La résistance aux médicaments à thérapies ciblées est très répandue et la nécessité d'identifier les mécanismes de résistance – avant ou après l'apparition des symptômes – est essentiel pour guider les stratégies alternatives de gestion clinique. Ici, nous présentons un protocole de coupler dérivation de lignées résistantes aux médicaments in vitro avec le séquençage d'accélérer la découverte de ces mécanismes.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Caractérisation moléculaire détaillée du génome de la tumeur par les technologies de séquençage robustes et outils d'analyse de données améliorée a conduit à la découverte d'altérations génétiques dans les principaux types spécifiques de cancer 1,2. Développement de thérapies ciblées visant à ces lésions génétiques, comme HER2, BCR-ABL, EGFR et ALK, ont considérablement amélioré la qualité de vie des patients 1,2. Cependant, malgré la spécificité de cette approche, la réponse clinique à la plupart des thérapies individuelles a été sous-optimale que la résistance se dégage finalement. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés dans la compréhension des fondements moléculaires de la résistance aux thérapies ciblées. Curieusement, il devient évident qu'un mécanisme de premier plan de la résistance implique une activité cible / voie persistante. Comme un cas au point, récepteur des androgènes (AR) -directed traitement enzalutamide du cancer de la prostate conduit à un enrichissement des mutations activatrices dans AR lui-même, le maintien AR-signalisation output en présence de l'inhibiteur de 3-5. Cette connaissance a conduit à une campagne agressive pour 1) développer des tiers antagonistes de production qui peuvent continuer à supprimer à la fois WT et la fonction mutant-AR dans enzalutamide résistant CaP 3 et 2) identifier les noeuds en aval potentiels de signalisation AR pouvant être ciblés pour une intervention thérapeutique . De même, la résistance à d'autres classes d'inhibiteurs tels que ceux ciblant l'EGFR, BRAF et ABL conduisent souvent à des mutations qui réactivent la kinase addictif origine 1.
Avec la connaissance que la résistance émerge inévitablement dans la plupart des patients, développer des approches pour mettre rapidement ces mécanismes à la lumière permettra développement de thérapies de suivi efficaces. Une approche qui est largement utilisé est d'analyser les génomique des tumeurs réfractaires cliniques par rapport à tumeurs naïfs de traitement ou -sensibles pour identifier les enrichissements / épuisement des lésions génétiques qui peuvent se prêter à dtapis découverte. Malgré sa promesse, il ya deux grands engagements de cette approche qui entravent la découverte rapide. Tout d'abord, l'accès en temps opportun à la matière de la tumeur pour interrogatoire génomique peut servir comme un obstacle important dans le déplacement de la thérapie pour guérir. Deuxièmement, déconvolution de la myriade des lésions génétiques dans le cadre résistante peut être difficile puisque les tumeurs peuvent présenter importante hétérogénéité intra-tumorale 6,7.
À la lumière de ces défis, il a été un recours accru à la découverte préclinique de mécanismes de résistance. Cette approche peut permettre l'identification des mécanismes de résistance importants avant les essais cliniques 1 qui peuvent guider les stratégies de gestion alternatives clinique chez les patients qui portent ces mécanismes soit avant le traitement ou après le début de la résistance.
Un tel outil de découverte préclinique qui est largement utilisée est d'appliquer écrans ARNi fonctionnels impartiales. Pour examenple, Whittaker et ses collègues ont utilisé un écran l'échelle du génome ARNi pour identifier que la perte NF1 médie une résistance aux inhibiteurs de la RAF et de MEK par voie MAPK soutenue activation 8. Ces résultats ont été jugés cliniquement pertinente des mutations perte de fonction dans NF1 ont été observés dans les cellules tumorales -mutant BRAF qui sont intrinsèquement résistante à l'inhibition de la RAF et dans les tumeurs de mélanome résistantes à vemurafenib activation 8. Toutefois, malgré le succès de cette approche, de nombreuses cibles cliniquement pertinentes sont souvent pas identifiés, sans doute en raison de la partialité de cette approche de perte de fonction.
En revanche, un outil de découverte moins biaisée préclinique des mécanismes de résistance implique la génération de lignées cellulaires résistantes à travers une exposition prolongée au composé d'intérêt couplé avec le profilage génomique ou transcriptomique à base de NGS. Cette approche a été mise en œuvre avec succès par plusieurs groupes pour identifier spontanéeVariantes de nucléotides ou d'expression simples modifications récurrentes qui permettent la résistance 5,9,10. Par exemple, une mutation F876L récurrent dans AR a été récemment découvert dans les clones résistants in vitro et dans des tumeurs 3-5 xénogreffe in vivo 5 avant l'identification de cette mutation dans la clinique 4. Très récemment, Bhang et ses collègues (2015) 11 utilisé ClonTracer en deux modèles cliniquement pertinents pour montrer que la majorité des clones résistants qui se posent lors de l'exposition de drogue prolongée faisaient partie d'une sous-population pré-existante qui suggère que les mutations les plus fonctionnellement pertinents sont probablement déjà pré-existante qui deviennent sélectionné lors de la sélection pour 11.
Contrairement au profilage génomique des tumeurs évoquées plus haut, cette approche bénéficie d'hétérogénéité moins homogènes comme «clones résistants» sont utilisés pour faciliter la dissection génétique analyse plus précise des conducteurs potentiels. E plusminerai, excitante, en plus de la possibilité de découvrir les mécanismes de résistance, cette méthode peut également être appliquée pour identifier les mécanismes cellulaires de l'action et des cibles de petites molécules bioactives pour lesquelles cette information est inconnue 10. Compte tenu des avantages clairs et les multiples usages de cette approche, nous présentons ici un protocole détaillant la mise en œuvre réussie d'un tel écran préclinique pour maximiser le potentiel de découvertes cliniquement significatives.
Sélection de la ligne (s) de cellules: Caractérisation de l'état génétique et l'instabilité génomique
Sans aucun doute, le facteur le plus critique dans la découverte de succès cliniquement pertinents les mécanismes de résistance est la sélection initiale de la lignée cellulaire. Deux facteurs doivent être considérés. Tout d'abord, viser à sélectionner la ligne (s) de la cellule de la même lignée / sous-type hébergeant les caractéristiques génétiques définissant de la maladie (par exemple., BRAF V600E dans le mélanome). Interrogation des données transcriptomiques et de mutation publiquement disponibles pour les deux lignées cellulaires et les tumeurs primaires 30-32 / métastases pour une variété d'indications 33,34 facilitera le processus de sélection. Bien que l'identification de lignées cellulaires avec des altérations génétiques cliniquement pertinentes est idéal, dans certains cas, cela peut ne pas être possible en raison du manque de lignées cellulaires disponibles ou faisable en raison de facteurs tels que la difficulté et la longueur du processus de sélection.
<p class="jove_content"> En ce qui concerne le point mentionné ci-dessus, un deuxième facteur à considérer, puis lors de la sélection de la lignée cellulaire est la facilité ou de la faisabilité de la résistance criblage en utilisant la ligne souhaitée. Par exemple, des facteurs tels que la prolifération et les taux de mutation intrinsèques peuvent influer grandement sur la vitesse de la découverte. A cet effet, des lignées cellulaires peuvent être utilisés avec une cinétique de croissance plus rapides et déficient dans les mécanismes ADN MMR dans l'espoir que émergence de la résistance spontanée peut être accélérée 35. Sur la base de la base de données cosmique, plusieurs lignées de cellules de candidat existent avec déficience en l'une des deux gènes MMR fréquemment mutés, MLH1 ou MSH2 (tableaux 2 et 3). Alternativement, si les lignées cellulaires d'intérêt ne existent pas défauts de roulement du TMM, le traitement aigu avec mutagènes chimiques physiques ou de l'ADN réactifs tels que l'agent alkylant N -nitrosourea de la N (FRA) peut être utilisé pour améliorer l'instabilité génomique. Bien que les deux approches peuvent significativement SHorten le temps pour atteindre clones résistants et de suivi séquençage, tests fonctionnels stricte devrait être effectuée sur des gènes candidats comme un plus grand nombre de non-fonctionnelle, les mutations de passagers sont susceptibles d'émerger. SNVs peut être rang ordonné de maximiser les chances d'identifier des mutations fonctionnellement pertinents. Tout d'abord, le choix de ces mutations qui sont récurrents dans les clones indépendants augmentera la probabilité de ces mutations sont des conducteurs de résistance. Dans le cas des mutations récurrentes ne sont pas identifiés, en se concentrant sur SNVs qui correspondent le mécanisme d'action du médicament (par exemple, la cible de médicament ou d'un effecteur en aval connu de la cible de la drogue) peuvent être significatifs. En fin de compte, l'étalon-or est toujours une évaluation expérimentale de l'activité conférant une résistance à des SNVs candidats par l'expression de l'ADNc ectopique dans les cellules parentales sensibles aux médicaments.Le séquençage de l'ADN vs ARN
Une fois que les clones résistants ont été générés, l'ADN et / ou ARNpeuvent être séquencées selon le besoin. Séquençage de l'ADN, soit exome ou le séquençage du génome entier, permettra d'identifier les lignées germinales et somatiques variantes, comme SNP, indels et copier nombre des variantes. Alors que le plus séquençage de l'exome coût-friendly se concentre sur génératrice lit à partir de régions codantes connues, le séquençage du génome entier va générer des données de séquençage de la totalité du génome qui peut faciliter l'identification de mutations dans les éléments non-codants tels que des amplificateurs ou des miARN 36. Cependant, étant donné que les données d'expression génique est mesuré pendant pas séquençage de l'ADN, il est difficile de prédire quels mutation (s) est susceptible d'être un conducteur fonctionnel. À cet égard, le séquençage de l'ARN, bien que plus coûteux, offre cet avantage. Le fait que la mutation appel est effectuée uniquement sur les espèces d'ARN exprimées augmente la probabilité que la mutation d'intérêt peut être un moteur fonctionnel. En plus de permettre une enquête plus ciblée des mutations pour le test fonctionnel suivi, le séquençage de l'ARN aussiprésente l'avantage supplémentaire d'être en mesure d'identifier les altérations des gènes d'expression, l'épissage alternatif et de nouvelles espèces d'ARN chimères, y compris des fusions de gènes qui peuvent également servir en tant que conducteurs puissants de la résistance.
Pipeline bioinformatique
Des exemples de commandes sont fournis à titre d'illustration, mais une documentation plus détaillée et des tutoriels sont disponibles sur le Broad Institute 16 et doivent être lus attentivement avant de commencer l'analyse des NGS. Les commandes suivantes sont conçues pour un environnement de shell UNIX sur un système sur lequel tous les outils et les données de référence ont été pré-installé. Ces commandes supposent également jumelé contenant la séquence de fin fichiers FASTQ lit à partir de deux échantillons, nommé "parentale" et "résistante", ont été reçus par le vendeur et placé dans le répertoire "data". Dans la plupart des cas, ces commandes devraient être adaptés ou optimisés pour une application spécifique à l'aide supplémentaire arg ligne de commandements (par exemple, en ajoutant "-t 8" à la commande BWA permet un fonctionnement multithread sur 8 cœurs de processeur). Lisez les groupes (qui attribuent alignements à des échantillons biologiques), doivent souvent être ajoutés à des fichiers BAM même si il ya un seul échantillon par fichier bam, afin de se conformer aux exigences en matière de format de fichier pour certains outils. Lire groupe paramètres RGID, RGSM, RGPL, RGPU et GLRB peut être des chaînes, décrivant le nom de l'échantillon, la plate-forme de séquençage, et la stratégie de la bibliothèque.
In vitro contre des dosages in vivo
Bien que plusieurs mécanismes de résistance identifiés par sélection in vitro ont été vérifiés comme cliniquement pertinents, il existe une possibilité que les mécanismes ne peuvent pas servir de mécanismes pertinents ou prédominantes de résistance clinique. Une raison à cela peut inclure un rôle essentiel pour le micro-environnement de la résistance à la thérapie de conduite, un élément qui est dépourvu dans le protocole expérimental / setup discussed jusqu'ici. En effet, plusieurs études ont montré que les agents anti-cancéreux qui sont capables de tuer les cellules tumorales sont rendues inefficaces lorsque les cellules tumorales sont mises en culture en présence de cellules stromales qui impliquent des mécanismes innés de résistance conféré par le stroma 37,38. Pour identifier ces mécanismes de résistance acquis stroma-induite, on peut envisager d'effectuer la co-culture in vitro ou in vivo, des essais de résistance de la tumeur. Depuis l'ancien dosage est assez complexe, beaucoup ont recours à générer des xénogreffes de tumeurs résistantes aux médicaments pour traiter le rôle potentiel du stroma en résistance à l'avancement. Ces études ont permis de découvrir deux identiques 5 et 39 uniques mécanismes de résistance par rapport à la sélection in vitro, ce qui implique que le stroma peut en effet jouer un rôle dans cette dernière. Cependant, il faut être conscient de la longueur de temps cela peut prendre pour générer de telles tumeurs résistantes et la complexité du suivi génomique analyse-complexities en raison de l'hétérogénéité cellulaire et moléculaire intra-tumorale.
Identification de la cible
En plus de découvrir les mécanismes de résistance aux médicaments, cette approche de profilage génomique base-NGS peut également être appliquée pour identifier les cibles cellulaires de sondes chimiques. Historiquement, plusieurs méthodes impartiales ont été utilisées pour identifier les mécanismes cellulaires de l'action et des cibles de faible poids moléculaire produits chimiques ayant des activités biologiques, y compris la purification d'affinité couplée à la protéomique quantitative, levure méthodes génomiques, le dépistage ARNi, et l'inférence de calcul approches 40. Dans le prolongement de l'élucidation des mécanismes de résistance aux médicaments en utilisant le profilage génomique ou transcriptomique base-NGS des populations de cellules phénotypiquement résistantes, l'identification des variations uniques récurrentes nucléotidiques simples (SNVs) ou des modifications d'expression qui permettent la résistance peut offrir un aperçu des cibles cellulaires fonctionnelles de composés. Tson est basé sur l'idée qu'un sous-ensemble des mécanismes de résistance observés peut impliquer mutations récurrentes dans les gènes qui codent pour les protéines cibles directes de la petite molécule. Récemment, plusieurs rapports ont validé l'utilité de l'approche, en particulier en se combinant avec d'autres approches, y compris à grande échelle lignée cellulaire de cancer sensibilité profilage, de révéler les cibles cellulaires de petites molécules sondes 9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |