Resistens riktade läkemedel är utbrett och behovet av att identifiera resistensmekanismer – före eller efter kliniska utbrott – är avgörande för att styra alternativa kliniska förvaltningsstrategier. Här presenterar vi ett protokoll för att koppla härledning av läkemedelsresistenta linjer in vitro med sekvensering för att påskynda upptäckten av dessa mekanismer.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Detaljerad molekylär karakterisering av tumörgenom från robust teknik sekvense och förbättrad uppgifter analysverktyg har lett till upptäckten av viktiga genetiska förändringar i specifika cancertyper 1,2. Utveckling av riktade behandlingar som syftar till dessa genetiska skador, såsom HER2, BCR-ABL, EGFR och ALK, har avsevärt förbättrat livskvaliteten för patienter 1,2. Trots den särskilda karaktären hos denna metod har det kliniska svaret på de flesta ensamstående terapier varit suboptimal som motstånd i slutändan framträder. Nyligen har betydande framsteg gjorts när det gäller att förstå de molekylära grunderna för resistens mot målsökande behandling. Intressant blir det uppenbart att en framstående resistensmekanismen involverar ihållande mål / väg-aktivitet. Som ett typexempel, androgenreceptorn (AR) -directed enzalutamide behandling av prostatacancer leder till anrikning av aktiverande mutationer i AR själva, upprätthålla AR-signalering output i närvaro av den 3-5-inhibitorn. Denna kunskap har lett till en aggressiv kampanj för att 1) utveckla tredje generationens antagonister som kan fortsätta att undertrycka både WT och mutant-AR-funktionen i enzalutamide resistenta PCa 3 och 2) identifiera potentiella nedströmsnoder för AR signalering som kan riktas för terapeutisk intervention . Likaså resistens mot andra klasser av inhibitorer, såsom de som targeting EGFR, BRAF och ABL leder ofta till mutationer som återaktivera den ursprungliga beroendeframkallande kinasvägen 1.
Med vetskapen om att motståndet framträder oundvikligen i de flesta patienter, utveckla strategier för att snabbt föra dessa mekanismer i ljuset kommer att möjliggöra utvecklingen av effektiva uppföljnings terapier. En strategi som i stor utsträckning används för att analysera genomik av kliniska eldfasta tumörer i förhållande till behandlingsnaiva eller -känsliga tumörer att identifiera anrikningar / uttömning i genetiska skador som kan vara mottagliga för dmatta upptäckt. Trots sitt löfte, det finns två stora skulder detta synsätt som försvårar snabb upptäckt. För det första kan få snabb tillgång till tumörmaterial för genomisk förhör fungera som ett betydande hinder på vägen från terapi för att bota. För det andra kan deconvolution av den myriad av genetiska skador i den resistenta inställningen vara utmanande eftersom tumörer kan presentera betydande intratumoral heterogenitet 6,7.
Mot bakgrund av dessa utmaningar har man ökat beroende av preklinisk upptäckten av resistensmekanismer. Detta tillvägagångssätt kan möjliggöra identifiering av framstående resistensmekanismer innan de kliniska prövningarna 1 som kan vägleda alternativa strategier klinisk förvaltning hos de patienter som bär dessa mekanismer antingen före behandling eller till följd av uppkomsten av resistens.
Ett sådant preklinisk upptäckt verktyg som i stor utsträckning används är att tillämpa objektiva funktionella RNAi skärmar. För examenpel, Whittaker och kollegor tillämpade en genomet skala RNAi skärmen för att identifiera att NF1 förlust förmedlar resistens mot RAF och MEK-inhibitorer via en varaktig MAPK vägsaktivering 8. Dessa fynd visade sig vara kliniskt relevant eftersom förlust-of-funktion mutationer i NF1 observerades i BRAF -mutant tumörceller som i sig är resistenta mot RAF inhibition och i melanomtumörer resistenta mot vemurafenib aktivering 8. Trots framgången med detta tillvägagångssätt, många kliniskt relevanta mål ofta inte identifieras, förmodligen på grund av förlust av funktions partiskhet av denna strategi.
I motsats till en mindre partisk verktyg för preklinisk upptäckten av resistensmekanismer innebär generering av resistenta cellinjer genom långvarig exponering för föreningen av intresse i kombination med NGS-baserade iska eller transcriptomic profilering. Denna strategi har genomförts framgångsrikt av flera grupper för att identifiera spontanaåterkommande enstaka nukleotid varianter eller uttrycks förändringar som gör motstånd 5,9,10. Till exempel var ett återkommande F876L mutation i AR nyligen upptäckt i resistenta kloner in vitro 3-5 och i xenograft-tumörer in vivo 5 före identifiering av denna mutation i kliniken 4. Helt nyligen, Bhang och kollegor (2015) 11 som används ClonTracer två kliniskt relevanta modeller för att visa att majoriteten av resistenta kloner som uppstår under långvarig drog exponering var en del av en befintlig subpopulation antyder att de flesta funktionellt relevanta mutationer är sannolikt redan befintlig som blivit vald för under val 11.
I motsats till den genomiska profilering av tumörer som diskuterats tidigare, detta tillvägagångssätt nytta av mindre heterogenitet som "homogena" resistenta kloner används för analys underlättar mer exakt genetisk dissektion av potentiella förare. Furthermmalm, spännande, förutom möjligheten att upptäcka resistensmekanismer, denna metod kan också användas för att identifiera de cellulära verkningsmekanismer och mål för bioaktiva små molekyler som denna information är okänd 10. Med tanke på de tydliga fördelar och flera användningsområden för denna strategi, här presenterar vi ett protokoll med uppgifter framgångsrikt genomförande av en sådan preklinisk skärm för att maximera potentialen för kliniskt betydelsefulla upptäckter.
Val av cellinje (r): Karakterisering av genetisk tillstånd och genomisk instabilitet
Utan tvekan, den enskilt mest kritiska faktorn för att framgångsrikt upptäcka kliniskt relevanta resistensmekanismer är den initiala cell linjeval. Två faktorer bör övervägas. Först syftar till att välja cellinje (s) av samma härstamning / subtyp hyser de definierande genetiska egenskaper av sjukdomen (t ex., BRAF V600E i melanom). Förhör av allmänt tillgängliga transcriptomic och mutationsdata för båda cellinjerna 30-32 och primär / metastasering tumörer för olika indikationer 33,34 kommer att underlätta urvalsprocessen. Även om identifiering av cellinjer med kliniskt relevanta genetiska förändringar är perfekt, i vissa fall detta inte är möjligt på grund av brist på tillgängliga cellinjer eller genomförbart på grund av faktorer såsom svårighetsgrad och längd av screeningprocessen.
<p class="jove_content"> När det gäller den ovannämnda punkten, till en andra faktor överväga sedan under cell linjeval är hur lätt eller genomförbarheten av motstånd säkerhetskontroll med den önskade linjen. Exempelvis kan faktorer såsom proliferation och inneboende mutationshastigheter kraftigt påverka hastigheten för upptäckt. För detta ändamål kan cellinjer användas med snabbare tillväxt kinetik och bristfällig i DNA MMR mekanismer i hopp om att uppkomsten av spontana motstånd kan accelereras 35. Baserat på COSMIC databasen finns flera kandidat cellinjer med brister i en av två ofta muterade MMR-gener, MSH2 eller MLH1 (Tabell 2 och 3). Alternativt, om cellinjer av intresse inte finns lagerskador i MMR, akut behandling med fysikaliska eller DNA reaktiva kemiska mutagener, som alkyleringsmedel N-etyl-N–nitrosourea (ENU) kan användas för att öka genomisk instabilitet. Även om båda metoderna kan avsevärt SHorten tid att uppnå resistenta kloner och uppföljning sekvensering, bör stränga funktionstestning utföras på kandidatgener som ett större antal icke-funktionella, passagerare mutationer kommer sannolikt att dyka upp. SNVs kan vara rangordnas för att maximera chanserna för att identifiera funktionellt relevanta mutationer. För det första, att välja de mutationer som är återkommande i oberoende kloner kommer att öka sannolikheten dessa mutationer är förare av motstånd. I händelse återkommande mutationer inte är identifierade, med fokus på SNVs som passar mekanismen för verkan av läkemedlet (t ex läkemedlets mål eller en känd nedströms effektor av läkemedelsmål) kan vara meningsfulla. Ytterst är guldmyntfoten alltid experimentell utvärdering av resistens förmedlande verksamhet kandidat SNVs av ektopisk cDNA uttryck i läkemedelskänsliga moderceller.DNA vs RNA-sekvensering
När resistenta kloner har genererats, DNA och / eller RNAkan sekvens beroende på behovet. DNA-sekvensering, antingen exome eller hel-genomsekvensering, kommer att möjliggöra identifiering av nedärvda och somatiska varianter, såsom SNP InDels och antalet exemplar varianter. Medan det mer kostnadseffektivt vänliga exome sekvense fokuserar på generering läser från kända kodande regioner, kommer hela-genomet sekvense generera sekvensdata för hela genomet som kan underlätta identifiering av mutationer i icke-kodande element såsom förstärkare eller miRNA 36. Eftersom genuttryck data inte mäts under DNA-sekvensering, är det svårt att förutsäga vilken mutation (er) kommer sannolikt att vara en funktionell förare. I detta avseende, sekvensering av RNA, även om mer kostsamma, erbjuder denna fördel. Det faktum att mutationen samtal endast utförs på uttryckta RNA-slag förhöjer sannolikheten att mutationen av intresse kan vara en funktionell drivrutin. Förutom att tillåta en mer fokuserad undersökning av mutationer för uppföljning funktionell testning, RNA-sekvensering ocksåerbjuder den extra fördelen av att kunna identifiera genuttryck förändringar, alternativ splitsning och nya chimära RNA arter, däribland genfusioner som också kan fungera som potenta förare av motstånd.
Bioinformatics rörledning
Exempel kommandon tillhandahålls för illustrationssyfte, men mer detaljerad dokumentation och handledning är tillgängliga från Broad Institute 16 och bör läsas noggrant innan NGS analys. Följande kommandon är konstruerade för en UNIX-skalmiljö på ett system där alla verktyg och referensdata har förinstallerat. Dessa kommandon utgår också FASTQ filer som innehåller parade ändsekvensen läser från två prover, som heter "föräldraansvar" och "resistent" har tagits emot från leverantören och placeras i "data" katalogen. I de flesta fall kan dessa kommandon bör anpassas eller optimerade för ett specifikt program med ytterligare kommandoraden argment (t.ex. lägga till "-t 8" till kommandot bwa tillåter flertrådade drift över 8 processorkärnor). Läs grupper (som tilldelar anpassningar till biologiska prover), ofta måste läggas till BAM-filer, även om det bara finns ett prov per bam-fil, för att uppfylla kraven filformat för vissa verktyg. Läs grupparametrarna RGID, RGSM, RGPL, RGPU och RGLB kan vara godtyckliga strängar som beskriver den kända ta prov, sekvense plattform och biblioteksstrategi.
In vitro vs in vivo-analyser
Även om flera resistensmekanismer som identifierats av in vitro-selektion har kontrollerats och befunnits vara kliniskt relevant, det finns en möjlighet att de mekanismer som inte kan tjäna som relevanta eller dominerande mekanismer för klinisk resistens. En orsak till detta kan vara en väsentlig roll för mikromiljön driva resistens mot behandling, en komponent som saknar i det experimentella protokollet / setup discussed hittills. I själva verket har flera studier visat att anti-cancermedel som kan döda tumörceller ineffektiva när tumörcellerna odlas i närvaro av stromaceller som innebär medfödda resistensmekanismer som följer av stroman 37,38. Att identifiera sådana stroma-inducerad förvärvade resistensmekanismer, kan man överväga att utföra in vitro samodling eller in vivo tumörmotstånds analyser. Sedan den förra analysen är ganska komplex, många har tillgripit generera läkemedelsresistenta tumörxenografter att ta itu med potentiella roll stroma i körmotståndet. Sådana studier har avslöjat både identiska 5 och unika 39 resistensmekanismer i förhållande till in vitro-selektion, vilket innebär att stroma faktiskt kan spela en roll i den senare. Men man måste vara uppmärksam på hur lång tid det kan ta att generera sådana resistenta tumörer och komplexiteten i uppföljningen genomanalys complexities på grund av intratumoral molekylära och cellulära heterogenitet.
Målidentifiering
Förutom att upptäcka drogresistensmekanismer, kan även tillämpas här NGS-baserade genomisk profilering metod för att identifiera cellulära mål av kemiska prober. Historiskt sett har flera objektiva metoder använts för att identifiera de cellulära verkningsmekanismer och mål med låg molekylvikt kemikalier med biologiska aktiviteter, inklusive affinitetsrening i kombination med kvantitativa proteomik, jästgenomiska metoder, RNAi screening och beräknings slutsats närmar sig 40. Som en förlängning till belysning av läkemedelsresistensmekanismer som använder NGS-baserade iska eller transcriptomic profilering av fenotypiskt resistenta cellpopulationer, identifiering av unika återkommande single nucleotide variationer (SNVs) eller uttryck förändringar som gör motstånd kan erbjuda insikter funktionella cellulära mål av föreningar. Thans bygger på tanken att en delmängd av resistensmekanismer observerade kan innebära återkommande mutationer i gener som kodar för de direkta proteinmål av den lilla molekylen. Nyligen har flera rapporter validerade nyttan av strategi, särskilt genom att kombinera med andra metoder, bland annat storskaliga cancercellinje känslighet profilering, att avslöja de cellulära mål av små molekyler sonder 9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |