עמידות לתרופות לטיפולים ממוקדים היא נרחבת והצורך לזהות מנגנונים של התנגדות – לפני או אחרי הופעה קלינית – היא קריטי להדרכת אסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגזירה כמה קווים עמידים לתרופות במבחנה עם רצף לזרז גילוי המנגנונים אלה.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
אפיון מולקולרי מפורט של הגנום גידול על ידי טכנולוגיות רצף חזקות וכלים אנליטיים נתונים משופרים הוביל לגילוי של שינויים גנטיים מרכזיים בסוגי הסרטן ספציפיים 1,2. פיתוח של טיפולים ממוקדים במטרה הנגעים הגנטיים הללו, כגון HER2, BCR-ABL, EGFR וALK, השתפר באופן משמעותי באיכות חיים של חולי 1,2. עם זאת, למרות ייחודה של גישה זו, התגובה הקלינית לטיפולים בודדים ביותר הייתה תת-אופטימלית כהתנגדות סופו של דבר מתגלה. לאחרונה, התקדמות משמעותית נעשתה בהבנת היסודות המולקולריים של התנגדות לתרופות ממוקדות. מעניין לציין, שזה הופך להיות ברור כי מנגנון בולט של התנגדות כרוכה פעילות היעד / מסלול מתמשך. כדוגמה לכך, קולטן האנדרוגן (AR) -directed טיפול enzalutamide של סרטן הערמונית גורם להעשרת הפעלת מוטציות בAR עצמו, שמירה על outp איתות-ARut בנוכחות המעכב 3-5. ידע זה הוביל לקמפיין אגרסיווי ל1) לפתח יריבים דור שלישיים שיכול להמשיך לדכא שני WT ותפקוד המוטציה-AR בenzalutamide עמיד PCA 3 ו -2) לזהות צמתים במורד הזרם פוטנציאליים של איתות AR שעשוי להיות ממוקד להתערבות טיפולית . באופן דומה, התנגדות לסוגים אחרים של מעכבים כגון אלה מיקוד EGFR, BRAF וABL לעתים קרובות להוביל למוטציות שמחדש את מסלול קינאז ממכר המקורי 1.
בידיעה שההתנגדות עולה באופן בלתי נמנע ברוב החולים, פיתוח גישות להביא זריזות מנגנונים אלה לאור יאפשר פיתוח של טיפולי מעקב יעילים. גישה אחת שנמצא בשימוש נרחב היא לנתח את הגנומיקה של גידולים עקשן קליניים ביחס לגידולי טיפול-נאיבי או -sensitive לזהות מוספים / depletions בנגעים גנטיים שעשויה להיות נוח לדגילוי שטיח. למרות הבטחתה, יש שתי התחייבויות עיקריות של גישה זו שתפגענה בגילוי מהיר. ראשית, לקבל גישה לחומר בזמן גידול לחקירה הגנומי עשויה לשמש כמכשול משמעותי במעבר מטיפול כדי לרפא. שנית, deconvolution של מספר עצום של נגעים גנטיים בהגדרה עמידה עשוי להיות מאתגר מאז גידולים יכולים להציג ההטרוגניות התוך ממאירות משמעותית 6,7.
לאור אתגרים אלה, יש כבר עלה הסתמכות על גילוי פרה-קליני של מנגנוני התנגדות. גישה זו עשויה לאפשר זיהוי של מנגנוני התנגדות בולטים לפני הניסויים הקליניים שעשויות להנחות 1 אסטרטגיות חלופיות לניהול קליני בחולים שנושאים מנגנונים אלה גם לפני טיפול או בעקבות תחילתה של התנגדות.
כלי אחד כזה פרה-קליני גילוי שנמצא בשימוש נרחב הוא להחיל מסכי RNAi פונקציונליים משוחד. לבחינהple, ויטאקר ועמיתים מיושמים מסך RNAi הגנום בקנה מידה לזהות כי אובדן NF1 מתווך התנגדות למעכבי RAF וMEK באמצעות הפעלת מסלול MAPK ספג 8. ממצאים אלה נמצאו להיות רלוונטיים מבחינה קלינית כמוטציות פסד של הפונקציה בNF1 נצפו בתאי גידול -mutant BRAF שמהותו עמידים לעיכוב חיל האוויר המלכותי ובגידולים מלנומה עמידים לvemurafenib הפעלה 8. עם זאת, למרות הצלחתה של גישה זו, מטרות רלוונטיות מבחינה קלינית רבות לעתים קרובות אינה מזוהות, ככל הנראה בשל ההטיה הפסד של פונקציה של גישה זו.
לעומת זאת, כלי פחות מוטה לגילוי פרה-קליני של מנגנוני התנגדות כרוך הדור של שורות תאים עמידות בחשיפה ממושכת למתחם של עניין בשילוב עם פרופיל הגנומי או transcriptomic מבוסס NGS. גישה זו יושמה בהצלחה על ידי מספר קבוצות לזהות ספונטנישינויים חוזרים ונשנים אחת גרסאות נוקלאוטיד או ביטוי שיאפשר התנגדות 5,9,10. לדוגמא, מוטציה F876L חוזרת בAR התגלתה לאחרונה בשיבוטים עמידים במבחנה 3-5 ובגידולי xenograft in vivo 5 לפני זיהוי מוטציה זו במרפאת 4. ממש לאחרונה, באנג ועמיתיו (2015) 11 משמשים ClonTracer בשני דגמים רלוונטיים קליני להראות כי רוב השיבוטים עמידים המתעוררים במהלך חשיפה לסמים ממושכת היו חלק מתת-אוכלוסייה מראש קיימים מצביעה על כך שרוב רלוונטי תפקודי מוטציות הם כנראה כבר קיים מראש שהופך נבחר לבמהלך בחירה 11.
בניגוד לפרופיל הגנטי של גידולים שנאמרו קודם לכן, יתרונות גישה זו מפחות ההטרוגניות כשיבוטים "הומוגנית" עמידים המשמשים לניתוח להקל נתיחה גנטית מדויקת יותר של פוטנציאל נהגים. Furthermבצר, מרגש, בנוסף לפוטנציאל לחשיפת מנגנונים של התנגדות, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לזהות את המנגנונים התאיים של פעולה ומטרות של מולקולות קטנות ביו שמידע זה הוא 10 לא ידוע. בהתחשב ביתרונות ברורים ושימושים רבים של גישה זו, כאן אנו מציגים פרוטוקול המפרט את היישום מוצלח של מסך כזה פרה-קליני למקסם את הפוטנציאל לתגליות משמעותיות קליני.
בחירה של קו תא (ים): אפיון של מדינה גנטית וחוסר יציבות גנומית
אין ספק, הגורם היחיד הקריטי ביותר בחשיפה בהצלחה קלינית מנגנוני התנגדות רלוונטיים היא בחירת קו התא הראשונית. שני גורמים צריכים להיחשב. ראשית, מטרה לבחור קו תא (ים) של אותו השושלת / תת סוג חסת התכונות גנטיות ההגדרה של המחלה (למשל., BRAF V600E מלנומה). חקירה של נתונים transcriptomic ומוטציה זמינים בפומבי לשתי שורות תאי 30-32 וגידולים ראשוניים / גרורות למגוון אינדיקציות 33,34 תקל על תהליך הבחירה. למרות זיהוי של שורות תאים עם שינויים גנטיים רלוונטיים מבחינה קלינית הוא אידיאלי, במקרים מסוימים זה עשוי להיות לא אפשרי בגלל חוסר שורות תאים זמינים או אפשרי בשל גורמים כמו קושי ואורכו של תהליך המיון.
<p class="jove_content"> בנוגע לנקודה האמורה, גורם שני הוא לשקול לאחר מכן במהלך בחירת שורת תאים הוא הקלות או הכדאיות של התנגדות הקרנה באמצעות הקו הרצוי. לדוגמא, גורמים כגון הפצה ושיעורי מוטציה פנימיות יכולים להשפיע במידה רבה על המהירות של גילוי. לשם כך, יכולות להיות מנוצלת שורות תאים עם קינטיקה מהירה צמיחה וחסרה מנגנוני DNA MMR בתקווה שהופעתה של התנגדות ספונטנית יכולה להיות מואצת 35. בהתבסס על המאגר קוסמי, כמה שורות תאי מועמד קיימות עם מחסור באחד משני הגנים שעברו מוטציה לעתים קרובות MMR, MSH2 או MLH1 (לוחות 2 ו -3). לחלופין, אם שורות תאים של עניין לא קיימות פגמים נושאים בMMR, טיפול אקוטי עם מוטציות כימיות פיזיות או DNA תגובתי כגון סוכן אלקילציה -nitrosourea N -ethyl- N (ENU) יכול לשמש כדי לשפר חוסר יציבות גנומית. למרות ששני הגישות רשאית זה באופן משמעותיHorten הזמן להשיג שיבוטים עמידים ומעקב רצף, בדיקות פונקציונליות מחמירות צריכה להתבצע על גני מועמדים כמספר גדול יותר של אי-פונקציונלי, מוטציות נוסעים צפויות לצאת. SNVs יכול להיות דרגת הורה למקסם את הסיכויים לזיהוי מוטציות רלוונטיות מבחינה תפקודית. ראשית, בחירה אלה מוטציות שחוזרות על עצמם בשיבוטים עצמאיים תגדיל את סבירות מוטציות אלה הן נהגים של התנגדות. במקרה מוטציות חוזרות ונשנות אינן מזוהות, תוך התמקדות בSNVs שמתאים את מנגנון פעולה של התרופה (לדוגמא, יעד הסמים או מפעיל במורד הזרם ידוע של יעד התרופה) עשוי להיות משמעותי. סופו של דבר, את תקן הזהב הוא תמיד הערכה ניסיונית של פעילות התנגדות-הענקת SNVs המועמד על ידי ביטוי cDNA חוץ רחמי בתאי הורים תרופה רגישה.ה- DNA לעומת רצף RNA
שיבוטים פעם עמידים כבר נוצרו, DNA ו / או RNAיכול להיות רצף בהתאם לצורך. רצפי DNA, או exome או רצף הגנום, יאפשר זיהוי של גרסאות germline וגופניים, כגון SNPs, indels ולהעתיק מספר הגרסאות. בעוד רצף exome עלות ידידותית יותר מתמקד ביצירת קוראת מאזורי קידוד ידועים, רצף הגנום יפיק נתונים רצף לכל הגנום אשר עשוי להקל על זיהוי של מוטציות באלמנטי קידוד שאינו כגון משפרי או miRNAs 36. עם זאת, מאז נתונים ביטוי גנים לא תעיד ברצפי DNA, שקשה לחזות שמוטציה (ים) עשוי להיות נהג פונקציונלי. בהקשר זה, הרצף של RNA, אם כי יקר יותר, מציע את היתרון הזה. העובדה שייעוד המוטציה מתבצע רק על מיני RNA מתבטאים משפרת את הסיכוי שהמוטציה של עניין עשויה להיות נהג פונקציונלי. בנוסף מאפשר סקר ממוקד יותר של מוטציות לבדיקה פונקציונלית מעקב, רצף RNA גםמציע יתרון הנוסף של להיות מסוגל לזהות שינויים גנטיים ביטוי, שחבור חלופי ומיני RNA chimeric רומן, כולל שילובי גן שעשוי לשמש גם נהגים חזקים כמו של התנגדות.
צינור ביואינפורמטיקה
פקודות דוגמא מסופקות להמחשה, אבל תיעוד והדרכות מפורטים יותר זמינים מהרחב מכון 16 ויש לקרוא ביסודיות לפני תחילת ניתוח NGS. הפקודות הבאות מיועדות לסביבת UNIX פגז במערכת שבה כל הכלים ומידע התייחסות הותקנו מראש. פקודות אלה גם להניח קבצי FASTQ רצף לזווג-הסוף המכיל קורא משתי דגימות, בשם "הורים" ו- "עמיד", כבר קיבל מהספק והניח בספרייה "נתונים". ברוב המקרים צריכים להיות מותאמות בפקודות אלה או מותאמים ליישום ספציפי באמצעות arg נוסף של שורת הפקודהuments (למשל, הוספה "-t 8" לפקודת BWA מאפשרת פעולה מרובה על פני 8 ליבות מעבד). קבוצות קראו (שלהקצות מערכים לדגימות ביולוגיות), חייבות לעתים קרובות ניתן להוסיף לקבצי BAM גם אם יש דגימה אחת בלבד לכל קובץ BAM, על מנת לעמוד בדרישות פורמט קובץ לכלים מסוימים. קראו פרמטרים קבוצת RGID, RGSM, RGPL, RGPU, וRGLB יכול להיות מחרוזות שרירותיות המתארות את שם המדגם, פלטפורמת רצף, ואסטרטגיה ספרייה.
במבחנה לעומת מבחני in vivo
למרות שכמה מנגנוני התנגדות זוהו על ידי בחירה במבחנה אומתו להיות רלוונטי מבחינה קלינית, קיים אפשרות שהמנגנונים לא יכולים לשמש מנגנונים רלוונטיים או דומיננטיים כמו של התנגדות קלינית. אחת סיבות לכך עשויות לכלול תפקיד חיוני למייקרו-הסביבה בנהיגת התנגדות לטיפול, רכיב שהוא נטול בניסוי הפרוטוקול / ההתקנה דiscussed עד כה. ואכן, מספר מחקרים הראו כי חומרים אנטי-סרטניים שמסוגלים להרוג תאי גידול כבלתי יעילים כאשר התאים הסרטניים בתרבית בנוכחות של תאי סטרומה רומזים מנגנונים מולדים של התנגדות שמעניק סטרומה 37,38. לזהות מנגנונים מושרה סטרומה כגון רכשו התנגדות, ניתן לשקול ביצוע שיתוף תרבות במבחנה או במבחני עמידות גידול vivo. מאז assay לשעבר הוא די מורכב, רבים נקטו יצירת xenografts גידול עמידה לתרופות לטיפול בתפקיד הפוטנציאלי של סטרומה בנהיגת התנגדות. מחקרים כאלה חשפו 5 וייחודיים 39 שני מנגנונים הזהים של התנגדות ביחס לבחירה במבחנה, רומזים כי סטרומה אכן עשויה לשחק תפקיד באחרון. עם זאת, יש להיות מודע לאורכו של זמן זה עלול לקחת כדי ליצור גידולים עמידים כגון ואת המורכבות של הניתוח-complexitie הגנומי המעקבים בשל ההטרוגניות המולקולרית ותאית תוך ממאירות.
זיהוי יעד
בנוסף לחשיפת מנגנוני עמידות לתרופה, גישת פרופיל הגנומי מבוסס NGS זה יכול להיות מיושמת גם כדי לזהות מטרות סלולריות של בדיקות כימיות. מבחינה הסטורית, שיטות משוחדת מרובות כבר משמשות לזיהוי המנגנונים התאיים של פעולה ומטרות של כימיקלים במשקל מולקולריים נמוכים עם פעילות ביולוגית, כוללים טיהור זיקה בשילוב עם פרוטאומיקה כמותית, שיטות הגנומי שמרים, הקרנת RNAi, ומסקנה חישובית גישות 40. כהרחבה להבהרת מנגנוני סמים התנגדות באמצעות פרופיל הגנומי או transcriptomic מבוסס NGS של אוכלוסיות תאי phenotypically עמידות, זיהוי של וריאציות ייחודיות חוזרות אחת נוקלאוטיד (SNVs) או שינויי ביטוי המאפשרים התנגדות יכולה להציע תובנות יעדים סלולריים פונקציונליים של תרכובות. Tשלו מבוסס על הרעיון שקבוצת משנה של מנגנוני התנגדות נצפו עשויה להיות כרוך מוטציות חוזרות ונשנות בגנים המקודדים את חלבון היעדים הישירים של המולקולה הקטנה. לאחרונה, כמה דיווחי תוקף השירות של הגישה, במיוחד על ידי שילוב עם גישות אחרות, כוללים פרופיל רגישות שורת תאי הסרטן בקנה מידה גדולה, לחשיפת היעדים הסלולריים של מולקולה קטנה בוחן 9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |