism 5,0 Graphpad Software Analysis software
AxioCam MRm Carl-Zeiss  Black and white camera

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References

  1. Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis. Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).
  2. Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells. Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).
  3. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).
  4. Claes, J., et al. Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein. Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).
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इम्यूनोलॉजी अंक 100 कतरनी तनाव, बैक्टीरिया आसंजन mesenteric परिसंचरण वॉन Willebrand कारक प्रवाह कक्ष नाड़ी संक्रमण संक्रामक अन्तर्हृद्शोथ रक्त वाहिका अन्तःचूचुक subendothelial मैट्रिक्स
<em>इन विट्रो में</em> और <em>vivo</em> मॉडल <em>में</em> पोत दीवार के नीचे प्रवाह की स्थिति के लिए बैक्टीरियल आसंजन अध्ययन करने के लिए
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Claes, J., Liesenborghs, L., Lox,… More

Claes, J., Liesenborghs, L., Lox, M., Verhamme, P., Vanassche, T., Peetermans, M. In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (100), e52862, doi:10.3791/52862 (2015).

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