Abstract
Niedrig dosierte Strahlenbelastung kann eine Vielzahl von biologischen Wirkungen, die in Menge und Qualität von den durch hohe Strahlendosen hergestellt Effekte unterschiedlich sind zu produzieren. Auf Fragen zu Umwelt-, Arbeits- und Gesundheitssicherheit in der richtigen und wissenschaftlich fundierte Weise bezogen in hohem Maße von der Fähigkeit, die biologischen Effekte von niedrig dosiertem Schadstoffe wie ionisierende Strahlung und chemische Substanzen genau zu messen. DNA Schädigung und Reparatur sind die wichtigsten Frühindikatoren für Gesundheitsrisiken aufgrund ihrer potentiellen langfristigen Folgen, wie zum Beispiel Krebs. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Auswirkungen von chronischen in vivo Exposition gegenüber niedrigen Dosen von γ- und β-Strahlung auf DNA-Schädigung und Reparatur in Mäusemilzzellen studieren. Verwendung eines allgemein akzeptierten Marker der DNA-Doppelstrangbrüche, phosphoryliert Histon H2AX genannt γH2AX zeigen wir, wie es verwendet werden kann, um nicht nur das Niveau der DNA-Schädigung zu beurteilen, sondern auch Änderungenin der DNA-Reparatur-Kapazität möglicherweise durch geringe Dosis in vivo Aufnahmen produziert. Durchflusszytometrie ermöglicht eine schnelle, genaue und zuverlässige Messung der immunofluorescently markierten γH2AX in einer großen Anzahl von Proben. DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur kann, indem extrahierte Milzzellen zu einer Herausforderung Dosis von 2 Gy, eine ausreichende Anzahl von DNA-Brüche zu erzeugen, um die Reparatur auslösen und durch Messung der induzierten (1 h nach der Bestrahlung) und Rest DNA-Schäden (ausgewertet werden 24 Stunden nach der Bestrahlung). Rest-DNA Schaden würde auf unvollständige Reparatur und die Gefahr von Langzeit genomische Instabilität und Krebs. In Kombination mit anderen Assays und Endpunkte, die sich leicht in solchen Untersuchungen in vivo (beispielsweise Chromosomenaberrationen, Mikronuclei Frequenzen im Knochenmark von Retikulozyten, Genexpression, etc.) gemessen werden können, ermöglicht diese Vorgehensweise eine genaue und Kontext Evaluierung der biologischen Wirkungen von Stressoren niedrigen Niveau.
Introduction
Signifikante Kontroverse über die möglichen schädlichen Auswirkungen von entweder niedrigen oder sehr niedrigen Dosen ionisierender Strahlung und die Angst vor Strahlung Öffentlichkeit, durch Bilder der Hiroshima und Nagasaki Atombombenabwürfe und seltener AKW Unfälle angetrieben (verschärft durch Massenmedien), hat zu sehr strengen Strahlenschutzverordnung und Normen, die möglicherweise wissenschaftlich begründet sind es nicht. In den letzten drei Jahrzehnten wurden zahlreiche Berichte sowohl das Fehlen von schädlichen und das Vorhandensein von potenziell positiven biologischen Effekte von niedrig dosiertem Strahlen 1-4 induzierte dokumentiert. Der Hauptstrahlungsgesundheitsrisikofaktor ist die Wahrscheinlichkeit von Krebs, basierend auf epidemiologische Studien von Überlebenden der Atombomben Empfangen hohen oder mittleren Dosen von Strahlung geschätzt. Lineare Extrapolation dieser Daten (so genannte lineare-no-Schwelle oder LNT-Modell) verwendet wird, um Risiken von Krebs bei niedrigen Dosen zu schätzen. Allerdings hat dieser Ansatz nicht weltweiten wissenschaftlichen Akzeptanz erhaltenund ist stark umstritten 5.
Es ist offensichtlich, dass weitere Studien erforderlich sind, um diese Frage zu klären und möglicherweise Strahlenschutznormen zu verbessern. Solche Studien sollten chronische Behandlungen (beste Angleichung der Umwelt- und Arbeitspositionen), in vivo-Tiermodellen (am besten für die Extrapolation Wirkungen auf die menschliche) und solchen Endpunkten als DNA-Schäden Tarife, DNA-Reparatur und Mutagenese beinhalten. Es ist bekannt, dass die DNA das primäre Ziel für Beschädigung Strahlungseffekte und unvollständige oder fehlerhafte Reparatur kann zum Mutagenese und Krebsentwicklung 6 führen.
DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind eines der schädlichsten Arten von DNA-Läsionen und können den Zelltod der Tumorgenese und 7 führen. Es ist daher wichtig, dass das Niveau des DSB nach Exposition gegenüber niedrigen Strahlungsdosis und / oder anderen Stressfaktoren, wie zum Beispiel chemische Schadstoffe sicher und genau zu messen. Eine der sensitiven und spezifischen MarkernDNA-DSB phosphoryliert Histon H2AX, genannt γH2AX 8 noch weitere Marker und Methoden wurden vorgeschlagen 9,10. Es wird geschätzt, dass Tausende von H2AX Moleküle in der Nähe eines induzierten DSB, sind bei der Bildung von γH2AX was den Nachweis einzelner DSB durch Immunmarkierung mit einem Anti-Antikörper γH2AX und Fluoreszenzmikroskopie 11 beteiligt. Die Antwort ist sehr schnell und erreichte ihr Maximum zwischen 30 und 60 min. Beweise vorliegen, dass γH2AX erleichtert Reparatur von DNA-DSB durch die Gewinnung von anderen Reparaturfaktoren zu den Orten der Brüche und durch Modifikation der Chromatinstruktur zu gebrochenen DNA-Enden zu verankern und den Zugang für andere Reparaturproteine (in 12 überprüft). Nach Abschluss der Reparatur von DNA-DSB, γH2AX wird dephosphoryliert und / oder durchläuft Abbau und neu synthetisierten H2AX Moleküle zu ersetzen γH2AX in den betroffenen Bereichen des Chromatins 10. Überwachung Bildung und Verlust der γH2AX können,liefern daher eine genaue Schätzung der DNA-DSB-Reparatur-Kinetik. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Reparatur von DSB in verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien mit hohen Dosen von Strahlung und deren Geschwindigkeit und Rest DSB Niveaus bestrahlt wurde gezeigt, dass mit radiosensitivity 13-15 korrelieren studieren.
Modifizierten wir dieses experimentellen Ansatzes und wendeten sie auf eine in vivo-Maus-Studie die Wirkung von niedrigen Dosen von chronischen γ- und β-Bestrahlung auf DNA-DSB-Reparatur-Ebenen und (1) zu untersuchen. Erstens, zeigen wir ein Verfahren, um einen langfristigen chronischen Exposition von Mäusen durchgeführt, um β-Strahlung entweder durch Tritium emittierte (Wasserstoff-3) in Form von tritiiertem Wasser (HTO) oder organisch gebundenem Tritium (OBT) gelöst im Trinkwasser . Die beiden Formen werden voraussichtlich zu akkumulieren und / oder anders im Körper und somit zu verteilen, erzeugen unterschiedliche biologische Wirkungen. Beide Formen sind potentielle Gefahren in der Nuklearindustrie. Diese Behandlungdurch chronische Einwirkung von γ-Strahlung in einer äquivalenten Dosis Rate parallel um einen korrekten Vergleich der beiden Strahlungsarten, die entscheidend für die Bewertung der relativen biologischen Wirksamkeit zu ermöglichen. Beta-Strahlung von Elektronen zusammengesetzt ist, so dass es sehr verschieden von der γ-Strahlung, Hochenergiephotonen. Aufgrund dieses Unterschieds Β-Strahlung stellt hauptsächlich Innen Gefahr für die Gesundheit und können unterschiedliche biologische Wirkungen im Vergleich zu γ-Strahlung zu erzeugen. Diese Komplikation zu erheblichen Kontroversen über die Regulierung der Einwirkung von β-Strahlung, die von HTO emittiert. So Regulierungsebenen HTO im Trinkwasser für die Öffentlichkeit variieren von 100 Bq / L in Europa zu 75.000 Bq / L in Australien. Es ist daher wichtig für die biologische Wirkung von HTO um äquivalente Dosen von γ-Strahlung zu vergleichen. Zweitens, die Rate der DNA-DSB wird in isolierten Splenozyten nach Beendigung der chronischen Exposition mit immunofluorescently markierten γH2AX erkennen gemessendurch Durchflusszytometrie ed. Dies erlaubt die Bewertung des Ausmaßes der DNA-Schädigung durch die in vivo Exposition zugefügt. Allerdings ist es sinnvoll, zu erwarten, dass solche eine niedrige Belastung möglicherweise nicht produzieren keine nachweisbaren Raten von DNA-DSB; statt, einige versteckte Änderungen / Reaktionen zu erwarten, dass die Fähigkeit der Zellen auf DNA-Schäden reparieren beeinflussen würde. Diese Veränderungen, falls vorhanden, kann entweder stimulierend (Herstellung eines nützlichen Effekt) oder inhibierende (Herstellung eines schädlichen Effekt). Das vorgeschlagene Protokoll erlaubt, bei der diese Änderungen durch die Herausforderung der entnommenen Milzzellen mit einer hohen Dosis an Strahlung, die eine erhebliche Menge an Schaden entsteht (zB 2 Gy Herstellung etwa 50 DNA-DSB pro Zelle oder eine. 3 - 5-fachen Zunahme der Gesamt γH2AX Ebene) . Anschließend wird die Bildung und den Verlust der γH2AX, was die Initiierung und Abschluss der DSB-Reparatur wird mittels Durchflusszytometrie kontrolliert. Auf diese Weise kann nicht nur die basale und Behandlung induzierten Niveaus von DNA-DSB gemessen werden, sondernauch ihre potenziellen Auswirkungen auf die Fähigkeit der Zellen zu reagieren und Reparatur DNA-Schäden, die durch viel höhere Stressniveaus induziert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Maus-Handling und Behandlungsverfahren sollten Regeln her durch den Gesetzgeber und / oder Tierpflegeprogramme eingestellt und von einem lokalen Tierschutzkommission genehmigt einzuhalten. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care mit Zustimmung des örtlichen Tierpflege Ausschuss durchgeführt.
ACHTUNG: Alle Arbeiten mit Radioaktivität (einschließlich, aber nicht, um die Handhabung von Tritium, externen γ-Bestrahlung beschränkt, Umgang mit radioaktiven tierischen Geweben, Bettwäsche Abfälle) sollten Regeln her durch den Gesetzgeber und / oder Strahlenschutzbehörden setzen haften und durch autorisierte durchgeführt werden, Personal in einem zertifizierten Labor und / oder Einrichtung.
1. Tier Arbeit
- Tier Grouping
- Wenn Mäuse werden von einer externen Organisation Ankunft zu akklimatisieren Tiere für mindestens 10 Tage in der Tierhaltung. Wenn die Studie enthält mehrere Behandlungsgruppen, zu gewährleisten, dass das Tier Lieferant al sendenl Tieren als eine einzige Partie.
- Mäuse nach dem Zufallsprinzip zuweisen, um den Behandlungsgruppen von 10 Mäusen pro Gruppe. Bei Verwendung von männlichen Mäusen des C57BL / 6-Stamm, die Tier Lieferanten vor, arrangieren Randomisierung von sehr jungen C57BL / 6 Männern in ihrer Einrichtung zu Aggression Probleme zu mildern.
- Chronische Exposition von Mäusen auf Internal β-Strahlung
- Bereiten Sie Arbeitskonzentrationen von Tritium (10 kBq / L und 1 MBq / L) in der Maus Trinkwasser durch Verdünnen der ursprünglichen Bestand von HTO und OBT (einer Mischung aus tritiierten Prolin, Alanin und Glycin Aminosäuren) Lösungen.
- Validierung der Endkonzentrationen von Tritium im Trinkwasser durch Messung der Radioaktivität unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers. Einzustellen Konzentrationen, falls erforderlich.
- Behandlung von Tieren für einen Monat durch den Zugang ad libitum an die Tritiumwasser. Wenn Wasser während der Behandlung Zeitraum von zwei Wochen zur Neige geht, fügen Sie mehr Wasser. Andernfalls ändern Flaschen auf zwei Wochen.
- Treat schein-bestrahlten KontrollMäusen identisch. Halten Sie sie in einem separaten Raum "sauber" oder auf einem separaten "sauber" Rack unter Luftüberdruck, um Tritium Kreuzkontamination aus der Luft zu vermeiden.
- Chronische Exposition von Mäusen auf externe γ-Strahlung
Hinweis: γ-Bestrahlungsanlage / Geräte werden je nach Standort variieren. - Verwenden von verfügbaren Methoden der Dosimetrie, bestimmen die Abstände von einem γ-Strahlungsquelle, Strahlungsfeldern die gewünschten Dosisleistungen haben. Stellen Sie sicher, Homogenität der Strahlungsfelder in den Bereichen Abdeckung der Tierkäfige.
Anmerkung: 1,7 μGy / h entspricht einer Dosisrate von 1 MBq / L Tritium im Körper produziert. - Expose Mäusen, indem Mäusekäfige an den in Schritt 1.3.1 für einen Monat festgelegt Distanzen. Minimieren tägliche Unterbrechung γ-Bestrahlung 30 min. Verwenden Thermolumineszenz-Dosimeter zur Gesamtenergiedosen zu messen.
2. Opfer und Sampling
Hinweis: Extrahiert Milz kann in 60 mm-Schalen mit Medien gehalten werden (für bis zu 2 Stunden), während der Rest der Mäuse sind sacrificed. Abhängig von der Zahl der Teilnehmer, zwischen 5 und 15 Mäuse in einem Tag verarbeitet.
3. Herstellung von Splenozyten-Kulturen
- Homogenisierung der Milz durch Zerkleinern in einer Zelle Sieb mit einer sterilen Pinzette mit einer gebogenen Ende.
- Entfernen Sie die Zelle Sieb und Sammeln des gefilterten Zellsuspension aus der 60-mm-Schale in einen 15-ml-Tube.
- Spülen Zellsieb mit 5 ml Medium, um den Rest der Zellen zu sammeln.
- Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT.
- Dekantieren und resuspendieren Pellet in 10 ml RPMI.
- Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT.
- Dekantieren und resuspendieren Pellet in 5 ml RPMI.
- 4 ml der Zellsuspension in eine 25 ml Gewebekulturflasche, und einem CO 2 -Inkubator entfernen (37 ° C, 5% CO 2, 80% Luftfeuchtigkeit)
4. Anspruchs Bestrahlung und Befestigung
- Übertragen Sie dierestlichen 1 ml Zellsuspension aus Schritt 3.8 in ein 1,5-ml-Röhrchen auf Eis und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. DNA-Schäden in dieser Probe gemessen wird sowohl die Behandlung induzierte Schäden und t = 0 Datenpunkt für den Aufbau einer DNA-Reparatur-Kurve darstellen.
- Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS-Puffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 300 ul TBS.
- Unter Mischen auf einem Vortex bei niedriger Geschwindigkeit, fügen 700 ul von -20 ° C 100% Ethanol. Schließen Sie den Deckel und schwenken, um zu mischen.
- Lagern die Proben bei -20 ° C. Splenozyten in Ethanol fixiert werden bei -20 ° C für mindestens 12 Monate lang ohne nennenswerten Verlust in der γH2AX Signal gespeichert werden.
- Bestrahlen die Splenozyten-Kulturen von Schritt 3.8 mit einem herausfordernden γ-rad iation Dosis von 2 Gy in einer Dosisrate ≥ 200 mGy / min unter Verwendung verfügbarer Bestrahlungseinrichtung.
Anmerkung: Der Zweck dieser Bestrahlung zu DNA-DSB-Reparatur zu induzieren, um die Maschinen herauszufordern. Röntgenstrahlung kann auch für diesen Zweck verwendet werden. - Die Kulturen sofort zu einem CO 2 Inkubator zurück.
- 1 Stunde nach der anspruchsvollen 2 Gy Bestrahlung, entfernen Sie die Kulturen aus dem Inkubator zu einem biologischen Sicherheitsschrank. Um eine repräsentative Probe aliquoten sammeln, sanft resuspendieren Zellen mit einer Pipette und 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen auf Eis. Rückgabe der Zellkulturen zu einem CO 2 -Inkubator.
- Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS.
- Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,5.
- 24 Stunden nach der Herausforderung 2 Gy γ-Bestrahlung, Ernte und beheben bei = 24 Stunden Probe, wie in Schritt 4.8 beschrieben - 4.10.
Hinweis: In der Regel 15 - können 30 Proben pro Tag immunofluorescently markiert und mittels Durchflusszytometrie in einem einzigen Durchlauf getestet werden. Um einen genauen Vergleich zwischen den Behandlungsgruppen zu gewährleisten, sind Probe (n) aus jeder Gruppe. Siehe auch Referenz 16 für weitere Details.
- Bereiten Sie eine markierte Satz von Rohren für die Anzahl der zu verarbeitenden Proben und auf Eis. Verwenden Sie 12 x 75 mm nicht begrenzten Glasröhren. Sterilität wird nicht für diese Arbeit erforderlich. Fügen Sie eine weitere historische Kontrollprobe für die Kennzeichnung mit sekundärem Antikörper nur ("nur 2. Ab"). Verwenden Sie diese historische Kontrollprobe in jeder Durchflusszytometrie innerhalb einer Studie laufen.
- 0,5 ml eiskaltem TBS in jedes Röhrchen.
- Entfernen Sie feste Splenozyten von -20 ° C, Wirbel für 5 Sekunden und übertragen ein 0,5-ml-Aliquot auf vorbereiteten Röhrchen mit TBS. Setzen Sie den Rest der Proben zurück in -20 ° C Lagerung undhalten als Backup-Probe.
- Zentrifuge Splenozyten bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und sanft resuspendieren Pellet in 1 ml eiskaltem TBS mit 1% FBS
- Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TST-Puffer (0,05% Triton X-100, 2% FBS in TBS). Inkubieren für 20 Minuten auf Eis.
- Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 200 ul des primären Anti γH2AX Antikörper verdünnt 1: 150 in TST-Puffer. Verwenden Sie 200 ul von TST für die "2nd Ab nur" Kontrollprobe.
- Position Röhrchen auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei einem Winkel von 45 - 60 ° C und Schütteln für 1,5 h bei 300 · g bei RT.
- Während Rohre Inkubieren, bereiten ein ausreichendes Volumen (200 ul / Probe) der Ziege-anti-Maus Sekundär-Antikörper mit Alexa-488 bei einer 1 konjugiert: 200-Verdünnung in TST-Puffer.
Hinweis: Alle Arbeiten, die mit Alexa-488konjugierten Antikörper (Schritte 5,10-5,16 unten) sollte unter Schwachlicht-Bedingungen durchgeführt werden und markierten Proben sollten vor Licht durch Umwickeln Rohre in Aluminiumfolie geschützt werden. - Sobald die 1,5 h Inkubation abgeschlossen ist, wird mit 1 ml eiskaltem TBS, enthaltend 2% FBS in jedes Röhrchen und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS, enthaltend 2% FBS.
- Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und vorsichtig resuspendieren Pellet in 200 & mgr; l des sekundären Antikörpers aus Schritt 5.8.
- Der Proben auf einem Schütteltisch 1 h inkubieren, wie in 5.7.
- 1 ml eiskaltem TBS mit 1% FBS.
- Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und sanft resuspendieren Pellet in 1 ml eiskaltem TBS.
- Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 0,5 ml TBS, enthaltend 50 & mgr; g / mlPropidiumiodid.
- Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt.
- Analyse Proben auf einem Durchflusszytometer mit gerätespezifischen Protokollen 16. Lesen Sie mindestens 10.000 Zellen pro Probe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 2 zeigt Beispiele für die Durchflusszytometrie Graphen für Splenozyten erwartet unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Zellen werden zunächst auf Basis des <elektronische Lautstärke-Seitenstreuung> Streudiagramm gated (2A und 2D; elektronische Band ist gleichbedeutend mit Vorwärtsstreuung). FL3 / Propidiumiodid Histogramme (2B und 2E) bestätigen normalen Zellzyklus-Verteilung. Bedeuten γH2AX Signal berechnet unter Verwendung der FL1-Kanal bestätigt eine> 2-fachen Anstieg der DNA-DSB in 2-Gy bestrahlten Zellen (2F) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Abbildung 2C). Als nächstes wird die Empfindlichkeit der beschriebenen Verfahren zur Messung immunofluorescently durch Flusszytometrie in Maussplenocyten markierten γH2AX suchten wir. 3A zeigt γH2AX Ebenen angibt DNA-DSB, in Maussplenocyten 1 Stunde nach dem ex vivo-Exposition entweder niedrig (0,1Gy) oder hoher (2 Gy) Dosen von γ-Strahlung relativ zu der unbehandelten Kontrolle. Es zeigt sich, dass 0,1 Gy induzierte eine leichte Erhöhung der DSB-Ebene und Zunahme war statistisch signifikant. Die starken 3-fache Induktion wurde erwartet, und nach dem 2 Gy Exposition festgestellt. Um die Spezifität der Immunfluoreszenzmarkierungs γH2AX validieren wie in dem Protokoll beschrieben, wurden die markierten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die beobachtete ausgeprägte Foci artiges Muster zeigt, dass die Fluoreszenz-Signal von der individuellen DNA-DSB innerhalb des Chromatins (3B).
Repräsentative Ergebnisse der Beurteilung der DNA-DSB-Rate und deren Reparatur in Splenocyten von Mäusen, die für einen Monat eine sehr geringe Konzentrationen von tritiiertem Wasser (10 kBq / L) ausgesetzt sind in Abbildung 4 dargestellt. Es kann gesehen werden (4A), dass, obwohl die Behandlung führte zu einer Erhöhung der basalen γH2AX Niveau 10%, war die Änderung nichtt statistisch signifikant (N = 5, bei einer Stichprobe Student-t-Test). Weiterhin sind die gemessenen Bildung und Verlust von γH2AX nach dem anspruchs 2 Gy Bestrahlung, welche die Kinetik der DNA-DSB-Reparatur, sich nicht zwischen den Zellen von der Steuer- und HTO-behandelten Mäusen (4B).
Figur 1. Versuchsdiagramm zur Darstellung der Wirkung der in vivo chronische Bestrahlung auf DNA-Schädigung und die DNA-Reparatur zu bewerten. Nach in vivo-Behandlung von Mäusen, die mit chronischen Bestrahlung für eine gewünschte Zeitdauer, werden die Mäuse getötet und die Splenozyten-Kulturen werden hergestellt und zu einem schwierigen exponierten Bestrahlung. Splenozyten-Aliquots werden gesammelt und zu verschiedenen Zeiten nach der anspruchsvollen Dosis festgelegt. Ebenen γH2AX werden dann unter Verwendung Immun la gemessenbeling und Detektion durch Durchflusszytometrie. Das Grundstück auf dem Boden der Figur ist eine schematische Darstellung der erwarteten Daten. Gamma-H2AX-Level drastisch zu früh nach der anspruchsvollen Bestrahlung gefolgt von einer Abnahme an die Steuerwert, wenn die DNA-Reparatur abgeschlossen ist. DNA-Schäden Δ stellt die aufgrund der experimentellen Behandlung von Mäusen und DNA-Reparatur Δ produziert Schäden stellt die Wirkung der Behandlung von Mäusen auf DNA-DSB-Reparatur-Kapazität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Representative Durchflusszytometrie Rohdaten. (A, D) Streudiagramme und Gating-Regionen für Splenozyten und Zelltrümmer und Erythrozyten. (B, E) DNA-Histogramme, die Zellzyklus-Distributionen.
Figur 3. Nachweis der γ H2AX durch Durchflusszytometrie ist empfindlich und spezifisch. (A) Splenozyten frisch aus männlichen CBA Mäusen isoliert wurden entweder mit 0,1 oder 2 Gy γ-Strahlung oder scheinbehandelten und dürfen γH2AX Reaktion 1 h entwickeln bestrahlt. Zellen wurden dann fixiert, immunofluorescentlymit Anti-γH2AX Antikörper markiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Normierten Mittelwerte ± SD dargestellt (N = 12). * Und *** bedeuten statistisch signifikanter Unterschied mit p <0,05 und p <0,001, respektvoll (eine Stichprobe Student-t -Test). (B) Repräsentative Mikrofotografien von unbehandelten Kontrolle (UT) oder 2 Gy bestrahlten Splenozyten immunofluorescently mit Anti-γH2AX beschriftet Antikörper. Die Brennpunkte artiges Muster der grünen Fluoreszenz bestätigt die Spezifität der Immunfluoreszenz-Kennzeichnung für γH2AX. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4. Repräsentative Ergebnisse, die die fehlende Wirkung von 1-Monats-Exposition von Mäusen zu tritiiertem späten hergestelltr (HTO) auf DNA-DSB-Ebene und Reparatur. (A) Es wurden Splenozyten von Mäusen, die mit 10 kBq / l HTO in Trinkwasser und behandelten Kontrolltieren isoliert. Die Höhe der γH2AX wurde mit Immunfluoreszenzmarkierungs gemessen und Durchflusszytometrie, wie im Protokoll beschrieben. Bedeuten γH2AX Fluoreszenzwerte im Vergleich zu denen der Kontrolle ± Standardabweichung sind gezeigt (n = 5). Diese Daten wurden von der Zeit t = 0-Punkt, der in 3B für die Auswertung von DNA-DSB-Reparatur verwendet wurde erzeugt. (B) Isolierte Milzzellen wurden auf eine anspruchsvolle 2 Gy Dosis γ-Strahlung ausgesetzt und Aliquots der Zellen wurden in festen Zeitpunkten t = 0, 1 und 24 Stunden nach der Bestrahlung eine Herausforderung. Mittlere Fluoreszenz von γH2AX relativ zu seinen eigenen t = 0 Regelung ± SD dargestellt (N = 5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die hier vorgestellte Protokoll ist nützlich für die Durchführung von Groß Maus in vivo Studien der Prüfung der genotoxischen Wirkungen von geringen Mengen von verschiedenen chemischen und physikalischen Mitteln, einschließlich ionisierender Strahlung. Unsere einzigartige spezifischen pathogenfreien Tierhaltung mit einer GammaBeam 150 Bestrahlungs ausgestattet und eine 30 Meter lange Bestrahlungshalle ermöglicht die Durchführung lebenslangen Studien mit niedrigen oder sehr niedrigen Dosisrate Bestrahlungen auf Hunderte oder sogar Tausende von Mäusen. Kleinere Bestrahlungseinrichtungen für chronisch niedrige Dosis der Bestrahlung kann in einer Universität oder Krankenhausumgebung, wo der Radiobiologie Untersuchungen werden routinemäßig durchgeführt und Strahlenschutz-Richtlinien / Verordnungen umgesetzt werden eingestellt werden. Jedoch strengere Vorschriften in der Regel zu den Einrichtungen für die interne Tier Bestrahlung, wo Umgang mit Radionukliden, wie Tritium, durchgeführt wird, ausgelegt sind. Obwohl selten, Labors für solche internen Strahlenexposition Studien zertifiziert in verschiedenen re vorhandenForschungseinrichtungen weltweit und ihre einzigartigen Fähigkeiten können in diesem Protokoll beschriebenen Studien verwendet werden.
Im Protokoll, verwenden wir die Immunfluoreszenz-Kennzeichnung γH2AX durch experimentelle Aufnahmen produziert DNA-DSB-Preise genau zu bewerten. Noch wichtiger ist, die Einführung eines herausfordernden Bestrahlung geliefert ex vivo zu extra Splenozyten macht es möglich, die Unversehrtheit der DNA-DSB-Reaktion (γH2AX Pegel in 1 h nach der Herausforderung) zu bewerten und von DNA-DSB-Reparatur (γH2AX Niveau bei 24 Stunden im Vergleich zu 0 h). Es sei darauf hingewiesen, daß die Quantifizierung γH2AX Foci pro Zelle durch Fluoreszenzmikroskopie kann eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu Durchflusszytometrie bereitzustellen. Zum Beispiel Dosen so niedrig wie 0.001 Gy gemeldet wurden zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl der γH2AX Foci pro Zelle herzustellen. Jedoch stellt die Verwendung von Durchflusszytometrie basierenden Detektion γH2AX Vorteile gegenüber der Fluoreszenzmikroskopie-Analyse becaverwenden Sie es weniger Zeit für Messungen erfordert, erfordert es keine hoch spezialisierten / geschultes Personal, und es vermeidet subjektive Entscheidungs Zusammenhang mit γH2AX Herde Anerkennung und Zählen. Diese Vorteile sind entscheidend für Großtierstudien. Ein typisches Tierversuch mit 10 Behandlungsgruppen und 10 Mäuse pro Gruppe wird in 100 x 3 = 300 Milzproben führen, wenn das Verfahren vorgeschlagen (Figur 1) gefolgt wird. Um Daten aus dieser Anzahl von Proben zu erzeugen, werden etwa 100 Stunden unter Verwendung von Durchflusszytometrie erforderlich. Alternativ, wenn durch manuelle mikroskopische Analysen vorgenommen, die gleiche Aufgabe würde mindestens 300 Stunden dauern, wobei eine konservative Schätzung von 40 min von anspruchsvollen Mikroskop Zeit pro Probe. Obwohl Versuche, Analysen und Scoring γH2AX Foci automatisiert worden, 17-19, haben sie alle eine Anzahl von Beschränkungen. Insbesondere die runde Form und geringe Größe der Maus-Splenozyten und Lymphozyten ist es nicht praktikabel, alle zu lösen individual γH2AX Herde mikroskopisch. Während anhaftenden Zellen wurden erfolgreich von automatisierten Mikroskopiesysteme für γH2AX Brennpunkte hat, hat keinen Erfolg für beide Maus-Splenozyten oder Lymphozyten nachgewiesen.
Der beste Weg, um Tag-zu-Tag-Variabilität in den Messwerten der γH2AX Signal mittels Durchflusscytometrie beseitigen experimentellen Gruppe und der Kontrollproben im gleichen Durchlauf aufzunehmen und relativ γH2AX Änderungen innerhalb jeder Ausführung zu berechnen. Weitere Empfehlungen umfassen: a) einen historischen Kontroll bestehend aus unbehandelten und 2 Gy bestrahlt Probe wird in jedem Durchlauf verwendet wird; b) eine Person führt alle Antikörpermarkierung Verfahren; c) ein einziges Lager von Puffern und einer Charge des Antikörpers, sowohl primäre als auch sekundäre, wird für den gesamten Satz von Proben innerhalb von einem Experiment verwendet. Es ist auch wichtig, um ein Durchflusszytometer Qualitätskontrolle vom Hersteller des Instruments, um jeden Durchlauf der Proben empfohlen routinemäßig vor und durchzuführen. Dies ist required zur optischen Ausrichtung und Fluidik-Systems des Instruments zu überprüfen und hilft auch die Minimierung von Tag zu Tag Variation gemessen γH2AX Fluoreszenz zwischen den Proben verglichen oder in einer Gruppe zusammengefasst werden.
Es sollte darauf hingewiesen werden, dass die Verwendung einer größeren Anzahl von Zeitpunkten (zB 1, 2, 4, 6 Stunden) Postanspruchs Bestrahlung kann helfen, zu analysieren und zu messen kurzfristig DNA-DSB-Reparatur-Kinetik ausführlicher 16. Jedoch würde Gesamtreparaturpotential und die Wahrscheinlichkeit von verzögerten gesundheitlichen Auswirkungen durch die Rest Schäden nur nach 24 Stunden gemessen und im Vergleich zu der zu dem Anfangszeitpunkt (t = 0) 13-15 (Figur 4) dargestellt werden, beobachtet.
Seit basal γH2AX Ebenen sind dafür bekannt, in alten Tieren oder alternden Zellen 20 zu erhöhen, für eine genauere Interpretation der in langfristige Exposition Maus-Studien (> 6 Monate) erhaltenen Ergebnisse mit dem beschriebenen Verfahren, the Verwendung eines jungen unbehandelten Gruppe, zusätzlich zu einer altersangepassten Kontroll, wäre ratsam. Obwohl einige Berichte zeigen, dass γH2AX kann in proliferierenden Zellen, die nicht auf DNA-DSB beziehen erhöhen würde, kann dies leicht durch Messen der S-Phase und G2 gesteuert werden / M-Phasen-Zellfraktionen unter Verwendung von DNA-Histogramme (2A, D). Wenn bestimmte Versuchsbedingungen noch verhindern, dass ein Forscher verwenden γH2AX als Markierung einer DNA-Schädigung (aufgrund der oben oder deren Kombination dargelegten Gründen), einem anderen Protein, DNA-Schäden Foci bilden, wie 53BP1, verwendet 21 werden.
Obgleich wir diese Methode zum nicht-lymphoiden Geweben, wie Muskel, Herz, Gehirn und andere nicht versucht wird, scheint es schwierig, sie für die Durchflusszytometrie zu verarbeiten. Gewebeschnitte und Mikroskopie für γH2AX Foci Zählung würde die Methode der Wahl sein, wenn die Analyse derartiger Gewebe erforderlich ist. Jedoch können andere lymphoide Zellen, wie periphere Blut lymphocytes, Knochenmark-Lymphozyten und Thymozyten, kann zur Messung γH2AX Ebenen durch das beschriebene Verfahren verwendet werden. Der Vorteil der Verwendung von Milz-Lymphozyten ist die relative Einfachheit der Zellsuspension Herstellung und der großen Anzahl von Zellen, die aus einer Milz isoliert werden kann. Dies wird besonders vorteilhaft, wenn weitere Streckenpunkte sind in die Studie eingeschlossen. Unserer Erfahrung nach eine typische Ausbeute von Splenozyten pro Maus ermöglicht die Sammlung von mindestens 10 Teilmengen, die jeweils für eine der folgenden Tests: Durchflusszytometrie, RT-qPCR für Gen oder miRNA-Expression, Western-Blot, genomische DNA für CpG-Methylierung Assay. Somit können zusätzliche Splenozyten Aliquots parallel zu den für die γH2AX Endpunkt gesammelt verwendet, um die Expression von Genen, DNA-Schädigung Signale und Reparaturantworten beteiligt messen. Solche Gene als GADD45A und CDKN1A, die normalerweise transkriptionell als Antwort auf zytotoxische Behandlungen 22 hochreguliert, kann einen Anhaltspunkt bieten, um anzuregenihre Zellen richtig reagiert auf die Herausforderung Stress Einfluss. Ähnlich können Proteinspiegel und posttranslationale Modifikationen in Stressreaktionen beteiligt beurteilen. Schließlich ist es nicht zu erwarten, dass jeder der Schritte des Extraktionsverfahrens, falls durchgeführt, wie hier beschrieben, kann in γH2AX Splenozyten zu induzieren.
Es wäre vorteilhaft und empfehlenswert, zusätzliche Organe und Gewebe während der Opfer Probe auf DNA-Schädigung und die Reparaturdaten für Splenozyten nach vorgestellt Protokoll mit anderen Endpunkten erhalten ergänzen. Zum Beispiel haben wir routinemßig sammeln Knochenmarkzellen für die in vivo-Knochenmark-Mikroassay verschiedenen Geweben für Seneszenz-assoziierten β-Galactosidase und DNA-Reparatur-Genexpression Messungen. Die Fähigkeit, andere Gewebe würde von der verfügbaren technischen Support während der Opfer abhängen zu sammeln; es kann jedoch deutlich in der richtigen Interpretation der Ergebnisse und den Bau einer mu helfench biologisch relevanten systemischen Bild der Reaktion auf den niedrigen Pegel der Behandlung untersucht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
