Abstract
För att orsaka endovaskulära infektioner och infektiös endokardit, bakterier måste kunna ansluta sig till kärlväggen medan den utsätts för skjuvspänning av strömmande blod.
För att identifiera de bakteriella och värdfaktorer som bidrar till vaskulär vidhäftning av mikroorganismer, behövs lämpliga modeller som studerar dessa interaktioner under fysiologiska skjuvningsförhållanden. Här beskriver vi ett in vitro-flödeskammare modell som gör det möjligt att undersöka bakteriell vidhäftning till olika delar av den extracellulära matrisen eller till endotelceller, och en intravital mikroskopi modell som har utvecklats för att direkt visualisera den initiala vidhäftningen av bakterier till splanchnicus cirkulationen in vivo . Dessa metoder kan användas för att identifiera de bakteriella och värdfaktorer som krävs för vidhäftning av bakterier under flöde. Vi illustrerar betydelsen av skjuvspänningen och rollen av von Willebrand-faktor för adhesionen av Staphylococcus aureus med användning av både in vitro och in vivo-modell.
Protocol
Djurförsök har godkänts av den etiska kommittén för KU Leuven.
1. Förbereda bakterier för in vitro-perfusioner och in vivo
- Vi använde S. aureus stam Newman för alla experiment som beskrivs i detta manuskript. S. aureus Newman lagrades i Brain Heart Infusion (BHI) med 10% glycerol vid -80 ° C.
- Använd en steril ögla för att skrapa de frusna bakterier av och inokulera i 5 ml Tryptic Soy Broth (TSB) O / N vid 37 ° C (OD 600> 3).
- Tvätta bakterierna genom centrifugering (2600 g, RT, 5 min) och återsuspendera den bakteriella pelleten i 5 ml PBS (fosfatbuffrad saltlösning).
- Bered en 1 mg / ml lösning av 5 (6) -karboxi-fluorescein-N-hydroxisuccinimidylester (karboxifluorescein) i etanol. Späd 1 mg / ml karboxifluorescein lösning till 150 | ig / ml i laboratoriekvalitet vatten (t.ex., MilliQ vatten). Skydda rören från ljusmed aluminiumfolie och förvara vid -20 ° C.
- Centrifugera bakterier (2.600 xg, RT, 5 min). Resuspendera den bakteriella pelleten i 800 | il PBS och tillsätt 200 | il (slutlig koncentration av 30 | ig / ml för perfusion experiment) eller 400 | il (slutlig koncentration 50 | ig / ml för in vivo experiment) av 150 | ig / ml karboxifluorescein lösning. Skydda rören från ljus med aluminiumfolie och inkubera i 30 minuter vid RT på en shaker.
- Efter märkning, block med 6% bovint serumalbumin (BSA) -lösning i PBS.
- Späd bakterier med användning av optisk densitometri (OD), en OD 600 av 0,65 för in vitro-experiment (motsvarande ungefär 3 x 10 8 kolonibildande enheter (CFU) / ml för S. aureus) och en OD 600 av 1,8 för in vivo-experiment ( motsvarande cirka 1 x 10 9 CFU / ml för S. aureus) i PBS. Skydda rören från ljus med aluminiumfolie och lämna på is.
2. In vitro Perfusion Experiment
- Beläggning av täckglas
- Späd von Willebrand-faktor (vWF) (Haemate, förrådskoncentration 2400 fig / ml) i laboratoriekvalitet vatten (avjoniserat destillerat) till en slutlig koncentration av 50 | ig / ml.
- Späd kollagen i isoton glukoslösning (SKF lösning, pH 2,7-2,9, som levereras av tillverkaren) till en slutlig koncentration av 160 | ig / ml.
- Coat glas täckglas (24 × 50 mm) med VWF eller kollagen genom att släppa 200 ul av beläggningen på parafilm och placera täckglaset ovanpå droppen. Dropp sprids utmed ytan av täckglas.
- Inkubera täckglas i en fuktad behållare för 4 h vid RT. Lyft försiktigt täck från parafilm med en trubbig nål. Montera täckglas i den nedre delen av flödeskammaren.
- Beläggning av plast Slip med endotelceller
- Coat plast halk(1-väl PCA-cellodlingskammaren, Sarstedt, Tyskland) med en ml av en 1% gelatinlösning i PBS och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C. Seed humana navelvenendotelceller (HUVEC) på gelatinbelagda plast halk och odla dem till 70-80% konfluens. Montera plast glida i den nedre delen av strömningskammaren.
- Perfusion Experiment
OBS: En schematisk översikt av in vitro-perfusionen modell representeras i figur 1.- Utför in vitro bakteriella vidhäftningsstudier i en mikro-parallell plattflödeskammaren vid en laminär skjuvspänning mellan 2,5 dyn / cm 2 och 20 dyn / cm 2 för att simulera olika fysiologiska flödesbetingelser.
- Flödeskammaren (in-house design) består av en metallram och en perfusionskammare gjord av plexiglas (poly (metyl) (PMMA)). Genom att ansluta den till en hög noggrannhet infusionspump (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA), kan vi skapa flödes rates mellan 0,0001 | il / min och 220,82 ml / min.
- Anslut slangen till den övre delen av strömningskammaren och injicera mediet i röret. Placera försiktigt den övre delen av flödet kammaren på toppen av bottendelen och montera flödet kammaren. Var noga med att undvika luftbubblor. Injicera 1 ml medium genom kammaren för att säkerställa att kammaren inte läcker och att avlägsna överskott av beläggningslösning. Undvik luftbubblor.
- Placera musen på en termo-reglerad värmedyna vid 37 ° C på en mikroskopfältet. Eftersom detta är en terminal förfarande, finns det inget behov av strikt asceptic förfaranden. Gör ett snitt nära halsvenen, försiktigt bort den högra sidan av halsmuskeln och isolera halsvenen från den omgivande vävnaden.
- Ställ in infusionspump och fluorescensmikroskop. Infusionspump inställningarna beror på sprutan diameter och den önskade flödeshastigheten (se avsnitt 2.4). Från och med nu, arbeta i ett mörkt rum.
- VWF Coating:
- Fyll en spruta med fluorescerande bakterier och anslut den till inloppsröret. Undvik luftbubblor. Starta infusionspumpen under 10 min. Infusionstiden beror på skjuvhastigheten och beläggningen, bakterier och medium som används och bör representera det stationära tillståndet av vidhäftning.
- Efter 10 minuter, tvätta bort obundna bakterier genom att ansluta en spruta med PBS till inloppsröret och start av infusionspumpen.
- Ta åtminstone 15 bilder eller filmer på olika platser efter tvättprocessen. Bakterier är små och potentiellt svårt att fokusera på. Före in vitro-flödesexperiment, kan den lämpliga fokalplanet hämtas genom att placera en droppe av fluorescensmärkta bakterier på ett täckglas och placera täckglaset i flödeskammaren. Sedan kan du söka efter en lämplig fokalplanet och spara inställningarna.
OBS: Under in vitro flödesexperiment, fånga bilderna under tvättsteget (± 5 min efter start) säkerställer att endastsignal för vidhäftande bakterier fångas.
- Kollagen Coating:
- Tillsätt 60 mikrogram / ml VWF till de fluorescerande bakterier strax innan perfusion. Fyll en spruta med fluorescerande bakterier eller fluorescerande bakterier kompletteras med 60 mikrogram / ml VWF och anslut den till inloppsröret. Undvik luftbubblor. Upprepa steg 2.3.5.2 till 2.3.5.3
- Endotelceller:
- Aktiverar endoteliala celler genom perfusion med en 0,1 mM lösning av den Ca2 + -ionophore A23187 (stamlösning 10 mM löst i dimetylsulfoxid (DMSO)) i DMEM vid samma skjuvhastighet som den bakteriella perfusion under 10 min genom perfusion med en 0,1 mM. Upprepa steg 2.3.5.2 till 2.3.5.3.
- Beräkna skjuvhastighet och skjuvspänning enligt följande.
Skjuvhastighet = 6Q / wh 2
Där: Q: flödeshastighet i ml / min, vikt: bredd i cm, h: höjd i cm
Skjuvspänning (τ) = skjuvning råttaex viskositet (μ)
Där μ: medium: 0.01 dyn x sek / cm2, helblod: 0,04 dyn x sek / cm2 - Bildanalys
- Skaffa levande bilder med ett inverterat fluorescensmikroskop med en svartvit kamera och utveckla med hjälp av bildbehandlingsprogram. Använd exponeringstid på 1,5 sek. Ta flera bilder (minst 15) slumpmässigt spridda över den belagda ytan av flödet kammaren och spara dem i rätt filformat.
- Utför bildanalys med ImageJ. Subtrahera bakgrunden för att ta bort mjuka kontinuerliga bakgrunder från bilden (Process - subtrahera bakgrund) och definiera tröskeln för att fastställa lägre och övre tröskelvärdena, segmentera gråskalebilder till funktioner av intresse. Mät ytan begränsad till tröskeln.
- Jämför bakteriell vidhäftning, uttryckt som fluorescerande område, t ex med hjälp av statistisk programvara analys. Jämför grupper med enkelriktad ANOVA eller two-tailed Students t- test. Rapportera alla värden som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM). Betrakta en p- värde på <0,05 signifikant (* p <0,05, ** p <0,01; *** p <0,001).
3. In vivo Mesenteriska Perfusion Modell
- Förberedelse / operation av musen
- Snabb musen natten före försöket för att begränsa avföring.
- Ge en 6-8 veckor gammal mus (C57BL / 6) preoperativ analgesi genom en subkutan injektion av buprenorfin (0,1 mg / kg kroppsvikt (BW)) 20-30 minuter före det kirurgiska ingreppet.
- Söva musen genom intraperitoneal injektion av ketamin (125 mg / kg kroppsvikt) och xylazin (12,5 mg / kg kroppsvikt). Kontrollera med pedal reflex. Applicera veterinär salva för att förhindra torrhet.
- Placera musen på en termo-reglerad värmedyna vid 37 ° C på en mikroskopfältet. Eftersom detta är en terminal förfarande, det finns inget behov av strikt asceptic förfaranden. Gör ett snitt nära halsvenen, försiktigt bort den högra sidan av halsmuskeln och isolera halsvenen från den omgivande vävnaden.
- Sätt i en 2 French venkateter i den högra halsvenen för infusion av fluorescensmärkta bakterier eller andra lösningar. Öppna bukhålan via en mittlinje buksnitt och använda bomullstoppar för att sprida mesenteriet och visualisera mesenteriala arteriolär och venular cirkulation.
- Placera musen på höger sida på en transparent platta och säkra kanylen med tejp. Använd en varm pack för att förhindra hypotermi. För att förhindra uttorkning av vävnaden, släpp 500 pl 0,9% NaCI på tarmarna.
- Fluorescensmikroskopi av bakteriell vidhäftning till den mesenteriala cirkulations
- Arbete i ett mörkt rum. Använd bomullspinnar för att immobilisera fartygen och visualisera dem under ett inverterat mikroskop.
- Lokalt gäller 5 il av en 10 mM lösning of Ca2 + -ionophore A23187 löstes i DMSO. Efter 10 sekunder, injicera 100 pl märkta bakterier (se steg 1) genom jugular kateter. Ta tidsförlopp bilder. Efter experimentet är klar, euthanize musen enligt institutionella godkända riktlinjer.
- Bildanalys
- Skaffa levande bilder med ett inverterat fluorescensmikroskop, tagits med en svartvit kamera och utvecklas med någon bildbehandlingsprogram. Applicera automatiserad exponeringstid och kontrast optimering specifik för den använda utrustningen.
- Förvärva tidsförlopp bilder med hjälp av "Förvärv" i verktygsfältet (Multidimensional Förvärv - Time) använder 40 cykler av 1.000 bilder / sek. Spara bilderna i ett lämpligt bildfilsformat.
- Process bilder med hjälp av ImageJ analysprogram för att mäta området fluorescerande signal per bild. Definiera tröskeln för att fastställa lägre och övre tröskelvärdena, segmentera gråskalebilder till features av intresse. Identifiera regionen av intresse (blodkärl) och mäta ett område som begränsas till tröskeln och regionen av intresse. Jämför bakteriell vidhäftning, uttryckt som fluorescerande området med någon statistisk eller grafiska program.
Representative Results
S. aureus vidhäftning till VWF är subendoteliala matris och endotelceller en skjuvspänning beroende fenomen
För att understryka betydelsen av skjuvspänningen i samspelet mellan S. aureus och VWF utförde vi perfusioner över VWF belagda täckglas vid olika skjuvhastigheter (en schematisk översikt av det in vitro-perfusionen modellen ges i figur 1. Vidhäftning av S. aureus till vWF ökade med ökande skjuvningshastigheter från 250 sek -1 till 2000 sek -1 (figur 2), vilket tyder på att höga skjuvkrafter inte inhiberar men förstärka vidhäftningen av bakterier till VWF.
För att undersöka bidraget av VWF till bakteriell vidhäftning till kollagen, den viktigaste komponenten i den subendoteliala matrisen, vi perfunderades fluorescerande S. aureus över kollagen i närvaro eller frånvaro av VWF. I avsaknad av VWF, vidhäftning av S. enureus till kollagen minskade med ökande skjuvhastigheter. När emellertid VWF var närvarande i mediet, vidhäftningen av S. aureus ökade med ökande skjuvhastigheter (fig 3).
In vitro flödesmodell gör att vi också att undersöka vidhäftningen av bakterier till endotelceller i flödet. Vi perfusion HUVEC med fluorescerande S. aureus vid skjuvhastigheter från 500 till 2.000 sek -1. Där så anges, var HUVEC aktiveras med en Ca2 + -ionophore, för att orsaka frigivning av VWF. Endotelcellaktivering och den efterföljande VWF release, ökad vidhäftning av S. aureus (Figur 4A), som bildade typiska "strängliknande" mönster av fluorescensmärkt bakteriekluster inriktade i riktning mot skjuvkraft (Figur 4B), vilket tyder på bindning av bakterier längs en linjär sträckt VWF-molekylen.
Initial in vivobakteriell vidhäftning i splanchnicus vener förmedlas av VWF
Eftersom S. aureus är i stånd att ansluta sig till VWF använde vi vildtyp möss (VWF + / +) och VWF-brist möss (vWF - / -) för att undersöka bakteriell vidhäftning till den aktiverade kärlväggen in vivo. Realtids videomicroscopy av splanchnicus vener tillät visualisering av cirkulerande fluorescerande S. in vivo aureus (Schematisk översikt av in vivo-perfusionen modell är representerad i fig 5).
Efter farmakologisk aktivering av endotel av Ca2 + -ionophore, observerade vi en snabb lokal ansamling av enskilda bakterier och aggregat av bakterier till kärlväggen för WT-möss (kompletterande bilder 1 och 2). Nästan ingen adhesion av bakterier observerades på den aktiverade kärlväggen av vWf -deficient möss (extra Video 3) jämfört med vidhäftning i WT möss (Figur 6). Frånvaron av VWF minskar förmågan hos S. aureus att ansluta sig till den aktiverade kärlväggen.
Figur 1. En schematisk representation av in vitro flödesmodellen i. In vitro flödesmodellen är en multifunktionell modell, som gör det möjligt att studera olika beroende mekanismer skjuvning såsom bakteriell vidhäftning till den subendoteliala matrisen utan även trombosbildning. Mikro parallellt flöde Kammaren står på ett täckglas (plast eller glas) med olika beläggningar av proteiner och endotelceller. Vidhäftningen av olika bakterier (orange och grå prickar) kan analyseras, och effekten av närvaron av plasmaproteiner, blodplättar och helblod kan utvärderas. Fluorescerande markörer för blodplättar (blå ovaler) eller fibrinogsv (blå strängar) kan användas i kombination med olika inhibitorer (svarta ovaler) för att skilja bakteriella och värdfaktorer. Representativa bilder av bakteriell vidhäftning av S. aureus till kollagen beläggning i närvaro (botten) eller frånvaro (överst) av VWF visas (skala bar är 100 mikrometer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Vidhäftning av S. aureus till VWF ökar med ökande skjuvhastigheter. Mikroparallellflödeskammare perfusion över belagda VWF (50 | ig / ml) med fluorescensmärkt S. aureus Newman vid skjuvhastigheter av 250 till 2.000 sek -1 (s -1) i medium (n> 5). Alla resultat är uttryckta som medelvärde ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01.
Figur 3. Vidhäftning av S. aureus till subendotel är skjuvning och VWF beroende. Micro-parallellflödeskammare perfusion över belagd kollagen (160 mikrogram / ml) med fluorescerande S. aureus Newman vid skjuvhastigheter av 250 till 2.000 sek -1 i medium (n> 5). VWF (60 | ig / ml) var närvarande i mediet där så anges. Alla resultat är uttryckta som medelvärde ± SEM. ** P <0,01.
Figur 4. Vidhäftning av S. aureus till aktiverade endotelceller är skjuvning beroende. Micro-parallellflödeskammare perfusion över endotelceller. (A) Mänskliga navelvenendotelceller aktiverades med Ca2 + -ionophore A23187 (0,1 mM) följt av en 10 minuters perfusion av fluorescensmärkt S. aureus Newman vid skjuvhastigheter av 500 till 2.000 sek -1 i medium (n> 5). Alla resultat är uttryckta som medelvärde ± SEM. * P <0,05. (B) Bild av mikroparallellflödeskammare perfusion över aktiverade HUVEC med S. aureus vid en skjuvhastighet av 1000 sek -2. S. aureus bildar strängar av ± 200 mikrometer längd, vilket tyder på vidhäftning till VWF multimerer (skala bar är 100 mikrometer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. En schematisk översikt över in vivo mesenteriska perfusion modell. En högra halsvenen kateter (gula linjen) är införd för administrationen av fluorescently märkta bakterier (orange prickar), ytterligare bedövningsmedel eller andra komponenter såsom läkemedelshämmare och antikroppar. Bukhålan öppnas och mesenteriet sprids för att visualisera blodkärl (venösa och arteriella) under ett fluorescensmikroskop. Efter farmakologisk aktivering av endotel av Ca2 + -ionophore, som inducerar frisättning av VWF kan bakterier injiceras genom halsvenen kateter. Realtids intravaskulär videomikroskopi tillåter in vivo visualisering av cirkulerande fluorescerande bakterier och den resulterande bildningen av bakterieplätt tromber. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Den initiala vidhäftningen av S. aureustill aktiverat endotel in vivo förmedlas av VWF In vivo venös mesenterial perfusion modell med C57BL / 6- VWF + / + och C57BL / 6- VWF -. / - möss. Adhesion av fluorescensmärkt S. aureus till den lokalt aktiverade kärlväggen är signifikant lägre i vWF - / - möss. Alla resultat är uttryckta som medelvärde ± SEM. *** P <0,001, n> 7.
Video 1: realtid vidhäftning av S. aureus till aktiverat kärlväggen i vWf + / + möss. Klicka här för att se filmen.
Video 2: realtid aggregatbildning och embolisering av S. aureus i vWf + / + möss. Klicka här för att se filmen.
Video 3: Real-time vidhäftning av S. aureus till aktiverat kärlvägg i vWF - / -. möss In vivo mesenterica perfusion modell med VWF + / + och vWF - / - möss. Fem | il av en Ca2 + -ionophore (10 mM) var tillämped till regionen av det visualiserade kärlbädden. En suspension av karboxi-fluorescein-märkt S. aureus injicerades genom jugular kateter. Den mesenterisk cirkulation visualiserades under ett inverterat mikroskop. Klicka här för att se filmen.
Discussion
Skjuvspänning är en avgörande faktor för den tidiga bakteriell vidhäftning till kärlväggen och för nästa generation av endovaskulära eller endokardiska vegetation och metastaserande infektioner 4,5. Vi beskrev komplementära in vitro och in vivo-modeller för att studera patogenesen för endovaskulära infektioner under fysiologisk skjuvspänning. Dessa modeller har tillåtit oss att identifiera von Willebrands faktor bindande protein (vWbp) som den huvudsakliga S. aureus protein för att interagera i flödet med en skadad kärlväggen utsätta VWF 4.
Endovaskulära infektioner och infektiös endokardit i synnerhet, är av intresse inte bara på grund av sepsisinducerad organsvikt och död, men också på grund av lokala och avlägsna ("metastaserande") komplikationer. För att få infektiös endokardit och metastaserande infektioner, bakterier måste hålla sig till kärlväggen och därmed motstå skjuvspänning av strömmande blod. Meststudier av bakterier virulensfaktörer har utförts under statiska förhållanden. Dock kan dessa etablerade interaktioner inte motstå skjuvkrafter och studier inom ramen för flödesförhållanden kan avslöja nya, tidigare okända faktorer i bakterievärd samspel.
Använda mikro parallella flödeskammare, har vi och andra visat på betydelsen av VWF för vaskulär vidhäftning. Under skjuvspänning, VWF successivt Utfällbar från sitt viloläge klotformiga struktur, och exponerar A1 domän som interagerar med blodplättar via sin GPIb receptor 6. Flödeskammare har i stor utsträckning använts för att studera trombocytfunktionen 7.
Anmärkningsvärt, även S. aureus vidhäftning under flöde kräver VWF, särskilt A1-domänen som exponeras vid skjuvning. Vi identifierade vWbp att medla VWF-bindning. vWbp är en koagulas som bidrar till S. aureus patofysiologi genom att aktivera värdens protrombin. Staphylothrombin, resulting komplex av en bakteriell koagulas och protrombin, omvandlar fibrinogen till olösligt fibrin 8,9. Våra studier har visat att vWbp inte bara aktiverar protrombin, men utlöser bildningen av bakterier-fibrin-blodplättsaggregat, som ökar vidhäftningen till blodkärlen enligt flödes 4,10,11.
In vitro flödeskammare modell gör det möjligt att studera de olika aktörerna i bakteriell vidhäftning till cellulära eller matriskomponenter. Bakterie virulensfaktorer kan studeras med hjälp av mutanter eller ofarliga bakterier som uttrycker specifika ytproteiner. Alternativt kan farmakologiska hämmare eller blockerande antikroppar sättas till mediet i flödeskammaren. Kan studeras rollen av värdfaktorer såsom olika beståndsdelar i extracellulär matrix genom att använda täckglas med olika beläggningar. De täck kan också täckas med endotelceller, som aktiveringsstatus kan moduleras genom att lägga till specifika stimulatorer. Apart från kärlväggen, kan studeras bidrag av värdblodkroppar och plasmaproteiner genom att lägga till dessa faktorer till det strömmande mediet. Sålunda kan studeras olika villkor för ökande komplexitet under standardiserade villkor för laminärt flöde att avslöja växelverkningar som gör bakterier att vidhäfta till kärlväggen in vivo.
Interaktioner som identifieras i in vitro-modell därefter studeras i en djurmodell för att testa deras relevans i en komplex organism. Andra in vivo-modeller för att studera dynamiska interaktion under flöde har beskrivits, såsom hamster dorsala skinfold kammaren 12 och cremaster modellen 13. I jämförelse, den mesenteriala perfusion modell som beskrivs här erbjuder flera fördelar på grund av dess användarvänlighet, möjligheten att variera värd genetisk bakgrund av mössen och utvärdera farmakologiska interventioner.
Sammanfattningsvis, den beskrivna modellererbjuder möjligheten att studera ytproteiner inte bara av S. aureus, men av många andra mikroorganismer i olika värd bakgrunder, för att bättre förstå patogenesen av vaskulära infektioner.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; "Eddy Merckx bidrag" och "Sporta forskningsanslag" för barnkardiologisk, UZ Leuven, Belgien (JC); Centrum för molekylär och Vascular biologi stöds av Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), av "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (GOA 2009/13) från universitetet i Leuven och ett forskningsbidrag från Boehringer-Ingelheim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
| 5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
| Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
| Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
| 1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | 94.6140.102 | plastic slips |
| Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
| Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
| XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
| 2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
| 0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
| cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
| Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
| 26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
| Glass cover slips (24x50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
| PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
| Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
| Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
| AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera |
References
- Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P.
- Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells. Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).
- Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).
- Claes, J., et al. Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein. Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).
- Thiene, G., Basso, C. Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves. Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).
- Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin. Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).
- Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress. Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).
- Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase. FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).
- Friedrich, R., et al. Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation. Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).
- Vanassche, T., et al. Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).
- Vanassche, T., et al. The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections. J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).
- Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo. Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).
- Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. J Vis Exp. 2 (74), (2013).
