Abstract
저용량 방사선 노출은 높은 방사선 량에 의해 생성 효과에서 수량과 품질이 상이한 생물학적 효과의 다양성을 생성 할 수있다. 적절한 과학적으로 정당화 방식으로, 환경 산업 및 공중 보건 안전과 관련된 질문을 해결하는 것은 크게 정확하게 방사선 및 화학 물질을 이온화 낮은 복용량 오염 물질의 생물학적 효과를 측정 할 수있는 능력에 의존한다. DNA 손상 및 수리로 인해 암과 같은 잠재적 인 장기 결과에 건강 위험의 가장 중요한 초기 지표입니다. 여기에서 우리는 마우스의 비장 세포에서 DNA 손상 수리 및 γ-와 β-방사선의 낮은 복용량에 생체 노출 만성의 효과를 연구 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. DNA 이중 가닥 나누기 일반적으로 받아 들여지는 마커를 사용하여, γH2AX라는 인산화 히스톤 H2AX, 우리는 DNA 손상뿐만 아니라 레벨을 평가하는 데 사용될 수있는 방법을 설명하지만,도 변화DNA 복구 능력에 잠재적으로 생체 내 노출의 저용량에 의해 생산. 많은 수의 샘플에 표지 immunofluorescently γH2AX의 빠르고 정확하고 신뢰성있게 측정 계측법 흐른다. DNA 이중 가닥 브레이크 수리는 (DNA 수리를 트리거 쉬는 충분한 수를 생성하기 위해 2 Gy의의 도전 량 추출 비장 세포를 노출시킴으로써 및 유도 (1 시간 조사 후) 잔류 DNA 손상을 측정함으로써, 24 시간을 평가할 수있다 사후 조사). 잔류 DNA 손상은 불완전한 복구 및 장기 게놈 불안정성과 암의 위험을 나타내는 것이다. 용이하게 생체 내 연구 (예를 들면, 염색체 수차 골수 망상 적혈구의 소핵 주파수, 유전자 발현, 등) 등으로 측정 할 수있는 다른 분석 및 종점과 결합하여,이 방법은 생물학적 효과의 정확한 상황 평가할 수있다 낮은 수준의 스트레스.
Introduction
(매스 미디어에 의해 악화) 방사선 히로시마와 나가사키 원자 폭탄의 희귀 원자력 발전소 사고의 이미지에 의해 구동 방사선 대중의 공포를, 이온화 낮거나 매우 낮은 용량 중 하나의 잠재적 인 해로운 영향에 비해 상당한 논쟁에 주도하고있다 매우 엄격한 방사선 방호 규제와 잠재적으로 과학적으로 정당하지 않은 기준. 지난 30 년에, 다수의 보고서는 유해의 부족과 낮은 선량 방사선 1-4에 의한 잠재적으로 유익한 생물 효과의 존재를 모두 기록했다. 주요 방사선 건강 위험 요인은 방사선의 높은 또는 중간 용량을 수신 원자 폭탄 생존자의 역학 연구에 기초하여 추정 암의 확률이다. (그래서 선형 노 임계 값 또는 LNT 모델 호출되지) 이러한 데이터의 선형 외삽은 낮은 용량에서 암의 위험을 추정하는 데 사용됩니다. 그러나,이 접근법은 세계적 과학 수용을받지 못한무겁게 5를 논의한다.
그것은 더 연구가이 문제를 명확히하고 아마도 방사선 보호 기준을 개선하는 데 필요한 것이 명백하다. 이러한 연구는 DNA 손상 비율, DNA 수리 및 돌연변이 유발 등과 같은 엔드 포인트 (인간에 효과를 외삽을 위해 최선을) 생체 내 동물 모델에서 만성 치료 (환경 적, 직업적 노출의 가장 근사치)를 포함한다. 그것은 DNA가 돌연변이와 암 개발 (6)으로 이어질 수 방사선 효과와 불완전하거나 잘못된 수리 손상의 기본 목표 것으로 알려져있다.
DNA 이중 가닥 나누기 (DSB)는 DNA 병변의 가장 해로운 유형 중 하나이며, 세포 사멸 및 종양 7 발생할 수 있습니다. 이는, 따라서, 중요한 확실하고 정확하게 저용량 방사선 및 / 또는 화학 물질과 같은 다른 오염물 스트레스에 노출 된 후 DSB의 수준을 측정 할 수 있어야한다. 가장 민감하고 특이 마커의 한DNA DSB의 γH2AX 8라는 인산화 히스톤 H2AX이며, 또 다른 마커 및 방법은 9,10 제안되었다. 그것은 H2AX 분자 수천, 유도 DSB의 근방에, 안티 γH2AX 항체 및 형광 현미경 (11)에 의한 면역 형광 라벨링 개별 DSB의 검출을 가능 γH2AX의 형성에 관여하는 것으로 추정된다. 반응은 최소 30 내지 60의 최대 도달 매우 빠르다. 증거 γH2AX 나누기의 사이트에 다른 수리 요소를 유치 및 깨진 DNA의 끝을 고정하고 (12에서 검토) 다른 수리 단백질에 대한 액세스를 제공하기 위해 크로 마틴 구조를 수정하여 DNA DSB의 수리를 용이하게하는 것이 존재한다. DNA DSB의 수리가 완료되면, γH2AX은 인산화 해제 및 / 또는 저하를 거쳐, 새로 합성 H2AX 분자는 크로 마틴 (10)의 영향을받는 지역에 γH2AX 교체됩니다. γH2AX의 형성과 손실을 모니터링 할 수 있습니다,따라서, DNA 복구 DSB 동력학의 정확한 추정치를 제공한다. 이 방법은 방사선 감수성 13-15과 상관하는 것으로 나타났다 방사선 및 그 잔류 율 및 DSB 레벨 고용량 조사 다양한 인간 종양 세포주에서 DSB 수리를 연구하기 위해 사용되었다.
우리는이 실험적인 접근 방식을 수정 DNA DSB 수준 및 수리 (그림 1)에 만성 γ-와 β-조사의 낮은 용량의 영향을 조사하기위한 생체 내 마우스 연구에 적용했다. 첫째, 우리는 마시는 물에 용해 β-방사선 삼중 물 (HTO)의 형태로 하나의 삼중 수소에 의해 방출 (수소 3) 또는 유기적으로 결합 된 삼중 수소 (OBT) 마우스의 장기 만성 노출을 수행하는 방법을 보여 . 두 형태의 축적 및 / 또는 다른 신체에 따라서 분배, 상이한 생물학적 효과를 생성 할 것으로 예상된다. 두 형태의 원자력 산업에 잠재적 인 위험이 있습니다. 이 치료상대적인 생물학적 효능의 평가를 위해 중요하다 방사선 두 종류의 정확한 비교를 할 수 있도록 상응하는 투여 율 γ-만성 방사선에 노출 병행된다. 베타 방사선 γ 방사선, 고 에너지 광자에서 매우 상이한하게 전자 구성된다. 이 때문에 차이로 Β-방사선은 주로 내부 건강 위험을 나타내며, γ-방사선을 비교하여 서로 다른 생물학적 효과를 생성 할 수있다. 이 합병증은 β-방사선에 HTO에 의해 방출을 노출의 규제에 비해 상당한 논쟁의 결과. 따라서, 공공 식수에 HTO의 규제 수준은 유럽에서 100 BQ / L에서 호주에서 75,000 BQ / L로 변화한다. 또한 γ-방사선의 선량 당량 HTO의 생물학적 효과를 비교하는 것이 중요하다. 둘째, DNA DSB의 속도는 immunofluorescently 감지 γH2AX 표시하여 만성 노출의 완료에 고립 된 비장 세포에서 측정유동 세포 계측법에 의해 에드. 이는 생체 내 노출에 의해 가해진 DNA 손상의 정도를 평가할 수있다. 그러나, 이러한 낮은 수준의 노출이 DNA 중 어느 DSB 검출 속도를 얻지 못할 수 있다는 기대 분별이고; 대신, 숨겨진 변경 / 응답은 DNA 손상을 복구하는 세포의 능력에 영향을 미칠 것으로 예상 할 수있다. 이러한 변화는, 발견하는 경우가 될 수도 있고 자극 (해로운 효과를 생산) (유익한 효과를 생산) 또는 억제. 제안 된 프로토콜은 손상의 상당한 양의 생산 방사선의 고용량으로 추출 비장 도전하여 그러한 변경을 드러내는 허용 (예를 들어, 2 Gy의 약 50 셀당 DNA DSB 또는 3의 제조 -. 총 γH2AX 레벨의 5 배 증가) . 그 후, DSB 수리의 시작과 완료를 반영 형성과 γH2AX의 손실, 유동 세포 계측법에 의해 감시된다. 이러한 방식으로, 기저 및 DNA DSB의 치료 - 유도 수준뿐만 아니라 측정 될 수 있지만,또한 세포의 기능에 미치는 잠재적 인 효과가 응답하고 수리 DNA 손상이 훨씬 더 높은 스트레스 수준에 의해 유도.
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Protocol
모든 마우스 처리 및 처리 절차는 로컬 동물 관리위원회에 의해 의회 및 / 또는 동물 보호 프로그램에 의해 규정 승인 규칙을 준수해야합니다. 이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 로컬 동물 관리위원회의 승인을 동물 관리에 캐나다위원회의 지침에 따라 수행되었다.
주의 : 방사능 모든 작업은 (포함하지만 방사성 동물 조직, 침구 폐기물 처리, 삼중 수소 처리, 외부 γ-조사에 국한되지 않음) 입법부 및 / 또는 방사선 방호 당국이 정한 규칙을 준수해야하며, 권한을 수행 할 공인 된 실험실 및 / 또는 시설에서 직원.
1. 동물 일
- 동물 그룹화
- 마우스 조직 외부로부터 도착하는 경우, 동물 시설에서 적어도 10 일 동안 동물들을 순응. 연구는 여러 치료 그룹을 포함하는 경우, 동물 공급자가 알을 보낼 수 있도록하나의 배치로 L 동물.
- 무작위 그룹 당 10 쥐의 치료 그룹에 마우스를 할당합니다. C57BL / 6 변형의 수컷 마우스를 사용하는 경우, 침략 문제를 완화하기 위해 자신의 시설에 매우 젊은 C57BL / 6 남성의 무작위를 미리 준비 동물 공급 업체가 있습니다.
- 내부 β-방사선에 쥐의 만성 노출
- HTO와 OBT 솔루션 (삼중 프롤린, 알라닌과 글리신 아미노산의 혼합물)의 원래 주식을 희석하여 마우스 마시는 물에서 작업 삼중 수소의 농도 (10 kBq / L과 1 MBq의 / L)를 준비합니다.
- 액체 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 측정하여 마시는 물에 삼중 수소의 최종 농도를 확인합니다. 필요한 경우, 농도를 조정합니다.
- 삼중 수소 물에 액세스 임의로를 제공하여 1 개월 동물을 취급합니다. 처리 물이 2 주 기간 동안 낮은 들어갔을 경우, 더 많은 물을 추가 할 수 있습니다. 그렇지 않으면 2 주에서 병을 변경합니다.
- 취급 가짜 조사 제어쥐 동일. 별도의 "깨끗한"방에서 또는 공중에서 삼중 수소 교차 오염을 방지하기 긍정적 인 공기 압력 아래에 별도의 "깨끗한"선반에 보관하십시오.
- 외부 γ - 방사선에 쥐의 만성 노출
참고 : γ-조사 시설 / 장비 위치에 따라 달라집니다. - 선량의 가능한 방법을 사용하여 원하는 선량률 제조 방사선 필드가 γ-방사원으로부터의 거리를 결정한다. 동물 케이지를 덮고있는 지역 내 방사선 분야의 동질성을 확인합니다.
참고 : 1.7 μGy / h는 1 MBq의 / 몸에 L 삼중 수소에 의해 생성 된 선량률에 해당합니다. - 1 개월 단계 1.3.1에서 결정된 거리에서 마우스 케이지를 배치하여 쥐를 노출. 30 분에 γ-조사의 일상 중단을 최소화합니다. 총 흡수 선량을 측정하는 thermoluminescence의 선량계를 사용합니다.
2. 희생과 샘플링
참고 : 추출 된 비장은 매체와 60mm 요리에 보관 될 수있는 마우스의 나머지 sacrific 동안 (최대 2 시간 동안)에디션. 도 5 및 15 생쥐 간, 참가 인원수에 따라 하루에 처리 될 수있다.
비장 세포 배양 3. 준비
- 곡선 끝 멸균 집게로 셀 스트레이너 내부 닦지하여 비장 균질화.
- 셀 스트레이너를 제거하고 15 ML 튜브에 60mm 접시에서 필터링 된 세포 현탁액을 수집합니다.
- 셀들의 나머지를 수집하기 위해 미디어의 5 ml의 셀 스트레이너 린스.
- 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브.
- 가만히 따르다 뜨는 및 RPMI 10ml에 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브.
- 가만히 따르다 뜨는 및 RPMI 5 ml의 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 25 ㎖의 조직 배양 플라스크에 넣고 세포 현탁액 4 ㎖에 및 CO 2 인큐베이터에 제거 (37 ° C, 5 % CO 2, 80 % 습도)
4. 조사 도전 고정
- 이동4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 얼음과 원심 분리기에 1.5 ML 튜브로 단계 3.8에서 세포 현탁액 1 ml의 나머지. 이 샘플에서 측정 된 DNA 손상은 DNA 복구 곡선의 건설을위한 모두 치료에 의한 손상 및 T = 0 데이터 포인트를 나타냅니다.
- 조심스럽게 진공 펌프를 이용하여 상등액을 흡인. 부드럽게 TBS 완충액 (20 mM 트리스 pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을) 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시.
- 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 조심스럽게 진공 펌프를 이용하여 상등액을 흡인. 부드럽게 TBS의 300 μL에 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 낮은 속도로 소용돌이에 혼합하는 동안, -20 ° C 100 % 에탄올 700 μL를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 혼합 몇 번 반전.
- -20 ° C에서 샘플을 저장합니다. 에탄올 고정 된 비장 세포 γH2AX 신호에 띄는 손실없이 최소 12 개월 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
- 도전 γ-RAD와 단계 3.8에서 비장의 문화를 조사 가능한 조사 장치를 이용 선량률 ≥ 200 mGy의 / 분의 2 Gy의 iation 도즈.
참고 :이 조사의 목적은 수리 기계에 도전하는 DNA DSB을 유도하는 것입니다. X 선은 또한이 목적을 위해 사용될 수있다. - 즉시 CO 2 배양기에 문화를 반환합니다.
- 1 시간 도전 2 Gy를 조사 후, 생물 안전 캐비닛에 인큐베이터에서 문화를 제거합니다. 대표 샘플 나누어지는를 수집하려면, 부드럽게 얼음에 1.5 ML 튜브에 피펫과 세포 현탁액의 전송 1 ml의를 사용하여 세포를 다시 일시 중지합니다. CO 2 배양기에 세포 배양을 돌려줍니다.
- 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 조심스럽게 진공 펌프를 이용하여 상등액을 흡인. 부드럽게 TBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시.
- 반복 4.3 단계 - 4.5.
- 24 시간 도전 2 Gy의의 γ-조사, 수확 후 단계 4.8에 설명 된대로 24 시간 샘플 =에 수정 - 4.10.
참고 : 일반적으로 15 - 하루에 30 샘플 immunofluorescently 표시된 단일 실행에 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수있다. 처리 군 간의 정확한 비교를 보장하기 위해, 각 그룹의 샘플 (S)을 포함한다. 또한 자세한 내용은 (16)을 참조하십시오.
- 얼음에 표시된 샘플 수에 대한 튜브 세트를 처리 할 장소를 준비합니다. 12 X 75mm 상한선 유리 튜브를 사용합니다. 불임은이 일을 위해 필요하지 않습니다. ( "2 Ab의 전용") 만 차 항체와 라벨링에 대한 하나의 추가 역사적 제어 샘플을 포함합니다. 연구 내에서 실행 세포 계측법 모든 흐름이 역사적 제어 샘플을 사용합니다.
- 각각의 튜브에 얼음처럼 차가운 TBS의 0.5 ML을 추가합니다.
- 5 초 동안 -20 ℃, 소용돌이에서 고정 된 비장 세포를 제거하고 TBS로 준비 튜브에 0.5 ml의 나누어지는을 전송합니다. -20 ° C 저장에 다시 샘플의 나머지를 놓고백업 샘플로 유지한다.
- 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 비장 세포. 상등액을 경사 분리하고 부드럽게 1 % FBS를 함유하는 빙냉 TBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시
- 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. TST 완충액 (TBS의 0.05 % 트리톤 X-100, 2 % FBS)의 1 ml의 펠릿을 다시 일시 부드럽게 상등액을 가만히 따르다. 얼음에 20 분 동안 품어.
- 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. 뜨는을 가만히 따르다 부드럽게 1 차 희석 방지 γH2AX 항체 200 μL에 펠렛을 다시 일시 : TST 버퍼 (150). "2 Ab의 전용"제어 샘플 TST 200 μl를 사용합니다.
- (45)의 각도로 회전하는 통에 위치 튜브 - 60 °와 실온에서 300 XG에 1.5 시간 동안 흔들어.
- TST 버퍼 200 희석 튜브 배양하는 동안 1 알렉사 488로 접합 된 염소 항 - 마우스 이차 항체의 충분한 용적 (200 μL / 시료)을 제조 하였다.
참고 : 알렉사-488를 포함한 모든 작업을복합 항체 (5.10 이하 5.16 단계를) 어두운 조명 조건에서 수행해야하며, 표시된 샘플은 알루미늄 호일에 튜브를 포장하여 빛으로부터 보호되어야한다. - 1.5 시간 인큐베이션이 완료되면, 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG 각 원심 관에 2 % FBS를 함유하는 빙냉 TBS 1 ㎖를 추가한다. 2 % FBS가 포함 된 TBS의 1 ml의 펠렛을 다시 중단 부드럽게 뜨는을 가만히 따르다.
- 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기. 단계 5.8에서 차 항체 용액 200 μL에 펠렛을 다시 중단 부드럽게 뜨는을 가만히 따르다.
- 단계 5.7에서와 같이 1 시간 동안 진탕 플랫폼에서 샘플을 품어.
- 1 % FBS를 포함하는 얼음처럼 차가운 TBS의 1 ML을 추가합니다.
- 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기. 상등액을 경사 분리하고 부드럽게 빙냉 TBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시.
- 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기. 뜨는을 가만히 따르다 부드럽게 50 μg의 / ㎖를 포함하는 TBS의 0.5 ml의 펠렛을 다시 중단요오드화 프로피 듐.
- 빛으로부터 보호 실온에서 5 분 동안 품어.
- 악기 고유의 프로토콜 16을 사용하여 흐름 cytometer에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 샘플 당 최소 10,000 세포를 읽어보십시오.
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Representative Results
비장 예상 그래프 여기서 설명한 방법을 이용하여 제조 계측법도 2는 플로우의 예를 나타낸다. 세포가 처음 <전자 볼륨 측 분산> 산점도를 기반으로 문이된다 (그림 2A 및 2D, 전자 볼륨 앞으로 분산에 해당). FL3 / 프로피 디움 요오드 히스토그램 (도 2B 및 2E)는 정상 세포주기 분포를 확인한다. FL1 채널을 이용하여 계산 γH2AX 신호를 말은 미처리 대조군 (도 2c)에 비해 세포 (도 2F)에 2 Gy를 조사에서 DNA DSB에서> 2 배의 증가를 확인한다. 다음으로, 우리는 immunofluorescently 마우스 비장 세포 유세포 γH2AX 표지 측정 한 방법의 민감도를 조사 하였다.도 3a는 마우스 비장 세포에서 γH2AX 수준 DNA DSB 지시를 도시하는 생체 노출 후 1 시간 중 낮은 (0.1Gy의) 또는 처리되지 않은 대조군에 γ-방사선의 높은 상대 (2 Gy의) 투여. 그것은 0.1 Gy를는 DSB 수준에서 약간의 증가를 유발하고 그 증가는 유의 한 것을 알 수있다. 강력한 3 배 유도는 예상과 2 Gy를 노출 한 후 검출되었다. 프로토콜에 설명 된대로 γH2AX의 면역 형광 라벨의 특이성을 확인하기 위해, 라벨 세포를 형광 현미경으로 조사 하였다. 관찰 표시된 초점과 같은 패턴은 형광 신호가 크로 마틴 내에서 개인의 DNA DSB (그림 3B)에서 유래 것을 나타냅니다.
DNA DSB 레이트의 평가 및 삼중 물을 매우 낮은 농도 (10 kBq / L)로 한 달 동안 노출 된 마우스의 비장 세포에서의 보수의 대표적인 결과가도 4에 나타나있다. 이것은 (도 4A)을 알 수 있지만 치료 γH2AX 기저 수준의 10 % 증가의 결과, 변경 없음이었다T 통계적으로 유의 한 (N = 5, 하나의 샘플 학생의 T 시험). 또한, DNA DSB 수리의 반응 속도를 나타내는 도전 2 Gy를 조사 후 측정 된 형성과 γH2AX의 손실은, 제어 및 HTO 처리 된 마우스 (그림 4B)에서 세포 사이에 차이가 없었다.
그림 1. 실험 그림은 DNA 손상과 DNA 복구에 만성 생체 조사의 효과를 평가하는. 시간의 원하는 기간 동안 만성 조사와 생쥐의 생체 내 처리 후, 마우스를 희생하고, 비장 세포 배양 도전에 설립 노출 조사. 비장 세포 분취 액을 수집하고, 도전 투여 후 다양한 시간에 고정된다. γH2AX의 수준은 라 면역 형광을 사용하여 측정되는beling 및 유동 세포 계측법에 의해 검출. 도면의 아래쪽에 플롯은 예상 데이터의 개략도이다. DNA 복구가 완료된 경우 감마 H2AX 레벨은 급격히 다시 초기 제어 값으로 감소 하였다 도전 조사 후 증가한다. DNA 손상 Δ는 DNA DSB 수리 능력에 쥐의 치료의 효과를 나타냅니다 마우스 및 DNA 수리 Δ의 실험적인 치료로 인해 발생되는 손상을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 대표는 원시 데이터 유동 세포 계측법. (A, D) 및 비장 세포 파편과 적혈구에 대한 산포도 게이팅 영역. (B, E) 세포주기 분포를 나타내는 히스토그램 DNA.
유동 세포 계측법에 의한 γ H2AX 그림 3. 감지 민감하고 특정입니다. (A) 갓 남성 CBA 마우스로부터 분리 된 비장 세포 γ 방사선 또는 가성 처리하고 1 시간 동안 γH2AX 응답을 개발할 수 0.1 또는 2 중 Gy를 조사 하였다. 세포는 immunofluorescently, 고정 된안티 γH2AX 항체로 표지하고 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. SD ± 정규화 된 평균 값 (N = 12) 표시됩니다. * 및 *** P <0.05, P <0.001, 정중 (한 샘플 학생의 T는 - 테스트)와 통계적으로 유의 한 차이를 의미. (B) 처리되지 않은 대조군의 대표 현미경 사진 (UT) 또는 2 Gy의는 immunofluorescently 방지 γH2AX으로 표시 비장 세포를 조사 항체. 녹색 형광의 초점과 같은 패턴은 γH2AX에 대한 면역 형광 라벨의 특이성을 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
삼중 식 수용 생쥐에 1 개월간의 노출에 의해 생성 된 효과의 부족을 보여주는도 4 대표 결과DNA DSB 수준 수리 및 R (HTO). (A) 비장 세포와 물을 마시는 제어 동물에 10 kBq의 HTO / L로 처리 된 마우스로부터 분리 하였다. γH2AX의 수준은 면역 형광 표지를 이용하여 측정 및 프로토콜에 기술 된 바와 같이 유동 세포 계측법 하였다. ± SD 제어들에 대하여 γH2AX 형광 수준 나타낸다 평균 (N = 5). 이러한 데이터는 DNA DSB 수리 평가도 3b에 사용 된 t = 0 시간 점에서 발생 하였다. (B) 절연 비장 γ-방사 도전 2 Gy의 선량에 노출 된 세포의 분취 액에 고정시켰다 시간 t = 0에, 도전 조사 후 1 및 24 시간. 자신의 T = 0 제어에 γH2AX 상대의 형광을 의미하는 것은 SD ± 표시됩니다 (N = 5). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문에 제시된 프로토콜은 전리 방사선 등 다양한 화학적, 물리적 에이전트의 낮은 수준의 유전 독성 효과를 조사 생체 내 연구에 대규모 마우스를 수행하는 데 유용합니다. 우리 고유의 무균 동물 시설은 GammaBeam 150 조사 장치를 장착하고 30 미터 길이의 조사 홀은 수백 또는 마우스의 수천에 낮거나 매우 낮은 선량률 조사되어 관련된 평생 연구를 수행 할 수 있습니다. 만성 저용량 조사를위한 작은 조사 시설은 방사선 생물학 연구가 정기적으로 실시하고 방사선 보호 지침 / 규정이 구현 된 대학 또는 병원 환경에서 설정할 수 있습니다. 그러나, 규제 강화는 일반적으로 삼중 수소 등의 방사성 핵종의 처리가 수행되는 내부 동물 조사를 위해 설계 시설에 적용됩니다. 드문 있지만, 이러한 내부 방사선 노출 연구 인증 실험실은 다양한 재에 존재검색 기관 세계적 그들의 고유 한 기능이 프로토콜에 설명 된 연구에 사용될 수있다.
프로토콜 내에서, 우리는 정확하게 실험적인 노출에 의해 생성 된 DNA DSB 비율을 평가하기 위해 γH2AX의 면역 형광 라벨을 사용합니다. 에 비해 24 시간에서 더 중요한 것은, 도전적인 조사의 도입이 추출 된 비장 세포에 생체를 전달 그것이 DNA DSB 응답 (γH2AX 레벨에 도전 후 1 시간에서)의 intactness을 평가할 수와 DNA DSB 수리합니다 (γH2AX 수준 0 시간). 이것은 형광 현미경으로 세포 당 γH2AX 병소의 정량화는 유동 세포 계측법에 비해 더 높은 감도를 제공 할 수 있음을주의해야한다. 예를 들어, Gy의 셀당 γH2AX 병소의 수를 크게 증가를 생산하는 것으로보고 하였다 낮은 0.001 도스. 그러나 γH2AX의 유동 세포 계측법 기반 검출의 사용은 형광 현미경 분석 BECA 위에 이점을 제공한다이 측정을위한 더 적은 시간을 필요로 사용, 그것은 고도의 전문 / 숙련 된 인원이 필요하지 않습니다 그리고 그것은 주관적인 의사 결정 γH2AX에 관련 인식과 계산을 초점 방지 할 수 있습니다. 이러한 장점은 대규모 동물 연구에 중요하다. 방법은 다음 (그림 1)을 제안하는 경우 10 치료 그룹과 그룹 당 10 마우스와 일반적인 동물 실험은, 100 × 3 = 300 비장 샘플 발생합니다. 샘플이 숫자 데이터를 생성하려면, 약 100 시간은 유동 세포 계측법 사용이 필요합니다. 수동 현미경 분석에 의해 수행하는 경우 또는, 같은 작업은 샘플 당 매우 까다로운 현미경 시간의 40 분의 보수적 인 추정을 사용하여, 적어도 300 시간이 걸릴 것입니다. γH2AX 병소의 분석 및 득점을 자동화하려는 시도가 이루어 17-19 하였지만, 그들 모두는 많은 제한이있다. 특히, 둥근 모양과 마우스 비장 세포 및 림프구의 작은 크기는 개별 선택 비현실적 모두 해결할 수있게idual γH2AX 현미경 초점. 부착 세포가 성공적으로 γH2AX의 초점을위한 자동화 된 현미경 시스템에 의해 득점되었지만, 더 성공은 마우스의 비장 세포 또는 림프구 중 하나에 대한 증명되지 않았다.
유동 세포 계측법에 의해 γH2AX 신호의 측정 값의 일상적인 변동성을 제거하는 가장 좋은 방법은 같은 실행에 실험 집단과 통제 샘플을 포함하는 모든 실행 내에서 상대적으로 γH2AX 변화를 계산하는 것이다. 추가 권장 사항은 다음과 같습니다 :) 치료 및 2 Gy를 구성 역사적 제어 샘플마다 실행에 사용되는 조사; B) 한 사람이 모든 항체 라벨 절차를 수행; c) 일차 및 이차 모두 버퍼와 항체의 단일 배치의 하나의 콘텐츠는 하나의 실험 내의 샘플들의 세트 전체에 사용된다. 또한 각각의 시료를 정기적으로 실행 전에 기기 제조사가 권장 품질 관리 시험 유세포을 수행하는 것도 중요하다. 이 REQ입니다악기의 광학 정렬 및 유체 공학 시스템을 확인하기 위해 uired과도 비교 또는 한 그룹에서 풀링하는 샘플 사이의 측정 γH2AX 형광에서 일상적인 변화를 최소화하는 데 도움이됩니다.
또한 지적되어야한다는 시간 점 (예를 들어, 1, 2, 4, 6 시간) 후 도전 조사를 분석하고 더 상세히 16 단기 DNA DSB 수리 동역학을 측정 수보다 많은 수의 용도. 그러나, 전체 복구 가능성 지연 건강 효과 likeliness 24 시간에서만 측정 초기 시점 (t = 0) 13-15 (도 4)에서 관찰 한 비교 잔류 손상에 의해 표현 될 것이다.
기저 γH2AX 레벨은, 제 기재된 방법을 이용하여 장기 노출 마우스 연구 (> 6 개월)에서 얻어진 결과보다 정확한 해석을 위해, 이전 동물 또는 노화 세포 (20)가 증가하는 것으로 알려져 있기 때문에젊은 치료 그룹의 전자 사용은, 나이 일치 제어뿐만 아니라, 바람직 할 것이다. 몇몇 보고서 γH2AX는 DNA DSB 관련되지 않는다 증식 세포에서 증가 할 수 있음을 나타낼지라도,이 쉽게 S 상 및 G2를 측정하여 제어 될 수있다 / M 상 DNA 히스토그램을 사용하여 세포 분획을 (도 2A, D). 특정 실험 조건은 아직 DNA 손상의 지표로 γH2AX 사용에서 연구원을 방지하는 경우와 같은 53BP1 같은 다른 단백질 형성 DNA 손상 병소 (그들의 조합 위나 설명한 이유로), (21)을 사용할 수있다.
우리는 근육, 심장, 뇌 및 다른 비 - 림프 조직에 대해이 방법을 이용하여 시도되지 않았지만, 이는 유동 세포 계측법을 위해 이들을 처리하는 것은 곤란 보인다. 이러한 조직의 분석이 요구되는 경우 γH2AX 병소 카운팅을위한 조직 절편 및 현미경 선택의 방법이 될 것이다. 그러나, 말초 혈액 림프구 (L)와 같은 다른 세포,ymphocytes, 골수 또는 흉선 림프구는, 상술 한 방법에 의해 γH2AX 수준을 측정하는데 사용될 수있다. 비장 림프구를 사용하는 장점은 세포 현탁액 제제 및 비장으로부터 단리 될 수있는 셀들의 많은 수의 상대적으로 간단하다. 추가 엔드 포인트가 연구에 포함 된 경우에 더욱 유리하게된다. , 유동 세포 계측법 유전자 또는 miRNA의 발현, 웨스턴 블롯에 대한 RT-qPCR에,의 CpG 메틸화에 대한 게놈 DNA : 우리의 경험에 의하면, 마우스 당 비장 세포의 전형적인 수율은 다음과 같은 분석의 각 적합한, 적어도 10 분량 씩의 수집을 허용 분석. 따라서 γH2AX 엔드 포인트들과 병렬로 추가 수집 비장 분취 량 DNA 손상 시그널링 및 수리 반응에 관여하는 유전자의 발현을 측정하는데 사용될 수있다. 자극로서 세포 독성 치료 (22)에 대한 응답으로 규제 업 전사적 일반적이다 GADD45A 및 CDKN1A 같은 유전자는 단서를 제공 할 수있다그녀의 세포가 제대로 도전적인 스트레스의 영향에 대응하고 있습니다. 유사하게, 스트레스 반응에 관여하는 단백질 수준 및 번역 후 변형은 평가 될 수있다. 마지막으로,이 추출 과정의 단계 중 하나가 여기에 기술 된 바와 같이 수행되는 경우, 비장 세포 γH2AX을 유도 할 것으로 기대되지 않는다.
그것은 유익하고 매우 다른 종점되게 프로토콜에 따라 비장 세포를 얻어 DNA 손상 및 수리 데이터를 보완하기 위해 희생하는 동안 추가 기관과 조직 샘플을하는 것이 좋습니다 것입니다. 예를 들어, 우리는 일상적 골수 생체 내 골수 소핵 분석을위한 세포, 노화 - 관련 β 갈 락토시다 제 및 DNA 복구 유전자의 발현 측정을 위해 다양한 조직을 수집한다. 희생 동안 사용할 수있는 기술 지원에 의존하는 다른 조직을 수집 할 수있는 능력; 그러나, 상당히 결과의 적절한 해석과 MU의 건설에 도움CH 더 낮은 수준의 생물학적 처리에 관련된 응답의 전신 화상을 조사된다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
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