Resistens til målrettede lægemidler er udbredt, og behovet for at identificere resistensmekanismer – før eller efter kliniske udbrud – er afgørende for at lede alternative strategier kliniske ledelse. Her præsenterer vi en protokol til par afledning af resistente linier i vitro med sekventering at fremskynde opdagelsen af disse mekanismer.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Detaljeret molekylær karakterisering af tumor genomer ved robuste sekventering teknologier og forbedrede data analytiske værktøjer har ført til opdagelsen af vigtige genetiske ændringer i bestemte kræfttyper 1,2. Udvikling af målrettede behandlinger rettet mod disse genetiske læsioner, såsom HER2, BCR-ABL, EGFR og ALK, markant har forbedret livskvalitet for patienterne 1,2. Men på trods specificitet denne tilgang, har den kliniske respons på de fleste enlige terapier været under det optimale som modstand i sidste ende opstår. For nylig er der gjort betydelige fremskridt i forståelsen af de molekylære fundament for resistens over for målrettede lægemidler. Interessant nok er det blevet klart, at en fremtrædende resistensmekanisme indebærer vedvarende target / pathway aktivitet. Som et eksempel herpå, androgen receptor (AR) -dirigerede enzalutamide behandling af prostatacancer fører til berigelse af aktiverende mutationer i AR selv, vedligeholdelse AR-signalering output i nærvær af inhibitoren 3-5. Denne viden har ført til en aggressiv kampagne for at 1) at udvikle tredje generation antagonister, der kan fortsætte med at undertrykke både WT og mutant-AR funktion i enzalutamide-resistent PCa 3 og 2) identificere potentielle downstream knudepunkter i AR-signalering, der kan målrettet til terapeutisk intervention . Tilsvarende modstand mod andre klasser af inhibitorer såsom dem rettet EGFR, BRAF og ABL ofte føre til mutationer, der genaktivere den oprindelige addicting kinasebanen 1.
Med den viden, at modstanden uundgåeligt opstår i de fleste patienter, at udvikle tilgange hurtigt bringe disse mekanismer for lys vil tillade udviklingen af effektive opfølgende behandlinger. Én metode, der bliver udbredt er at analysere genomforskning af kliniske ildfaste tumorer i forhold til behandlingsrelaterede naive eller -følsom tumorer at identificere berigelser / udtynding i genetiske læsioner, der kan være modtagelige for dtæppe opdagelse. På trods af sit løfte, er der to vigtige forpligtelser denne tilgang, der hæmmer hurtig opdagelse. For det første kan få rettidig adgang til tumor materiale til genomisk forhør tjene som en væsentlig forhindring i at flytte fra terapi til at helbrede. For det andet kan deconvolution af det utal af genetiske læsioner i den resistente indstillingen være udfordrende, da tumorer kan præsentere en betydelig intratumoral heterogenitet 6,7.
I lyset af disse udfordringer, har der været øget afhængighed af præklinisk opdagelse af resistensmekanismer. Denne fremgangsmåde kan tillade identifikation af prominente resistensmekanismer forud for de kliniske forsøg 1, som kan vejlede alternative strategier klinisk ledelse hos de patienter, der bærer disse mekanismer enten før behandling eller efter indtræden af resistens.
Et sådant prækliniske opdagelse værktøj, der bliver udbredt er at anvende upartiske funktionelle RNAi skærme. Til eksamenpel, anvendt Whittaker og kolleger et genom-skala RNAi skærmen for at identificere, at NF1 tab medierer resistens over for RAF og MEK-inhibitorer gennem vedvarende MAPK-aktivering 8. Disse resultater blev fundet for at være klinisk relevant, da tab af funktion mutationer i NF1 blev observeret i BRAF -mutant tumorceller, der er uløseligt resistente over for RAF hæmning og i melanomtumorer resistente over for vemurafenib aktivering 8. På trods af succesen af denne tilgang, mange klinisk relevante mål er ofte ikke identificeres, formodentlig på grund af tabet af funktion forspænding af denne fremgangsmåde.
I modsætning mindre forudindtaget værktøj til præklinisk opdagelse af resistensmekanismer, involverer dannelse af resistente cellelinier ved længerevarende eksponering for forbindelsen af interesse sammen med NGS-baserede genomisk eller transkriptomisk profilering. Denne tilgang er blevet succesfuldt implementeret af flere grupper for at identificere spontantilbagevendende enkelt nukleotid varianter eller ekspressionsvektorer ændringer, der muliggør resistens 5,9,10. For eksempel blev et tilbagevendende F876L mutation i AR nylig opdaget hos resistente kloner in vitro 3-5 og xenograft-tumorer in vivo 5 forud for identifikation af denne mutation i klinikken 4. For ganske nylig, Bhang og kolleger (2015) 11 brugte ClonTracer i to klinisk relevante modeller til at vise, at størstedelen af resistente kloner, der opstår ved langvarig stof eksponering var en del af en allerede eksisterende delpopulation tyder på, at mest funktionelt relevante mutationer er sandsynligvis allerede eksisterende der bliver udvalgt til under selektion 11.
I modsætning til den genomiske profilering af tumorer diskuteret tidligere, er denne fremgangsmåde fordelene ved mindre heterogenitet som "homogene" resistente kloner anvendes til analyse lette mere nøjagtig genetisk dissektion af potentielle chauffører. Furthermmalm, spændende, ud over mulighederne for at afdække resistensmekanismer, denne metode kan også anvendes til at identificere de cellulære virkningsmekanismer og mål af bioaktive små molekyler, som denne information er ukendt 10. I betragtning af de klare fordele og de mange anvendelser af denne fremgangsmåde, her præsenterer vi en protokol beskriver vellykket implementering af en sådan prækliniske skærm for at maksimere potentialet for klinisk betydningsfulde opdagelser.
Udvælgelse af cellelinje (r): Karakterisering af genetiske tilstand og genomisk ustabilitet
Utvivlsomt, den mest kritiske faktor i en vellykket afdække klinisk relevante resistensmekanismer er den første udvælgelse cellelinje. To faktorer bør overvejes. Først til formål at markere cellelinje (e) i samme afstamning / undertype huser de definerende genetiske træk af sygdommen (f.eks., BRAF V600E i melanom). Forhør af offentligt tilgængelige transkriptom og mutation data for begge cellelinier 30-32 og primær / metastase tumorer for en række indikationer 33,34 vil lette udvælgelsesprocessen. Selvom identifikation af cellelinier med klinisk relevante genetiske ændringer er ideel, i nogle tilfælde kan dette ikke være muligt på grund af mangel på tilgængelige cellelinjer eller muligt på grund af faktorer såsom vanskeligheder og længden af screeningsprocessen.
<p class="jove_content"> Med hensyn til den førnævnte punkt, at en anden faktor at overveje derefter under selektion cellelinie er den lethed eller gennemførligheden af resistens screening ved hjælp den ønskede linie. For eksempel kan faktorer såsom spredning og iboende mutationsrater høj grad indflydelse på hastigheden af opdagelse. Til dette formål kan cellelinjer udnyttes med hurtigere vækst kinetik og mangelfuld i DNA MMR mekanismerne i håb om at fremkomsten af spontan modstand kan fremskyndes 35. Baseret på COSMIC database, der findes flere kandidat-cellelinier med mangler i en af to hyppigt muterede MMR-gener, MSH2 eller MLH1 (tabel 2 og 3). Alternativt, hvis cellelinier af interesse ikke findes forsynet defekter i MMR, akut behandling med fysiske eller DNA reaktive kemiske mutagener såsom alkyleringsmidlet N-ethyl-N -nitrosourea (ENU) kan anvendes til at øge genomisk ustabilitet. Selv om begge metoder kan betydeligt findesHorten tid til at nå resistente kloner og opfølgning sekventering, bør strenge funktionel test udføres på kandidatgener som et større antal ikke-funktionelt, vil sandsynligvis dukke passager mutationer. SNVs kan være rang beordret til at maksimere chancerne for at identificere funktionelt relevante mutationer. For det første, at vælge disse mutationer, der er tilbagevendende i uafhængige kloner vil øge sandsynligheden disse mutationer er førere af resistens. I tilfælde tilbagevendende mutationer er ikke identificeret, fokuserer på SNVs der passer virkningsmekanismen af lægemidlet (f.eks målet lægemiddel eller en kendt nedstrømseffektor af målet lægemiddel) kan være meningsfuld. I sidste ende, guldstandarden er altid eksperimenterende evaluering af resistens-aktivitet kandidatlandene SNVs ved ektopisk cDNA udtryk i narkotikarelaterede følsomme parentale celler.DNA vs RNA-sekventering
Når de resistente kloner er blevet frembragt, DNA og / eller RNAkan sekventeres afhængigt af behovet. DNA-sekventering, enten exome eller hel-genom sekventering, vil gøre det muligt at identificere germline og somatiske varianter, såsom SNP'er, indels og eksemplarnummer varianter. Hvorimod mere omkostningseffektiv venlige exome sekventering fokuserer på generering læser fra kendte kodende regioner, vil hel-genom sekventering generere sekventering data for hele genomet, som kan bidrage til at identificere mutationer i ikke-kodende elementer, såsom forstærkere eller miRNA 36. Men da genekspression data ikke måles under DNA-sekventering, er det vanskeligt at forudsige, hvilken mutation (s) vil sandsynligvis være en funktionel driver. I denne henseende sekventering af RNA, men dyrere, tilbyder denne fordel. Den omstændighed, at mutation kald kun udføres på udtrykte RNA-arter øger sandsynligheden for, at mutationen af interesse kan være en funktionel driver. Ud over at tillade en mere fokuseret undersøgelse af mutationer for opfølgning funktionel test, RNA-sekventering ogsågiver den fordel at kunne identificere genekspression ombygninger, alternativ splejsning og nye kimære RNA arter, herunder genfusioner, der også kan tjene som potente førere af resistens.
Bioinformatik rørledning
Eksempel kommandoer leveres til illustration formål, men mere detaljeret dokumentation og tutorials er tilgængelige fra de overordnede Institut 16 og bør læses grundigt, før du begynder NGS analyse. Følgende kommandoer er designet til en UNIX shell miljø på et system, hvor alle værktøjer og referencedata er pre-installeret. Disse kommandoer også antage FASTQ filer indeholder parret ende sekvens læser fra to prøver, der hedder "parental" og "resistente", er modtaget fra leverandøren, og placeres i "data" mappe. I de fleste tilfælde er disse kommandoer bør tilpasses eller optimeret til en specifik anvendelse ved hjælp af ekstra kommandolinjen argmenter (fx tilføje "-t 8" til BWA kommandoen tillader flertrådede drift på 8 CPU-kerner). Læs grupper (der tildeler linjeføringer for biologiske prøver), må ofte føjes til BAM filer, selvom der kun er én prøve pr bam-fil, for at opfylde krav til visse værktøjer filformat. Læs gruppe parametre RGID, RGSM, RGPL, RGPU og RGLB kan være vilkårlige strenge beskriver prøven navn, sekventering platform og bibliotek strategi.
In vitro vs in vivo-assays
Selv om flere resistensmekanismer identificeret af in vitro-selektion er blevet verificeret til at være klinisk relevant, findes der en mulighed for, at de mekanismer, der ikke kan tjene som relevante eller fremherskende mekanismer klinisk resistens. En årsag til dette kan omfatte en væsentlig rolle for mikro-miljø i kørsel resistens over for terapi, en komponent, der er blottet i forsøgsprotokollen / opsætning discussed hidtil. Faktisk har flere undersøgelser vist, at anti-cancermidler, der er i stand til at dræbe tumorceller gøres ineffektive, når tumorcellerne dyrkes i nærværelse af stromaceller indebærer medfødte resistensmekanismer, som følger af stroma 37,38. At identificere sådanne stroma-induceret erhvervede resistensmekanismer, kan man overveje at udføre in vitro-co-kultur eller in vivo tumor modstand analyser. Da den tidligere assay er meget komplekse, har mange tyet til generering lægemiddelresistente tumorxenoplantater at løse potentielle rolle af stroma i køremodstanden. Sådanne undersøgelser har afsløret både identiske 5 og unikke 39 resistensmekanismer i forhold til in vitro-selektion, hvilket indebærer, at stroma faktisk kan spille en rolle i sidstnævnte. Dog skal man være opmærksom på, hvor lang tid det kan tage at generere sådanne resistente tumorer og kompleksiteten af opfølgningen genomisk analyse-complexities på grund af intratumoral molekylær og cellulær heterogenitet.
Target identifikation
Ud over at afdække lægemiddelresistensmekanismer, kan denne NGS-baserede genomiske profilering tilgang også anvendes til at identificere cellulære mål af kemiske prober. Historisk set har flere uvildige metoder blevet anvendt til at identificere de cellulære virkningsmekanismer og mål med lav molekylvægt kemikalier med biologiske aktiviteter, herunder affinitetsoprensning kombineret med kvantitative proteomics, gær genomiske metoder, RNAi screening, og beregningsmæssige inferens tilgange 40. Som en udvidelse til belysning af lægemiddel-resistensmekanismer hjælp NGS-baserede genomisk eller transkriptom profilering af fænotypisk resistente cellepopulationer, identifikation af unikke tilbagevendende enkelt nukleotid variationer (SNVs) eller udtryk ændringer, der muliggør modstand kan tilbyde indsigt i funktionelle cellulære mål af forbindelser. Thans er baseret på idéen om, at en delmængde af resistensmekanismer observerede kan indebære tilbagevendende mutationer i gener, der koder de direkte mål for lille molekyle protein. For nylig, flere rapporter valideret nytten af den fremgangsmåde, især ved at kombinere med andre tilgange, herunder storstilet cancercellelinje følsomhed profilering, at afsløre de cellulære mål af små-molekyle sonder 9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |