Geneesmiddelresistentie voor gerichte therapeutica is wijdverbreid en de noodzaak om resistentiemechanismen te identificeren – voor of na de eerste klinische verschijnselen – is essentieel voor het geleiden alternatieve klinische strategieën. Hier presenteren we een protocol te koppelen afleiding van resistente lijnen in vitro sequentiebepaling ontdekking van deze mechanismen te bespoedigen.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Gedetailleerde moleculaire karakterisatie van tumor genomen door robuuste sequentietechnologieën en verbeterde data analytische instrumenten heeft geleid tot de ontdekking van belangrijke genetische veranderingen in bepaalde kankersoorten 1,2. Ontwikkeling van gerichte therapieën gericht op deze genetische afwijkingen, zoals HER2, BCR-ABL, EGFR en ALK zijn significant betere kwaliteit van leven voor patiënten 1,2. Ondanks de specificiteit van deze aanpak, de klinische respons op de meeste behandelingen is één sub-optimaal is als weerstand uiteindelijk ontstaat. Onlangs, heeft aanzienlijke vooruitgang geboekt in het begrijpen van de moleculaire onderbouwing van resistentie tegen doelgerichte therapieën. Intrigerend, wordt het steeds duidelijker dat een prominente mechanisme van resistentie impliceert aanhoudende doel / route activiteit. Als een voorbeeld, androgene receptor (AR) -directed enzalutamide behandeling van prostaatkanker leidt tot verrijking van activerende mutaties in AR zelf, behoud-AR signalering output in aanwezigheid van de remmer 3-5. Deze kennis heeft geleid tot een agressieve campagne om 1) derde generatie antagonisten die kunnen blijven zowel WT en mutant-AR onderdrukken in ontwikkeling enzalutamide-resistente PCa 3 en 2) het identificeren van potentiële downstream knooppunten van AR signalering die kunnen worden gericht voor therapeutische interventie . Ook voor andere klassen van remmers zoals EGFR gericht, BRAF ABL en leiden vaak tot mutaties die de oorspronkelijke verslavende kinase pathway 1 activeren.
Met de wetenschap dat verzet onvermijdelijk ontstaat bij de meeste patiënten, de ontwikkeling van benaderingen om vlot te brengen deze mechanismen aan het licht zal de ontwikkeling van effectieve follow-up therapieën mogelijk te maken. Een benadering die wordt veel gebruikt is om de genomica van klinische refractaire tumoren ten opzichte van eerder behandelde of -gevoelige tumoren verrijkingen / aan consumenten in de genetische laesies die vatbaar zijn voor d kunnen identificeren analyserentapijt ontdekking. Ondanks de belofte er twee belangrijke risico van deze benadering snelle ontdekking belemmeren. Ten eerste, het verkrijgen van tijdige toegang tot tumor materiaal voor genomische ondervraging kan als een belangrijke hindernis te dienen in het verplaatsen van therapie om te genezen. Ten tweede kan deconvolutie van de talloze genetische laesies in de resistente instelling uitdagend omdat tumoren significant intratumorale heterogeniteit 6,7 kunnen presenteren.
In het licht van deze uitdagingen is er toegenomen afhankelijkheid van preklinische ontdekking van resistentie mechanismen. Deze benadering kan gekende sterke resistentiemechanismen toelaten voordat de klinische proeven 1 dat alternatieve klinische behandeling strategieën kunnen leiden bij patiënten die deze mechanismen hetzij vóór de behandeling of na aanvang van resistentie dragen.
Een van deze preklinische discovery tool dat wordt veel gebruikt is om onpartijdige functionele RNAi screens van toepassing. Voor examenple, Whittaker en collega's toegepast een genoom-schaal RNAi scherm te identificeren dat NF1 verlies bemiddelt weerstand tegen RAF en MEK-remmers door aanhoudende MAPK route activering 8. Deze bevindingen bleken klinisch relevant als verlies-van-functie mutaties in NF1 waargenomen in BRAF -mutant tumorcellen die intrinsiek resistent RAF remming en melanoom tumoren resistent activatie 8 vemurafenib zijn. Ondanks het succes van deze benadering veel klinisch relevante doelen vaak niet geïdentificeerd, vermoedelijk als gevolg van het verlies-van-functie voorspanning van deze aanpak.
Daarentegen minder bevooroordeelde instrument voor preklinisch van resistentiemechanismen omvat de generatie van resistente cellijnen bij langdurige blootstelling aan de verbinding van belang in combinatie met NGS-gebaseerde genomische of transcriptoom profielen. Deze benadering is met succes uitgevoerd bij verschillende groepen te identificeren spontaneterugkerende single nucleotide varianten of expressie veranderingen die weerstand 5,9,10 schakelen. Zo werd een terugkerend F876L mutatie in AR onlangs ontdekt in resistente klonen in vitro 3-5 en xenograft tumoren in vivo 5 voorafgaand aan vaststelling van deze mutatie in de kliniek 4. Zeer recent Bhang en medewerkers (2015) 11 gebruikt ClonTracer twee klinisch relevante modellen die meeste resistente klonen die zich voordoen tijdens langdurige blootstelling drug maakten deel uit van een reeds bestaande subpopulatie wijst dat functioneel relevant mutaties vertonen waarschijnlijk reeds bestaand die raken geselecteerd tijdens selectie 11.
In tegenstelling tot de genomische profilering van tumoren eerder besproken, deze benadering geniet minder heterogeniteit als "homogene" resistente klonen worden gebruikt voor de analyse nauwkeuriger genetische dissectie van potentiële drijvende vergemakkelijken. Furthermerts, interessant genoeg, naast de mogelijkheid voor het blootleggen resistentiemechanismen, deze werkwijze ook worden toegepast op de cellulaire werkingsmechanismen en doelstellingen van bioactieve kleine moleculen die deze informatie bekend 10 identificeren. Gezien de duidelijke voordelen en de vele toepassingen van deze aanpak, hier presenteren we een protocol detaillering succesvolle implementatie van een dergelijke preklinische scherm om het potentieel voor klinisch belangrijke ontdekkingen te maximaliseren.
Selectie van cellijn (s): karakterisatie van genetische staat en genomische instabiliteit
Ongetwijfeld is de belangrijkste factor in het succesvol blootleggen van klinisch relevante resistentie mechanismen is de eerste cellijn selectie. Twee factoren moeten worden overwogen. Ten eerste beogen cellijn (s) van hetzelfde geslacht / subtype herbergt het bepalen van genetische kenmerken van de ziekte te selecteren (bv., BRAF V600E bij melanomen). Afvragen van publiekelijk beschikbare transcriptoom en mutatiegegevens beide cellijnen en primaire 30-32 / metastase tumoren voor verschillende indicaties 33,34 wordt de selectie te vergemakkelijken. Hoewel de identificatie van cellijnen met klinisch relevante genetische veranderingen is ideaal, in sommige gevallen kan dit niet mogelijk wegens gebrek aan beschikbare cellijnen of haalbaar door factoren zoals moeilijkheden en lengte van de screening.
<p class="jove_content"> Met betrekking tot de eerder genoemde punt, een tweede factor om overweeg dan tijdens cellijn selectie is het gemak of de haalbaarheid van verzet screenen met behulp van de gewenste lijn. Zo kunnen factoren zoals proliferatie en intrinsieke mutatie grote invloed op de snelheid van de ontdekking. Daartoe kunnen cellijnen worden gebruikt met snellere groei kinetiek en deficiënt DNA MMR mechanismen in de hoop dat ontstaan van spontane resistentie kan worden versneld 35. Op basis van de COSMIC database meerdere kandidaat cellijnen bestaan deficiëntie op twee frequent gemuteerde MMR-genen, MSH2 en MLH1 (tabellen 2 en 3). Als alternatief, als cellijnen plaats niet bestaan lagerdefecten in MMR, acute behandeling met fysische of DNA reactieve chemische mutagenen zoals N alkyleringsmiddel ethyl-N -nitrosourea (ENU) kan worden gebruikt om genomische instabiliteit verbeteren. Hoewel beide benaderingen kunnen aanzienlijk isHORTEN de tijd resistente klonen bereiken en follow-up sequencing moeten stringente functionele testen worden uitgevoerd op kandidaatgenen een groter aantal niet-functionele, passagiers mutaties aandienen. SNVs kan rang veroordeeld tot kansen te maximaliseren voor het identificeren van functioneel relevante mutaties. Ten eerste, de keuze van de mutaties die zijn terugkerende in onafhankelijke klonen wordt de kans op deze mutaties zijn bestuurders van de weerstand te verhogen. Bij recurrente mutaties niet geïdentificeerd, gericht op SNVs dat het mechanisme van werking van het geneesmiddel te passen (bijvoorbeeld de beoogde middel of een bekende stroomafwaartse effector van de drug target) kan zinvol zijn. Uiteindelijk is de gouden standaard is altijd experimentele evaluatie van resistentie-toekenning activiteit van de kandidaat SNVs door buitenbaarmoederlijke cDNA expressie in drug-gevoelige ouderlijke cellen.DNA versus RNA-sequencing
Zodra resistente klonen werden gegenereerd, DNA en / of RNAkunnen worden gesequenced afhankelijk van de behoefte. DNA-sequencing, ofwel exome of hele genoom sequencing, zal de identificatie van de kiembaan en somatische varianten, zoals SNPs, indels toestaan en kopiëren aantal varianten. Terwijl de meer kostenvriendelijke exome sequencing gericht op het genereren leest bekende coderende gebieden, zal hele genoom sequentie gegevens voor het gehele genoom die de identificatie van mutaties in niet-coderende elementen zoals versterkers of miRNAs 36 kan vergemakkelijken genereren. Aangezien genexpressiedata niet gemeten gedurende de DNA sequencing, is het moeilijk om die mutatie (s) waarschijnlijk een functioneel bestuurder voorspellen. In dit opzicht sequentie van RNA, hoewel duurder, biedt dit voordeel. Dat mutatie calling alleen uitgevoerd op expressie gebracht RNA species verhoogt de waarschijnlijkheid dat de mutatie van belang een functioneel bestuurder zijn. Naast het feit dat een meer gerichte onderzoek van mutaties voor opvolging functionele testen, RNA sequencing ookEen voordeel van de mogelijkheid om genexpressie wijzigingen, alternatieve splicing en nieuwe chimere RNA soorten, waaronder genfusies die ook kunnen fungeren als krachtige drijvende resistentieproteïnen.
Bioinformatica pijplijn
Bijvoorbeeld opdrachten worden verstrekt ter illustratie, maar meer gedetailleerde documentatie en handleidingen zijn verkrijgbaar bij de globale Instituut 16 en moet grondig voor het begin van NGS analyses worden gelezen. De volgende commando's zijn ontworpen voor een UNIX shell omgeving op een systeem waarop alle gereedschappen en referentiegegevens zijn vooraf geïnstalleerd. Deze opdrachten ook aannemen FASTQ bestanden met gepaarde-end reeks leest voor uit twee monsters, genaamd "ouderlijke" en "resistent" zijn ontvangen van de verkoper en geplaatst in de map "data". In de meeste gevallen moet deze commando's worden aangepast of geoptimaliseerd voor een specifieke toepassing met extra command-line argmenten (bijvoorbeeld het toevoegen van "-t 8" om de BWA commando kunt multithreaded operatie over 8 CPU cores). Lees groepen (die uitlijningen toewijzen aan biologische monsters) dienen vaak toegevoegd aan BAM bestanden, zelfs als er slechts één monster per bam bestand, om te voldoen aan de eisen bestandsformaat voor bepaalde werktuigen. Lees groep parameters RGID, RGSM, RGPL, RGPU en RGLB kan willekeurige strings beschrijft de naam monster, sequencing platform, en een bibliotheek strategie.
In vitro vs in vivo assays
Hoewel verschillende resistentiemechanismen geïdentificeerd door in vitro selectie zijn gecontroleerd klinisch relevant zijn, bestaat er een mogelijkheid dat de mechanismen niet relevant of voornaamste mechanismen van klinische resistentie kunnen dienen. Een reden hiervoor kan een essentiële rol voor de micro-omgeving rijweerstand therapie, een component die mist in de experimentele protocol / d opstelling omvattentot nu toe iscussed. Inderdaad hebben verscheidene studies aangetoond dat antikankermiddelen die in staat zijn tumorcellen te doden zijn ineffectief zijn geworden wanneer de tumorcellen worden gekweekt in aanwezigheid van stromale cellen impliceert aangeboren mechanismen van resistentie door het stroma 37,38 verleend. Om dergelijke stroma-geïnduceerde verworven resistentie mechanismen te identificeren, kan men overwegen het uitvoeren van in vitro co-cultuur of in vivo tumor weerstand testen. Aangezien de eerste assay is vrij complex, velen hun toevlucht te genereren resistente tumor xenotransplantaten op de mogelijke rol van de stroma in rijweerstand pakken. Dergelijke studies hebben ontdekt zowel identieke 5 en de unieke 39 mechanismen van resistentie ten opzichte van in vitro selectie, wat impliceert dat de stroma inderdaad een rol in deze kunnen spelen. Toch moet men rekening houden met de lengte van de tijd kan nemen om deze resistente tumoren te genereren en de complexiteit van de follow-up genomische analyse-complexitie zijns als gevolg van de intra-tumorale moleculaire en cellulaire heterogeniteit.
Target identificatie
Naast het blootleggen resistentie mechanismen, kan deze NGS gebaseerde genomische profilering benadering ook worden toegepast om cellulaire doelwitten chemische probes identificeren. Historisch gezien hebben meerdere onpartijdige werkwijzen toegepast om de cellulaire werkingsmechanismen en de doelstellingen van laagmoleculaire stoffen met biologische activiteiten, inclusief affiniteitszuivering combinatie met kwantitatieve proteomics, gist genomische werkwijzen, RNAi screening en computationele benaderingen conclusie 40 identificeren. Als een uitbreiding op opheldering van resistentie mechanismen met behulp van NGS-gebaseerde genomische of transcriptomische profilering van fenotypisch resistente celpopulaties, identificatie van unieke terugkerende single nucleotide variaties (SNVs) of expressie veranderingen die de resistentie tegen inzichten in functionele cellulaire doelwitten van verbindingen kan bieden. Tzijn gebaseerd op het idee dat een subset van resistentiemechanismen waargenomen recurrente mutaties in genen kan betekenen dat de directe targets van de kleine moleculen coderen. Onlangs heeft een aantal rapporten gevalideerd bruikbaarheid van de benadering, met name door vermenging met andere benaderingen, waaronder grootschalige kankercellijn gevoeligheid profilering, onthullend de cellulaire doelwitten van kleine moleculen sondes 9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |