Drug motstand mot målrettede therapeutics er utbredt og behovet for å identifisere resistensmekanismer – før eller etter klinisk debut – er avgjørende for guiding alternative kliniske forvaltningsstrategier. Her presenterer vi en protokoll til par avledning av multiresistent linjer in vitro med sekvensering for å fremskynde oppdagelsen av disse mekanismene.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Detaljert molekylær karakterisering av kreft genomer av robuste sekvense teknologier og forbedret data analytiske verktøy har ført til oppdagelsen av viktige genetiske endringer i bestemte krefttyper 1,2. Utvikling av målrettet terapi rettet mot disse genetiske skader, slik som HER2, BCR-ABL, EGFR og ALK, har betydelig forbedret livskvalitet for pasientene 1,2. Men til tross for spesifisitet av denne tilnærmingen, har klinisk respons på de fleste enslige terapier vært sub-optimal som motstand til slutt fram. Nylig har betydelige fremskritt er gjort i å forstå molekylære grunnlaget for motstand til målrettede behandlingsformer. Forbløffende nok er det blitt klart at en fremtredende resistensmekanismen innebærer vedvarende mål / sti aktivitet. Som et eksempel på dette, androgen reseptor (AR) -rettet enzalutamide behandling av prostatakreft fører til anrikning av aktiverende mutasjoner i AR seg selv, opprettholde AR-signale outputca i nærvær av inhibitoren 3-5. Denne kunnskapen har ført til en aggressiv kampanje for å 1) utvikle tredje generasjons antagonister som kan fortsette å undertrykke både WT og mutant-AR-funksjonen i enzalutamide bestandig PCa 3 og 2) identifisere potensielle nedstrøms noder av AR signale som kan være målrettet for terapeutisk intervensjon . Tilsvarende motstand mot andre klasser hemmere som de rettet mot EGFR, BRAF og ABL ofte føre til mutasjoner som reaktivere opprinnelige addicting kinasereaksjonsveien en.
Med vissheten om at motstanden uunngåelig fremkommer i de fleste pasienter, utvikle tilnærminger til massedrap bringe disse mekanismene for lys vil tillate utvikling av effektive oppfølgingsbehandlinger. En tilnærming som blir mye brukt er å analysere genomikk av kliniske ildfaste svulster i forhold til behandlingsnaive eller -sensitive svulster å identifisere anrikninger / nedbryting av genetiske skader som kan være mottagelig for drug oppdagelse. Til tross for sitt løfte, er det to store forpliktelser i denne tilnærmingen som hindrer rask oppdagelse. For det første kan få rask tilgang til tumormateriale for genomisk avhør tjene som et betydelig hinder i å flytte fra terapi for å kurere. For det andre kan dekonvolvering av mylderet av genetiske lesjoner i motstandsdyktig innstillingen være utfordrende siden svulster kan presentere betydelig intra-tumor heterogenitet 6,7.
I lys av disse utfordringene, har det vært økt avhengighet av preklinisk oppdagelsen av resistensmekanismer. Denne tilnærmingen kan tillate identifisering av prominente resistensmekanismer før kliniske studier 1 som kan veilede alternative klinisk forvaltningstiltak i de pasienter som bærer disse mekanismene enten før behandling eller etter utbruddet av motstand.
En slik preklinisk oppdagelse verktøy som blir mye brukt er å bruke objektive funksjonelle RNAi skjermer. For eksamenpel Whittaker og kolleger påføres et genom-skala RNAi skjermen for å identifisere at NF1 tap formidler motstand mot RAF og MEK-hemmere gjennom vedvarende MAPK pathway aktivering 8. Disse funnene ble funnet å være klinisk relevant som tap-av-funksjon mutasjoner i NF1 ble observert i BRAF -mutant tumorceller som er egentlig motstandsdyktig mot RAF hemming og i melanom svulster resistente mot vemurafenib aktivering 8. Men til tross for suksessen med denne tilnærmingen har mange klinisk relevante mål er ofte ikke er identifisert, antagelig på grunn av tap-av-funksjon forspenningen fra denne tilnærmingen.
I motsetning til en mindre forutinntatt verktøy for prekliniske funn av resistensmekanismer innebærer generering av resistente cellelinjer ved langvarig eksponering for forbindelse av interesse kombinert med NGS-baserte genomisk eller transcriptomic profilering. Denne tilnærmingen har blitt implementert av flere grupper for å identifisere spontantilbakevendende enkle nucleotide varianter eller uttrykk endringer som gjør motstand 5,9,10. For eksempel ble en tilbakevendende F876L mutasjon i AR nylig oppdaget i resistente kloner in vitro 3-5 og i xenografttumorer in vivo 5 før identifisering av denne mutasjonen i klinikken fire. Ganske nylig, Bhang og kolleger (2015) 11 brukes ClonTracer i to klinisk relevante modeller for å vise at flertallet av resistente kloner som oppstår ved langvarig eksponering for legemidlet var en del av en pre-eksisterende undergruppe som tyder på at de fleste funksjonelt relevant mutasjoner er sannsynligvis allerede eksisterende som blir valgt for under valget 11.
I motsetning til den genomiske profilering av tumorer diskutert tidligere kan denne metoden drar nytte av mindre heterogenitet som "homogene" resistente kloner ble brukt til analysen tilrettelegge for mer nøyaktig genetisk disseksjon av potensielle drivere. Furthermmalm, spennende, i tillegg til muligheten for å avdekke resistensmekanismer, denne metoden kan også anvendes for å identifisere cellulære virkningsmekanismer og mål av bioaktive små molekyler hvor denne informasjonen er imidlertid ikke kjent 10. Gitt de klare fordeler og flere bruksområder for denne tilnærmingen, her presenterer vi en protokoll detaljering vellykket gjennomføring av en slik preklinisk skjermen for å maksimere potensialet for klinisk relevante funn.
Valg av cellelinje (r): Karakterisering av genetisk tilstand og genomiske ustabilitet
Utvilsomt den mest kritiske faktoren i vellykket avdekke klinisk relevante resistensmekanismer er den første cellen linjevalg. To faktorer bør vurderes. Først tar sikte på å velge cellelinje (r) av samme avstamning / subtype husing de definerende genetiske egenskaper av sykdommen (f.eks., BRAF V600E i melanom). Avhør av offentlig tilgjengelige transcriptomic og mutasjonsdata for begge cellelinjer 30-32 og primær / metastase svulster for en rekke indikasjoner 33,34 vil lette utvelgelsesprosessen. Selv om identifisering av cellelinjer med klinisk relevante genetiske forandringer er ideell, i noen tilfeller kan dette ikke være mulig på grunn av mangel på tilgjengelige cellelinjer eller gjennomførbart på grunn av faktorer som vanskeligheter og lengden av filtreringsprosessen.
<p class="jove_content"> Med hensyn til det nevnte punkt, til en andre faktor vurdere deretter i løpet av cellelinjevalg er den enkle eller muligheten for motstand screening ved bruk av den ønskede linje. For eksempel kan faktorer som spredning og iboende mutasjon priser stor innvirkning på hastigheten på oppdagelsen. For å oppnå dette, kan cellelinjer brukes med raskere vekstkinetikk og mangelfull i DNA MMR mekanismer i håp om at fremveksten av spontan motstand kan bli fremskyndet 35. Basert på den kosmiske database, flere kandidatcellelinjer eksisterer med mangel på en av to vanlige MMR muterte gener, MSH2 eller MLH1 (tabell 2 og 3). Alternativt, hvis cellelinjer av interesse ikke eksisterer bærer defekter i MMR, akutt behandling med DNA reaktive fysiske eller kjemiske mutagener slik som alkyleringsmiddel N-etyl-N -nitrosourea (ENU) kan brukes til å forbedre genomiske ustabilitet. Selv om begge tilnærmingene kan betydelig finneshorten tid til å oppnå resistente kloner og oppfølging sekvensering, bør strengere funksjonell testing utføres på kandidatgener som et større antall ikke-fungerende, passasjer mutasjoner er sannsynlig å dukke opp. SNVs kan være ordnet for å maksimere sjansene for å identifisere funksjonelt relevante mutasjoner. For det første, velger de mutasjoner som er tilbakevendende i uavhengige kloner vil øke sannsynligheten for disse mutasjonene er førere av motstand. Ved tilbakevendende mutasjoner ikke er identifisert, med fokus på SNVs som passer virkningsmekanismen av stoffet (for eksempel medikamentet mål eller en kjent nedstrøms effektor av stoffet target) kan være meningsfylt. Til syvende og sist, er gullstandarden alltid eksperimentell evaluering av motstand givende aktivitet av kandidat SNVs av ektopisk cDNA uttrykk for narkotika sensitive foreldre celler.DNA vs RNA sekvense
Når resistente kloner er blitt generert, DNA og / eller RNAkan bli sekvensert, avhengig av behovet. DNA-sekvensering, enten exome eller hel-genomsekvensering, vil tillate identifisering av kimlinje og somatiske varianter, for eksempel SNPs, indels og kopiere antall varianter. Mens mer kostnadsvennlig exome sekvense fokuserer på å generere lyder fra kjente kodende områder, vil hel-genomsekvense genererer sekvensdata for hele genomet som kan lette identifikasjonen av mutasjoner i ikke-kodende elementer slik som forsterkere eller mirnas 36. Men siden genekspresjon data ikke blir målt i løpet av DNA-sekvensering, er det vanskelig å forutsi hvilken mutasjon (er) er sannsynlig å være en funksjonell driver. I denne forbindelse, sekvensering av RNA, men mer kostbart, har denne fordel. Det faktum at mutasjonen ringer er bare utføres på uttrykt RNA arter øker sannsynligheten for at mutasjon av interesse kan være en funksjonell driver. I tillegg til at en mer fokusert undersøkelse av mutasjoner for oppfølging funksjonell testing, RNA sekvense ogsåhar den ekstra fordelen av å være i stand til å identifisere genekspresjon endringer, alternativ spleising og nye kimære RNA-arter, inkludert genfusjoner som også kan tjene som potente førere av motstand.
Bioinformatikk rørledning
Eksempel kommandoer er gitt for illustrasjon formål, men mer detaljert dokumentasjon og tutorials er tilgjengelige fra Broad Institute 16 og bør leses nøye før du begynner NGS analyse. Følgende kommandoer er designet for en UNIX shell miljø på et system der alle verktøy og referansedata er forhåndsinstallert. Disse kommandoene også anta FASTQ filer som inneholder parvise end sekvens leser fra to prøver, som heter "foreldre" og "bestandig", er mottatt fra leverandøren og plassert i "data" katalogen. I de fleste tilfeller er disse kommandoene skal tilpasses eller optimalisert for et bestemt program som bruker ekstra kommandolinje argmenter (for eksempel legge "-t 8" til BWA kommandoen tillater flertrådet drift over 8 prosessorkjerner). Les grupper (som tildeler justeringer til biologiske prøver), må ofte legges til BAM filer selv om det bare er en prøve per bam-fil, for å oppfylle krav filformat for visse verktøy. Les gruppe parametere RGID, RGSM, RGPL, RGPU, og RGLB kan være vilkårlige strenger som beskriver prøvenavnet, sekvense plattform og bibliotek strategi.
In vitro vs in vivo-analyser
Selv om flere resistensmekanismer som er identifisert ved in vitro valg har blitt verifisert til å være klinisk relevant, eksisterer det en mulighet for at mekanismene ikke kan tjene som relevante eller dominerende mekanismer klinisk resistens. En årsak til dette kan være en avgjørende rolle for mikro-miljøet i å drive motstand mot terapi, en komponent som er blottet i forsøksprotokollen / setup discussed hittil. Faktisk har flere studier vist at anti-kreftmidler som er i stand til å drepe tumorceller er uten virkning når tumorcellene blir dyrket i nærvær av stromale celler impliserer medfødte resistensmekanismer som er tillagt av stroma 37,38. Identifisere slike stromaceller-indusert ervervet resistensmekanismer, kan man vurdere å utføre in vitro co-kultur eller in vivo tumor motstand analyser. Siden den tidligere analysen er ganske komplisert, har mange tydd til generering av medikamentresistente tumorxenografter å adressere den potensielle rolle av stroma i kjøremotstanden. Slike studier har avdekket begge identiske 5 og unike 39 resistensmekanismer i forhold til in vitro-seleksjon, noe som tyder på at stroma kan faktisk spiller en rolle i den sistnevnte. Imidlertid må man være oppmerksom på hvor lang tid det kan ta å generere slike resistente svulster og kompleksiteten i oppfølgingen genomisk analyse-complexities på grunn av intra-tumor molekylære og celle heterogenitet.
Target identifikasjon
I tillegg til å avdekke medikamentresistensmekanismer, kan dette NGS-baserte genomisk profilering metode også anvendes for å identifisere cellulære mål av kjemiske sonder. Historisk sett har flere objektive metoder blitt brukt til å identifisere de cellulære virkningsmekanismer og mål med lav molekylvekt kjemikalier med biologiske aktiviteter, inkludert affinitetsrensing kombinert med kvantitative proteomikk, gjær genomiske metoder, RNAi screening, og beregnings slutning tilnærminger 40. Som en forlengelse til belysning av legemiddelresistensmekanismer som bruker NGS-baserte genomisk eller transcriptomic profilering av fenotypisk resistente cellepopulasjoner, identifisering av unike gjentatte enkelt nukleotidvariasjoner (SNVs) eller uttrykk endringer som gjør motstand kan tilby innsikt i funksjonelle cellulære mål av forbindelser. Thans er basert på ideen om at et delsett av resistensmekanismer som observeres kan medføre tilbakevendende mutasjoner i gener som koder for den direkte protein målene for lite molekyl. Nylig har flere rapporter validert nytten av tilnærming, spesielt ved å kombinere med andre tilnærminger inkludert store kreftcellelinje følsomhet profilering, for å avsløre den cellulære mål av små-molekyl sonder 9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |