A resistência aos medicamentos para a terapêutica visados é generalizada e à necessidade de identificar mecanismos de resistência – antes ou após o início clínico – é fundamental para orientar estratégias de gestão de clínicas alternativas. Aqui, apresentamos um protocolo para casal derivação de linhas resistentes a drogas in vitro com sequenciamento para agilizar a descoberta desses mecanismos.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Caracterização molecular detalhada de genomas de tumor por tecnologias de sequenciação e robustas ferramentas analíticas melhorada dados levou à descoberta de alterações genéticas importantes em tipos específicos de cancro 1,2. Desenvolvimento de terapias específicas destinadas a essas alterações genéticas, como HER2, BCR-ABL, EGFR e ALK, melhoraram significativamente a qualidade de vida dos pacientes 1,2. No entanto, apesar da especificidade desta abordagem, a resposta clínica para a maioria das terapias individuais tem sido sub-óptima em última análise, como a resistência emerge. Recentemente, progressos significativos foram feitos na compreensão das bases moleculares de resistência à terapêutica alvejados. Curiosamente, torna-se evidente que um mecanismo importante de resistência envolve a atividade de destino / caminho persistente. Como um caso em apreço, receptor de andrógeno (AR) -directed tratamento enzalutamida de câncer de próstata leva ao enriquecimento de mutações ativadoras em si AR, mantendo outp de sinalização ARut na presença de inibidor a 3-5. Este conhecimento tem conduzido a uma campanha agressiva para 1) desenvolver antagonistas da terceira geração que pode continuar a suprimir tanto a WT e função mutante-AR em enzalutamida resistente CaP 3 e 2) identificar potenciais gânglios a jusante de sinalização de AR que pode ser alvo de intervenção terapêutica . Da mesma forma, a resistência a outras classes de inibidores tais como aquelas voltadas para EGFR, BRAF e ABL muitas vezes levar a mutações que reativam a quinase via viciante original é 1.
Com o conhecimento de que a resistência surge inevitavelmente na maioria dos pacientes, desenvolvendo abordagens para rapidamente trazer esses mecanismos à luz permitirá o desenvolvimento de terapias de acompanhamento eficazes. Uma abordagem que está sendo amplamente utilizado é o de analisar a genômica dos tumores refratários clínicos em relação aos tumores sem tratamento prévio ou sensível a para identificar enriquecimentos / depleções em lesões genéticas que podem ser passíveis de ddescoberta tapete. Apesar de sua promessa, existem duas principais passivos dessa abordagem que dificultam a descoberta rápida. Em primeiro lugar, ganhando acesso oportuno a material de tumor para interrogatório genômica pode servir como um obstáculo significativo na mudança de terapia para curar. Em segundo lugar, desconvolução da miríade de lesões genéticas na configuração resistente pode ser um desafio uma vez que os tumores podem apresentar heterogeneidade intratumoral significativa 6,7.
À luz destes desafios, tem havido um aumento da confiança na descoberta pré-clínica de mecanismos de resistência. Esta abordagem pode permitir a identificação de mecanismos de resistência proeminentes antes dos ensaios clínicos 1 que podem nortear estratégias alternativas de gestão clínica naqueles pacientes que carregam esses mecanismos, quer antes ou após o início da terapia de resistência.
Uma dessas ferramentas descoberta pré-clínica que está sendo amplamente utilizado é aplicar imparciais telas de RNAi funcionais. Para o exameple, Whittaker e colegas aplicaram uma tela de RNAi genoma escala para identificar que a perda de NF1 medeia a resistência aos inibidores da RAF e MEK através MAPK sustentada ativação da via 8. Estes resultados foram encontrados como sendo clinicamente relevante, como a perda de função mutações em NF1 foram observados em células tumorais BRAF -mutant que são intrinsecamente resistentes à inibição da RAF e em tumores de melanoma resistentes à activação Vemurafenibe 8. No entanto, apesar do sucesso desta abordagem, muitos alvos clinicamente relevantes são frequentemente não identificada, presumivelmente devido à polarização por perda de função desta abordagem.
Em contraste, uma ferramenta para a descoberta de menos parcial pré-clínico de mecanismos de resistência envolve a geração de linhas celulares resistentes após exposição prolongada ao composto de interesse juntamente com perfis genómico ou transcriptómica baseado no NGS. Esta abordagem tem sido implementada com sucesso por vários grupos para identificar espontâneavariantes de nucleótidos únicos ou recorrentes alterações de expressão que permitem a resistência 5,9,10. Por exemplo, uma mutação F876L recorrente em AR foi recentemente descoberto em clones resistentes in vitro 3-5 e em tumores de xenoenxerto in vivo 5 antes da identificação desta mutação na clínica 4. Muito recentemente, Bangue e colegas (2015) 11 utilizado ClonTracer em dois modelos clinicamente relevantes para mostrar que a maioria dos clones resistentes que surgem durante a exposição prolongada do fármaco fizessem parte de uma sub-população pré-existente que sugere que a maior parte funcionalmente relevantes mutações já são susceptíveis pré-existente que se tornam selecionado para durante a seleção de 11.
Em contraste com o perfil genômico de tumores discutido anteriormente, esta abordagem benefícios de menor heterogeneidade como clones resistentes "homogéneos" são usados para facilitar a análise de dissecção genética mais precisa do potencial de condutores. Furthermminério, excitante, para além do potencial de revelar os mecanismos de resistência, este método pode também ser aplicado para identificar os mecanismos celulares de acção e alvos de pequenas moléculas bioactivas para o qual essa informação é desconhecido 10. Dadas as vantagens claras e os múltiplos usos desta abordagem, aqui apresentamos um protocolo detalhando a implementação bem sucedida de uma tela de tais pré-clínico para maximizar o potencial para descobertas clinicamente significativas.
Seleção de linha (s) celular: Caracterização do estado genético e instabilidade genômica
Sem dúvida, o factor mais importante na descoberta de mecanismos de resistência com sucesso clinicamente relevantes é a seleção inicial da linha celular. Dois factores devem ser considerados. Em primeiro lugar, o objectivo de seleccionar a linha de células (s) da mesma linhagem / subtipo abrigar os traços genéticos que definem a doença (por exemplo., BRAF V600E em melanoma). Interrogatório de dados transcriptomic e mutação publicamente disponíveis para ambas as linhas de células 30-32 e tumores primários / metástase para uma variedade de indicações 33,34 facilitará o processo de seleção. Embora a identificação de linhas celulares com alterações genéticas clinicamente relevantes é ideal, em alguns casos, isto pode não ser possível devido à falta de linhas celulares disponíveis ou viável devido a factores tais como a dificuldade e duração do processo de triagem.
<p class="jove_content"> Com relação ao ponto acima mencionado, um segundo fator a considerar, em seguida, durante a seleção de linha celular é a facilidade ou viabilidade de resistência rastreio utilizando a linha desejada. Por exemplo, factores tais como a proliferação e taxas de mutação intrínsecas podem ter grande impacto na velocidade de descoberta. Para esse efeito, as linhas celulares podem ser utilizadas com uma cinética de crescimento mais rápidas e deficiente em mecanismos de ADN MMR na esperança de que o surgimento de resistência espontânea pode ser acelerada 35. Com base no banco de dados cósmicos, várias linhas celulares candidatas existir com deficiência de um dos dois genes MMR frequentemente mutados MSH2, MLH1 ou (Tabelas 2 e 3). Alternativamente, se as linhas celulares de interesse, não existem defeitos de rolamento na MMR, o tratamento agudo com mutagénios químicos ou físicos ADN reactivo, tal como o agente de alquilação N-etil-N -nitrosourea (ENU) pode ser usado para aumentar a instabilidade do genoma. Apesar de ambas as abordagens podem significativamente de sHorten o tempo para atingir os clones resistentes e seguimento de sequenciação, ensaio funcional rigorosas deve ser realizada em genes candidatos como um maior número de não-funcional, mutações de passageiros é provável que surjam. SNVS pode ser posto ordenou para maximizar as chances de identificação de mutações funcionalmente relevantes. Em primeiro lugar, escolha dessas mutações que são recorrentes em clones independentes vai aumentar a probabilidade de estas mutações são drivers de resistência. No caso mutações recorrentes não são identificados, concentrando-se em SNVS que se encaixam no mecanismo de acção do fármaco (por exemplo, o alvo da droga ou um efector a jusante do conhecido fármaco alvo) pode ser significativa. Em última análise, o padrão-ouro é sempre a avaliação experimental da atividade de resistência concessão dos SNVS candidatos por expressão cDNA ectópica em células parentais sensíveis à droga.DNA vs RNA seqüenciamento
Uma vez que os clones resistentes foram gerados, ADN e / ou ARNpode ser sequenciado de acordo com a necessidade. A sequenciação de ADN, quer exome ou todo o seqüenciamento do genoma, permitirá a identificação de germinativas e somáticas variantes, tais como SNPs, indels e número do exemplar variantes. Considerando que o mais exome seqüenciamento custo-friendly centra-se na geração lê a partir de regiões codificantes conhecidos, todo o seqüenciamento do genoma irá gerar dados de seqüenciamento de todo o genoma que possam facilitar a identificação de mutações em elementos não-codificantes, como potenciadores ou miRNAs 36. No entanto, uma vez que a expressão do gene de dados não é calibrada durante a sequenciação de ADN, é difícil prever qual a mutação (ões) é provável que seja um condutor funcional. A este respeito, a sequenciação de ARN, ainda mais dispendiosos, oferece esta vantagem. O facto de que a mutação de chamada é realizada apenas em espécies de ARN expressas aumenta a probabilidade de que a mutação de interesse pode ser um condutor funcional. Além de permitir uma pesquisa mais focada de mutações para testes funcionais de seguimento, RNA sequenciamento tambémoferece a vantagem adicional de ser capaz de identificar alterações no gene expressão, splicing alternativo e novas espécies de RNA quiméricos, incluindo fusões de genes que podem também servir como motoristas potentes de resistência.
Pipeline de Bioinformática
Comandos de exemplo são fornecidos para fins de ilustração, mas uma documentação mais detalhada e tutoriais estão disponíveis a partir do Broad Institute 16 e devem ser lidas cuidadosamente antes de começar a análise NGS. Os comandos a seguir são projetados para um ambiente UNIX shell em um sistema no qual todas as ferramentas e dados de referência ter sido pré-instalado. Estes comandos também assumir FASTQ arquivos contendo seqüência emparelhados-end lê a partir de duas amostras, com o nome "parental" e "resistentes", foram recebidas do fornecedor e colocado no diretório "data". Na maioria dos casos, esses comandos devem ser adaptadas ou optimizados para uma aplicação específica usando arg de linha de comando adicionaldo- (por exemplo, acrescentando "-t 8" para o comando BWA permite o funcionamento de vários segmentos por 8 núcleos de CPU). Grupos de leitura (que atribuem alinhamentos de amostras biológicas), muitas vezes deve ser adicionado a arquivos BAM, mesmo se houver apenas uma amostra por arquivo bam, a fim de cumprir com os requisitos de formato de arquivo para certas ferramentas. Leia parâmetros do grupo RGID, RGSM, RGPL, RGPU, e RGLB podem ser strings arbitrárias descrevendo o nome da amostra, plataforma de sequenciamento e estratégia biblioteca.
In vitro vs ensaios in vivo
Apesar de vários mecanismos de resistência identificados por seleção in vitro foram verificados para ser clinicamente relevante, existe uma possibilidade de que os mecanismos não podem servir como mecanismos relevantes ou predominantes de resistência clínica. Uma razão para isto pode incluir um papel essencial para o micro-ambiente na condução resistência à terapia, um componente que é desprovida no protocolo experimental / d configuraçãoiscussed até agora. De facto, vários estudos têm demonstrado que os agentes anti-cancro que são capazes de matar células tumorais são alteráveis quando as células tumorais são cultivadas na presença de células estromais que implica mecanismos inatos de resistência conferida pelo estroma 37,38. Para identificar esses mecanismos de resistência adquirida induzida pelo estroma, pode-se considerar a realização in vitro de co-cultura ou em ensaios de resistência do tumor in vivo. Uma vez que o ensaio anterior é bastante complexo, muitos têm recorrido a geração de xenoenxertos de tumores resistentes aos medicamentos para tratar o papel potencial do estroma na resistência ao avanço. Tais estudos revelaram ambos os únicos 5 e 39 idênticas mecanismos de resistência relativa à selecção in vitro, o que implica que o estroma podem de facto, desempenhar um papel no último. No entanto, é preciso estar atento ao período de tempo que pode demorar para gerar tais tumores resistentes e da complexidade do acompanhamento genômica análise complexitie-s por causa da heterogeneidade molecular e celular intra-tumoral.
A identificação do alvo
Além de revelar os mecanismos de resistência a drogas, esta abordagem baseia-perfilamento genómico NGS também pode ser aplicado para identificar alvos celulares de sondas químicas. Historicamente, vários métodos imparciais têm sido usados para identificar os mecanismos celulares de ação e metas de produtos químicos de baixo peso molecular com atividades biológicas, incluindo a purificação por afinidade, juntamente com a proteômica quantitativa, métodos genómicas de levedura, triagem RNAi, e inferência computacional abordagens 40. Como uma extensão para a elucidação dos mecanismos de resistência a drogas usando perfil genômico ou transcriptomic baseado em NGS de populações de células fenotipicamente resistentes, identificação de variações exclusivas recorrentes de nucleotídeo único (SNVS) ou alterações de expressão que permitem resistência pode oferecer insights sobre alvos celulares funcionais dos compostos. To baseia-se na ideia de que um subconjunto de mecanismos de resistência observado pode envolver mutações recorrentes em genes que codificam as proteínas alvos directos da molécula pequena. Recentemente, vários relatórios validou a utilidade da abordagem, particularmente através da combinação com outras abordagens, incluindo em grande escala de células de cancro A linha de perfil de sensibilidade, para revelar os alvos celulares de pequena molécula sonda 9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |