Abstract
Exposição à radiação de dose baixa pode produzir uma variedade de efeitos biológicos, que são diferentes em quantidade e qualidade dos efeitos produzidos por doses elevadas de radiação. Abordar questões relacionadas com a segurança da saúde ambiental, ocupacional e público de uma forma adequada e cientificamente justificada depende fortemente a capacidade de medir com precisão os efeitos biológicos de poluentes doses baixas, como as substâncias químicas e radiação ionizante. Danos e reparação do ADN são os mais importantes indicadores precoces de riscos para a saúde devido às suas potenciais consequências a longo prazo, como o cancro. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar o efeito da crônica exposição in vivo a doses baixas de radiação β γ- e sobre os danos e reparação do ADN em células de baço de ratinho. Usando um marcador geralmente aceite de quebras de ADN de cadeia dupla, histona H2AX fosforilada chamado γH2AX, demonstramos como ele pode ser usado para avaliar não só os níveis de danos no DNA, mas também mudana capacidade de reparo do DNA potencialmente produzido por dose baixa em exposições in vivo. A citometria de fluxo permite a medição rápida, precisa e fiável de imunofluorescência marcado γH2AX em um grande número de amostras. ADN de cadeia dupla reparação de quebras pode ser avaliada por exposição esplenócitos extraídos a uma dose desafiadora de 2 Gy de produzir um número suficiente de ADN para provocar quebra reparação e medindo o induzido (1 h pós-irradiação) e danos no ADN residual (24 hrs pós-irradiação). Danos no ADN residual seria indicativo de reparação incompleta e o risco de instabilidade genómica longo prazo e cancro. Combinado com outros ensaios e de pontos finais que podem ser facilmente obtidos em tais estudos in vivo (por exemplo, as aberrações cromossômicas, freqüências de micronúcleos em reticulócitos de medula óssea, a expressão do gene, etc.), esta abordagem permite uma avaliação precisa e contextual dos efeitos biológicos estressores de baixo nível.
Introduction
Controvérsia significativa sobre os potenciais efeitos nocivos, tanto de doses baixas ou muito baixas de radiação e medo do público de radiação, impulsionado por imagens dos bombardeios atômicos de Hiroshima e Nagasaki e de acidentes em usinas nucleares raros ionizante (exacerbada pelos meios de comunicação de massa), tem levado a muito estrita regulação protecção contra as radiações e padrões que não são potencialmente justificada cientificamente. Nas últimas três décadas, numerosos relatórios têm documentado tanto a falta de nocivos e a presença de efeitos biológicos potencialmente benéficos induzidos pela baixa dose de radiação 1-4. O principal fator de risco para a saúde da radiação é a probabilidade de câncer, estimado com base em estudos epidemiológicos de sobreviventes da bomba atômica que receberam doses elevadas ou médias de radiação. Extrapolação linear destes dados (os chamados linear não-limiar ou modelo LNT) é utilizada para estimar os riscos de cancro em doses baixas. No entanto, esta abordagem não tem recebido aceitação científica mundiale é fortemente debatido 5.
É evidente que mais estudos são necessários para esclarecer esta questão e, eventualmente, melhorar os padrões de protecção contra as radiações. Esses estudos devem envolver tratamentos crônicos (melhor aproximação das exposições ambientais e ocupacionais), em modelos animais in vivo (melhor para efeitos para a saúde humana) e extrapolar esses pontos finais como taxas de danos no DNA, reparo do DNA e mutagênese. Sabe-se que o DNA é o alvo principal para efeitos de radiação prejudicial e incompleta ou mis-reparação pode levar a mutagênese e câncer desenvolvimento 6.
ADN quebras de cadeias duplas (DSB) são um dos tipos mais deletérios de lesões do ADN e podem levar a morte celular e a tumorigénese 7. É, portanto, importante ser capaz de medir com segurança e precisão o nível de ORL após a exposição à radiação de baixa dose e / ou outros factores de stress, tais como poluentes químicos. Um dos marcadores mais sensíveis e específicosde DSB de ADN é fosforilado histona H2AX, chamado γH2AX 8, ainda outros marcadores e métodos têm sido sugeridos 9,10. Estima-se que milhares de moléculas de H2AX, na vizinhança de uma DSB induzidos, estão envolvidos na formação de γH2AX possibilitando a detecção de ORL indivíduo por marcação imunofluorescente com um anticorpo e microscopia de fluorescência de anti-γH2AX 11. A resposta é muito rápido, atingindo um máximo entre 30 e 60 min. Existem evidências de que γH2AX facilita o reparo de DNA DSB, atraindo outros fatores de reparação para os sites de pausas e modificando a estrutura da cromatina para ancorar as extremidades do DNA quebrados e fornecer acesso para outras proteínas de reparo (revisto em 12). Após a conclusão do reparo de DNA DSB, γH2AX fica de-fosforilada e / ou sofre degradação, e moléculas H2AX recentemente sintetizadas substituir γH2AX nas áreas afetadas da cromatina 10. Formação e perda de γH2AX Monitoramento pode,portanto, fornecer uma estimativa precisa da cinética de reparo de DNA DSB. Esta abordagem tem sido utilizada para estudar a reparação de DSB em várias linhas celulares tumorais humanas irradiadas com doses elevadas de radiação e a sua taxa de DSB e níveis residuais foram mostrados para correlacionar com radiossensibilidade 13-15.
Nós modificamos essa abordagem experimental e aplicou-a a um estudo de rato in vivo para examinar os efeitos de baixas doses de γ- crônica e β-irradiação sobre os níveis de ADN DSB e reparação (Figura 1). Em primeiro lugar, nós demonstramos um método para executar uma exposição crónica a longo prazo de ratinhos para β-radiação emitida pela ou trítio (hidrogénio-3) sob a forma de água tritiada (HTO) ou como trítio ligado organicamente (OBT) dissolvido na água potável . As duas formas são de esperar a acumulação e / ou distribuir de forma diferente no corpo e, por conseguinte, produzir diferentes efeitos biológicos. Ambas as formas são possíveis riscos na indústria nuclear. Este tratamentoé comparada com a exposição crónica à radiação-γ a uma taxa de dosagem equivalente a permitir uma comparação correcta dos dois tipos de radiação, que é fundamental para a avaliação da sua eficácia biológica relativa. -Radiação Beta é composto de electrões, tornando-se muito diferente da radiação γ, fotões de alta energia. Devido a esta diferença, Β-radiação representa perigo para a saúde na maior parte interna e pode produzir diferentes efeitos biológicos em comparação com γ-radiação. Esta complicação resultou em controvérsias significativas sobre a regulação da exposição a β-radiação emitida pelo HTO. Assim, os níveis regulatórios de HTO na água potável para o público variam de 100 Bq / L na Europa para 75.000 Bq / L na Austrália. É, portanto, importante para comparar os efeitos biológicos de HTO a doses equivalentes de γ-radiação. Em segundo lugar, a taxa de DNA DSB é medido em esplenócitos isolados após a conclusão de exposições crônicas usando imunofluorescência marcado γH2AX detectared por citometria de fluxo. Isto permite a avaliação da extensão do dano do ADN infligido por as exposições in vivo. No entanto, é sensato esperar que tais exposições de baixo nível pode não produzir quaisquer taxas detectáveis de DNA DSB; em vez disso, algumas alterações ocultas / respostas pode-se esperar que afetariam a capacidade das células para reparar danos no DNA. Estas alterações, quando detectado, pode ser ou estimulador (a produção de um efeito benéfico) ou inibidor (que produz um efeito deletério). O protocolo proposto permite revelar tais alterações por desafiar os esplenócitos extraídos com uma dose elevada de radiação que produza uma quantidade significativa de danos (por exemplo, 2 Gy produzindo aproximadamente 50 DSB de ADN por célula ou um 3 -. Aumento de 5 vezes no nível γH2AX total) . Subsequentemente, a formação e a perda de γH2AX, reflectindo o início e conclusão de reparação de DSB, é monitorizada por citometria de fluxo. Desta forma, não só os níveis basais e induzida por tratamento de DSB de ADN pode ser medido, mastambém o seu efeito potencial sobre a capacidade das células para responder e reparar danos ao DNA induzidos por níveis muito mais elevados estressores.
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Protocol
Todos os procedimentos de manuseio e tratamento do mouse devem aderir a regras estabelecidas pelos programas legislativo e / ou de cuidados de animais e aprovados por um comitê de cuidados com os animais local. Todos os métodos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care com a aprovação do comitê de cuidados com os animais local.
ATENÇÃO: Todos os trabalhos com radioatividade (incluindo, mas não limitado a manipulação do trítio, γ-irradiação externa, manipulação de tecidos animais, resíduos radioativos cama) devem aderir a regras estabelecidas pelas autoridades legislatura e / ou protecção contra as radiações e ser executada por pessoal autorizado pessoal em um laboratório e / ou instalação de certificado.
1. Trabalho animal
- Agrupamento animal
- Se os ratos estiver chegando de uma organização externa, aclimatar os animais durante pelo menos 10 dias na unidade animal. Se o estudo inclui vários grupos de tratamento, garantir que o fornecedor animal pode enviar all animais como um único lote.
- Alocar aleatoriamente ratinhos em grupos de tratamento de 10 ratinhos por grupo. Se estiver usando ratos machos da estirpe C57BL / 6, temos o fornecedor de animais pré-organizar randomização de muito jovens C57BL / 6 do sexo masculino em suas instalações para mitigar problemas de agressão.
- A exposição crônica de ratos para Internal Radiation β-
- Prepare as concentrações de trabalho de trítio (10 kBq / L e um MBq / l) em água potável rato diluindo o estoque original da HTO e OBT (uma mistura de prolina tritiada, alanina e glicina ácidos aminados) soluções.
- Validar as concentrações finais de trítio na água de beber, medindo a radioactividade utilizando um contador de cintilação líquida. Ajuste concentrações, se necessário.
- Tratar os animais durante um mês, fornecendo ad libitum acesso à água trítio. Se a água de tratamento fica baixa durante o período de duas semanas, adicione mais água. De outro modo, alterar garrafas em duas semanas.
- Tratar sham irradiado controleratos de forma idêntica. Mantê-los em uma sala "limpa" em separado ou em um rack "limpa" em separado sob pressão de ar positiva para evitar a contaminação cruzada trítio a partir do ar.
- A exposição crônica de ratos para External γ-Radiação
Nota: facilidade γ-irradiação / equipamento irá variar dependendo da localização. - Usando os métodos disponíveis de dosimetria, determinar as distâncias de uma fonte de radiação-γ que têm campos de radiação que produzem as doses desejadas. Assegurar a homogeneidade dos campos de radiação dentro das áreas que abrangem as gaiolas dos animais.
Nota: 1,7 Gy / h é equivalente a uma taxa de dosagem produzida por um MBq / L trítio no corpo. - Expor ratinhos por gaiolas colocação do rato a distâncias determinadas no passo 1.3.1, durante um mês. Minimizar interrupção diária de γ-irradiação de 30 min. Use dosímetros termoluminescentes para medir doses totais absorvidas.
2. Sacrifícios e Amostragem
Nota: Extraído baços podem ser mantidos em placas de 60 mm com meio (por até 2 horas), enquanto o resto dos ratos são sacrificed. Dependendo do número de pessoas que participam, entre 5 e 15 ratos podem ser processados no mesmo dia.
3. Preparação das Culturas esplenócitos
- Homogeneizar o baço por picados dentro de um filtro de células com pinça estéril com uma extremidade curva.
- Remover o filtro celular e recolher a suspensão de células filtradas da placa de 60 mm para um tubo de 15 ml.
- Lavar o filtro de células com 5 ml de meios para recolher o restante das células.
- Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min à TA.
- Decantar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em 10 ml de RPMI.
- Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min à TA.
- Decantar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em 5 ml de meio RPMI.
- Transferência de 4 ml de suspensão de células para um frasco de cultura de tecido de 25 ml e remover para um incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO2, 80% de humidade)
4. Desafiando irradiação e Fixação
- Transferir orestante 1 ml de suspensão de células a partir do passo 3.8 em um tubo de 1,5 ml em gelo e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Danos no ADN medido na amostra irá representar tanto o dano induzido por tratamento e t = 0 ponto de dados para a construção de uma curva de reparação do ADN.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante através de uma bomba de vácuo. Gentilmente re-suspender sedimento em 1 ml de tampão TBS (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM).
- Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante através de uma bomba de vácuo. Delicadamente ressuspender sedimento em 300 mL de TBS.
- Enquanto se mistura num vórtice a baixa velocidade, adiciona 700 ul de etanol a -20 ° C, 100%. Fechar a tampa e inverter algumas vezes para misturar.
- Armazenar as amostras a -20 ° C. Os esplenócitos fixos em etanol podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos 12 meses sem qualquer perda perceptível no sinal γH2AX.
- Irradiar as culturas de esplenócitos a partir do passo 3.8 com um desafio γ-Rad dose de iation de 2 Gy em uma taxa de dose ≥ 200 mGy / min usando disponível dispositivo de irradiação.
Nota: O objetivo desta irradiação é induzir DNA DSB para desafiar a maquinaria de reparo. Raios-X também pode ser utilizado para este fim. - Retornar imediatamente as culturas para uma incubadora de CO 2.
- 1 hora após o desafio 2 Gy irradiação, retire as culturas da incubadora para uma cabine de segurança biológica. Para recolher uma alíquota de amostra representativa, gentilmente re-suspender as células utilizando um pipetador e transferir 1 ml da suspensão de células para um tubo de 1,5 ml em gelo. Retorno das culturas de células para uma incubadora de CO 2.
- Tubos de centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante através de uma bomba de vácuo. Gentilmente re-suspender sedimento em 1 ml de TBS.
- Repita os passos 4,3-4,5.
- 24 horas após o desafio 2 Gy γ-irradiação, a colheita e fixar a amostra = 24 horas, tal como descrito no passo 4,8-4,10.
Nota: Normalmente, 15-30 amostras por dia pode ser rotulada imunofluorescência e analisadas por citometria de fluxo em uma única corrida. Para garantir uma comparação rigorosa entre os grupos de tratamento, incluem a amostra (s) a partir de cada grupo. Consulte também Referência 16 para mais detalhes.
- Preparar um conjunto rotulada de tubos para o número de amostras a serem processadas e colocar no gelo. Use 12 x 75 milímetros tubos de vidro não niveladas. A esterilidade não é necessário para este trabalho. Incluir uma amostra de controlo histórico adicional para marcação com anticorpo secundário somente ("unicamente segundo Ab"). Utilize esta amostra de controlo histórico em todos os citometria de fluxo executado dentro de um estudo.
- Adicionar 0,5 ml de TBS arrefecida em gelo a cada tubo.
- Remover esplenócitos fixos de -20 ° C, de vórtice durante 5 segundos e transferir uma alíquota de 0,5 ml para tubos preparados com TBS. Inserir o restante das amostras de volta para -20 ° C e armazenagemmanter como uma amostra de backup.
- Esplenócitos centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de TBS gelado contendo 1% de FBS
- Células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de tampão TE (0,05% de Triton X-100, 2% de FBS em TBS). Incubar durante 20 min em gelo.
- Células centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 200 ul de anticorpo anti-γH2AX primário diluído 1: 150 em tampão TST. Use 200 mL de TST para o "único 2 Ab" amostra de controlo.
- Tubos de posição sobre um agitador rotativo com um ângulo de 45-60 ° e agitar durante 1,5 horas a 300 xg à temperatura ambiente.
- Enquanto os tubos são a incubação, preparar um volume suficiente (200 ul / amostra) de cabra anti-ratinho anticorpo secundário conjugado com Alexa-488 a uma diluição de 1: 200 em tampão TST.
Nota: Todo o trabalho envolvendo Alexa-488anticorpo conjugado (passos 5,10-5,16 abaixo) deve ser feita sob condições de pouca luz e amostras marcadas deve ser protegido da luz por envolvimento tubos em papel de alumínio. - Uma vez que a incubação de 1,5 horas está completado, adicionar 1 ml de TBS gelado contendo 2% de FBS a cada um dos tubos e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de TBS contendo 2% de FBS.
- Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 200 ul de solução de anticorpo secundário a partir do passo 5.8.
- Incubar as amostras em uma plataforma de agitação durante 1 hora como no passo 5.7.
- Adicionar 1 ml de TBS gelado contendo 1% de FBS.
- Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 1 ml de TBS arrefecida em gelo.
- Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e re-suspender suavemente sedimento em 0,5 ml de TBS contendo 50 ug / mliodeto de propídio.
- Incubar durante 5 min à temperatura ambiente protegida da luz.
- Analisar amostras em um citômetro de fluxo, utilizando protocolos específicos do aparelho 16. Ler, pelo menos, 10.000 células por amostra.
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Representative Results
A Figura 2 mostra exemplos de citometria de fluxo gráficos esperados para os esplenócitos preparados utilizando o método descrito aqui. As células são primeiro fechado com base na <eletrônico dispersão volume-lateral> gráfico de dispersão (Figura 2A e 2D, volume eletrônico é equivalente a dispersão para a frente). FL3 / propidium histogramas de iodo (Figura 2B e 2E) confirmar distribuição normal do ciclo celular. Sinal γH2AX calculada usando o canal FL1 significa confirma um aumento> 2 vezes na DSB de ADN em células de 2 Gy (Figura 2F) irradiados em comparação com o controlo não tratado (Figura 2C). Em seguida, foi examinada a sensibilidade do método descrito de medir imunofluorescência marcado γH2AX por citometria de fluxo em esplenitos de ratinho. A figura 3A mostra níveis γH2AX, indicativo de DSB de ADN, em esplenócitos de ratinho 1 hora após a exposição ex vivo ou para baixo (0,1Gy) ou elevados (2 Gy) doses de radiação-γ em relação ao controlo não tratado. Pode ser visto que 0,1 Gy induziu um ligeiro aumento no nível de DSB e esse aumento foi estatisticamente significativo. A forte indução de 3 vezes era esperado e detectada após a exposição 2 Gy. Para validar a especificidade da marcação imunofluorescente γH2AX como descrito no protocolo, as células marcadas foram examinadas com um microscópio de fluorescência. O padrão de focos semelhantes a acentuada observada indica que o sinal de fluorescência se origina a partir do ADN DSB indivíduo dentro da cromatina (Figura 3B).
Os resultados representativos da avaliação da taxa de DSB de ADN e a sua reparação, em esplenócitos de ratinhos expostos durante um mês a muito baixas concentrações de água tritiada (10 kBq / L) são apresentados na Figura 4. Pode ser observado (Figura 4A) que, embora a tratamento resultou em um aumento de 10% do nível basal γH2AX, a mudança houvet estatisticamente significativa (N = 5, teste t de uma amostra de Student). Além disso, a formação de medição e perda de γH2AX após o desafio 2 Gy de irradiação, que representa a cinética de reparação de DSB de ADN, não foi diferente entre as células de controlo e ratos tratados com HTO (Figura 4B).
Figura 1. Diagrama experimental para avaliar o efeito da irradiação crónica in vivo em danos no ADN e de reparação do ADN. Após o tratamento in vivo de ratinhos com irradiação crónico durante um período de tempo desejado, os ratinhos são sacrificados e as culturas de esplenócitos são estabelecidos e expostos a um desafio irradiação. Alíquotas de esplenócitos são recolhidos e fixados em vários momentos após a dose de desafio. Níveis de γH2AX são então medidos utilizando imunofluorescência labeling e detecção por citometria de fluxo. A trama na parte inferior da Figura é um diagrama esquemático de dados esperados. Nível-H2AX Gamma aumenta drasticamente logo após a irradiação desafiador seguido por uma diminuição de volta para o valor de controlo, se o reparo do DNA é completa. Danos no DNA Δ representa o dano produzido devido ao tratamento experimental de ratos e reparo do DNA Δ representa o efeito do tratamento de camundongos sobre a capacidade de reparo do DNA DSB. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Fluir Figura 2. Representante citometria de dados brutos. (A, D) Gráficos de dispersão e regiões de esplenócitos de propagação e os detritos celulares e eritrócitos. (B, E) histogramas que representam as distribuições de ADN do ciclo celular.
Figura 3. Detecção de H2AX γ por citometria de fluxo é sensível e específica. (A) Os esplenócitos isolados de fresco a partir de ratinhos CBA machos foram irradiados com 0,1 ou 2 Gy de radiação-γ, ou e deixou-se desenvolver a resposta γH2AX durante 1 h tratamento simulado. As células foram então fixadas, imunofluorescênciamarcado com anticorpo anti-γH2AX e analisadas por citometria de fluxo. Os valores médios normalizados ± SD são mostradas (N = 12). * E *** significam diferença estatística com p <0,05 e p <0,001, respeitosamente (uma amostra teste t de Student). (B) microfotografias representativos de controlo não tratado (UT) ou 2 Gy irradiado esplenocitos imunofluorescência marcadas com anti-γH2AX anticorpo. O padrão de focos-like de verde fluorescente confirma a especificidade da rotulagem de imunofluorescência para γH2AX. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Resultados representativos mostrando a falta de efeito produzido por exposição de 1 mês de ratos para wate tritiadar (HTO), em nível de DNA DSB e reparação. (A) Os esplenócitos foram isoladas a partir de ratinhos tratados com 10 kBq / L de HTO em animais de controlo e de água potável. O nível de γH2AX foi medida utilizando rotulagem de imunofluorescência e a citometria de fluxo, tal como descrito no protocolo. A média γH2AX níveis de fluorescência relativa aos do controlo ± desvio padrão são mostradas (N = 5). Estes dados foram gerados a partir do t = 0 ponto de tempo que foi usada na Figura 3B para a avaliação de reparação de DSB de ADN. (B) isolados esplenócitos foram expostos a uma dose de desafio de 2 Gy de radiação e γ-se alíquotas de células foram fixadas em tempos t = 0, 1 e 24 horas após a irradiação desafiador. Fluorescência de γH2AX em relação à sua própria t = 0 significa controle é mostrado ± SD (N = 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo apresentado neste artigo é útil para a realização de rato grande escala estudos in vivo que examinam os efeitos genotóxicos de baixos níveis de vários agentes químicos e físicos, incluindo a radiação ionizante. Nossa biotério livre de patógenos específicos único equipado com um irradiador Gammabeam 150 e um salão de 30 metros de comprimento irradiação permite a realização de estudos ao longo da vida que envolvem irradiações baixa ou muito baixa taxa de dose em centenas ou mesmo milhares de ratos. Pequenas instalações de irradiação para baixo de irradiação crônica dose pode ser configurado em uma universidade ou ambiente hospitalar onde os estudos são realizados rotineiramente radiobiologia e diretrizes de proteção de radiação / regulamentos são implementados. No entanto, regras mais severas normalmente se aplicam a instalações projetadas para a irradiação de animais interna onde a manipulação de radionuclídeos, como o trítio, é levada a cabo. Apesar de rara, laboratórios certificados para tais estudos de exposição à radiação internos existem em vários reinstituições de pesquisa em todo o mundo e suas capacidades únicas pode ser usado para estudos descritos neste protocolo.
No âmbito do protocolo, usamos a rotulagem de imunofluorescência de γH2AX para avaliar com precisão as taxas de DNA DSB produzidos por exposições experimentais. Nível Mais importante ainda, a introdução de uma irradiação desafiador entregues ex vivo para esplenócitos extraídos torna possível avaliar a intacto da resposta de DSB de ADN (nível γH2AX em 1 hora após o desafio) e de reparação de DSB de ADN (γH2AX às 24 h comparado com 0 h). Deve notar-se que a quantificação de γH2AX focos por célula por microscopia de fluorescência podem proporcionar uma maior sensibilidade em relação a citometria de fluxo. Por exemplo, doses tão baixas quanto 0,001 Gy foram relatados para produzir aumentos significativos no número de focos γH2AX por célula. No entanto, a utilização de detecção baseada em citometria de fluxo de γH2AX fornece vantagens sobre a análise por microscopia de fluorescência becausá-lo requer menos tempo para as medições, que não requer pessoal altamente especializado / treinados e evita subjetivo à γH2AX de tomada de decisão focos reconhecimento e contando. Estas vantagens são críticos para estudos com animais de grande porte. Uma experiência típica animal com 10 grupos de tratamento e 10 ratinhos por grupo irá resultar em amostras de 100 x 3 = 300 baço, se o método sugerido (Figura 1) é seguido. Para gerar dados a partir deste número de amostras, de aproximadamente 100 horas será necessário utilizando citometria de fluxo. Em alternativa, se for feito por análises microscópicas manuais, a mesma tarefa levaria pelo menos 300 horas, utilizando uma estimativa conservadora de 40 min de tempo altamente exigente microscópio por amostra. Apesar das tentativas para automatizar e análise de pontuação de focos γH2AX foram feitas 17-19, todos eles têm um certo número de limitações. Em particular, a forma redonda e pequeno tamanho de esplenócitos de ratinho e linfócitos torna impraticável para resolver todos os individual γH2AX focos microscopicamente. Enquanto as células aderentes foram marcados com sucesso por sistemas de microscopia automatizados para γH2AX focos, sem sucesso tem sido demonstrada tanto para esplenócitos de rato ou linfócitos.
A melhor maneira de eliminar a variabilidade do dia-a-dia nos valores medidos de sinal γH2AX por citometria de fluxo é incluir amostras experimentais de grupo e de controlo no mesmo prazo e para calcular as alterações γH2AX relativos dentro de cada corrida. Recomendações adicionais incluem: a) um controle histórico que consiste em não tratada e 2 Gy irradiados amostra é usado em cada corrida; b) uma pessoa realiza todos os procedimentos de rotulagem anticorpo; c) um único estoque de tampões e um único lote de anticorpo, tanto primárias e secundárias, é usado para todo o conjunto de amostras dentro de uma experiência. Também é vital para realizar um citômetro de fluxo teste de controle de qualidade recomendada pelo fabricante do instrumento rotineiramente e antes de cada execução de amostras. Este é required sistema para verificar o alinhamento e fluidos óptica do instrumento e também ajuda a minimizar a variação de dia-a-dia em fluorescência medido γH2AX entre amostras a ser comparadas ou agrupados num grupo.
Deve ser salientado que a utilização de um maior número de pontos de tempo (por exemplo, 1, 2, 4, 6 horas) a irradiação pós desafio pode ajudar a analisar e medida a curto prazo cinética de reparação de DSB de ADN em maior detalhe 16. No entanto, o potencial de reparação geral e a probabilidade de efeitos para a saúde atraso seria representada pelo dano residual medido apenas em 24 horas e em comparação com a observada no ponto de tempo inicial (t = 0) 13-15 (Figura 4).
Uma vez que os níveis basais γH2AX são conhecidos por aumentarem em animais velhos ou células senescentes 20, para interpretação mais precisa dos resultados obtidos em estudos com ratos a exposição a longo prazo (> 6 meses), utilizando o método descrito, the o uso de um novo grupo não tratado, em adição a um controle pareados por idade, seria aconselhável. Embora alguns relatórios indicam que γH2AX pode aumentar em células em proliferação, o que não iria ser relacionadas com a DSB de ADN, isto pode ser facilmente controlada através da medição da fase S e G2 / M-fase fracções celulares utilizando os histogramas de ADN (Figura 2A, D). Se certas condições experimentais ainda impedir que um pesquisador utilize γH2AX como um marcador de danos no DNA (devido às razões acima expostas ou sua combinação), uma outra proteína formando DNA danos focos, como 53BP1, pode ser utilizado 21.
Embora não se tenha tentado utilizar este método no caso dos tecidos não linfóides, tais como os músculos, o coração, cérebro e outros, afigura-se difícil para processá-los por citometria de fluxo. As secções de tecido e para microscopia γH2AX focos contagem seria o método de escolha, se é necessária uma análise de tais tecidos. No entanto, outras células linfóides, tais como sangue periférico lymphocytes, linfócitos de medula óssea ou timócitos, pode ser usado para medir níveis γH2AX pelo método descrito. A vantagem da utilização de linfócitos do baço é a relativa simplicidade da preparação da suspensão de células e o grande número de células que podem ser isoladas a partir de um baço. Isto torna-se ainda mais vantajoso se pontos finais adicionais são incluídos no estudo. Na nossa experiência, um rendimento típico de esplenócitos por rato permite a recolha de pelo menos 10 aliquotas, cada adequado para qualquer dos seguintes ensaios: a citometria de fluxo, RT-qPCR para o gene ou expressão de miARN, western blot, ADN genómico para a metilação de CpG ensaio. Assim, alíquotas de esplenócitos adicionais recolhidos em paralelo àqueles para o ponto final γH2AX podem ser utilizados para medir a expressão de genes envolvidos na sinalização de danos no DNA e as respostas de reparação. Tais genes como GADD45A e CDKN1A, que normalmente são transcricionalmente regulado para cima em resposta aos tratamentos citotóxicos 22, pode fornecer uma pista como para aguçarsuas células são adequadamente responder à influência estresse desafiador. Do mesmo modo, os níveis de proteína e modificações pós-traducionais envolvidas na resposta ao stress pode ser avaliada. Finalmente, não é esperado que qualquer um dos passos do procedimento de extracção, se realizada como descrito aqui, pode induzir γH2AX em esplenócitos.
Seria benéfico e altamente recomendado para provar órgãos e tecidos adicionais durante sacrifícios para complementar e reparação de danos de dados de ADN obtidos por esplenócitos como por protocolo apresentado com outros pontos finais. Por exemplo, se recolhem as células da medula óssea, para o ensaio de micronúcleo de medula óssea in vivo, para vários tecidos associada à senescência β-galactosidase e de reparação do ADN medições de expressão de genes. A capacidade de coletar outros tecidos que dependem do suporte técnico disponível durante sacrifícios; no entanto, pode ajudar significativamente na interpretação adequada dos resultados ea construção de uma much mais biologicamente relevante imagem sistémica da resposta ao tratamento de nível baixo a ser investigado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
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