Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة Published: July 3, 2015 doi: 10.3791/52912
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

Abstract

انخفاض جرعة التعرض للإشعاع قد تنتج مجموعة متنوعة من الآثار البيولوجية التي تختلف في كمية ونوعية من الآثار التي تنتجها جرعات عالية من الإشعاع. معالجة المسائل المتعلقة بالسلامة والصحة البيئية والمهنية والعامة بطريقة سليمة ومبررة علميا يعتمد بشكل كبير على القدرة على قياس دقيق لآثار البيولوجية للملوثات جرعة منخفضة، مثل المؤينة المواد الإشعاعية والكيميائية. الضرر وإصلاح الحمض النووي هي مؤشرات مبكرة أهم المخاطر الصحية بسبب العواقب على المدى الطويل المحتملة، مثل السرطان. نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة تأثير التعرض المزمن في الجسم الحي لجرعات منخفضة من γ- وβ-الإشعاع على الحمض النووي من التلف وإصلاح في خلايا الطحال الماوس. باستخدام علامة مقبولة عموما من الحمض النووي الكسر مزدوج الحبل، مفسفر H2AX هيستون دعا γH2AX، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدامها لتقييم ليس فقط على مستوى الحمض النووي من التلف، ولكن التغييرات أيضافي قدرة إصلاح الحمض النووي المنتجة يحتمل بجرعة منخفضة في التعرض الجسم الحي. التدفق الخلوي يسمح قياس سريعة ودقيقة وموثوق بها من المسمى immunofluorescently γH2AX في عدد كبير من العينات. يمكن تقييم DNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر من خلال تعريض splenocytes استخراج إلى جرعة الصعبة من 2 غراي لإنتاج عدد كاف من DNA فواصل لتحريك إصلاح وعن طريق قياس يسببها (1 ساعة بعد التشعيع) والحمض النووي من التلف المتبقية (24 ساعة بعد التشعيع). أن الحمض النووي من التلف المتبقي يكون مؤشرا على إصلاح ناقصة وخطر عدم الاستقرار الجيني على المدى الطويل والسرطان. جنبا إلى جنب مع فحوصات أخرى ونقطة النهاية التي يمكن بسهولة أن يقاس في مثل هذه الدراسات المجراة (على سبيل المثال، التشوهات الكروموسومية، ترددات النويات في الشبكيات نخاع العظام، والتعبير الجيني، وما إلى ذلك)، وهذا النهج يتيح إجراء تقييم دقيق والسياقية للآثار البيولوجية من الضغوطات مستوى منخفض.

Introduction

جدل كبير بشأن الآثار الضارة المحتملة من تناول جرعات منخفضة أو منخفضة جدا من الإشعاع والخوف الجمهور من الإشعاع، مدفوعا صورا للتفجيرات الذرية هيروشيما وناغازاكي والنادرة الحوادث محطة نووية المؤينة (التي تفاقمت بسبب وسائل الإعلام)، قد أدى إلى غاية تنظيم الحماية من الإشعاع الصارم والمعايير التي يمكن أن تكون غير مبررة علميا. في العقود الثلاثة الماضية، وقد وثقت تقارير عديدة سواء لعدم وجود ضارة وجود الآثار البيولوجية يمكن أن تكون مفيدة الناجمة عن الإشعاع جرعة منخفضة 1-4. عوامل الخطر الصحية للإشعاع الرئيسي هو احتمال السرطان، تقديرها بناء على دراسات وبائية من الناجين من القنبلة الذرية تلقي جرعات عالية أو متوسطة من الإشعاع. يستخدم الخطية استقراء هذه البيانات (ما يسمى خطية أي عتبة أو نموذج LNT) لتقدير مخاطر الإصابة بسرطان بجرعات منخفضة. ومع ذلك، لم تتلق هذا النهج القبول العلمي على مستوى العالموناقش بشكل كبير 5.

ومن الواضح أن هناك حاجة لمزيد من الدراسات لتوضيح هذه المسألة، وربما تحسين مستويات الحماية من الإشعاع. وينبغي أن تشمل هذه الدراسات العلاجات المزمنة (أفضل تقريب التعرض للعوامل البيئية والمهنية)، في النماذج الحيوانية الجسم الحي (أفضل لاستقراء آثار للإنسان) وهذه النقاط النهائية عن معدلات الحمض النووي من التلف، وإصلاح الحمض النووي والطفرات. ومن المعروف أن الحمض النووي هو الهدف الرئيسي لإتلاف آثار الإشعاع وغير مكتملة أو سوء إصلاح قد يؤدي إلى الطفرات والسرطان تطوير 6.

DNA الكسر مزدوج الحبل (DSB) هي واحدة من أكثر أنواع ضارة من آفات الحمض النووي وربما تؤدي إلى موت الخلايا وتكون الأورام 7. ولذلك، من المهم أن تكون قادرة على موثوق ودقيق قياس مستوى DSB بعد التعرض لجرعة منخفضة من الإشعاع و / أو غيرها من الإجهاد، مثل الملوثات الكيميائية. واحدة من علامات الأكثر حساسية ومحددةمن الحمض النووي DSB غير فسفرته هيستون H2AX، ودعا γH2AX 8، ولكن قد اقترحت علامات وغيرها من الأساليب 9،10. وتشير التقديرات إلى أن الآلاف من جزيئات H2AX، في المنطقة المجاورة لجهاز تسوية المنازعات التي يسببها، ويشارك في تشكيل γH2AX تمكين الكشف عن الفردية DSB التي وصفها مناعي مع مضاد للγH2AX الأجسام المضادة ومضان المجهر 11. كانت الاستجابة سريعة جدا، حيث بلغ حده الأقصى بين 30 و 60 دقيقة. يوجد دليل على أن γH2AX يسهل إصلاح الحمض النووي DSB من خلال جذب عوامل تصليح أخرى إلى مواقع فواصل، وتعديل هيكل لونين لترسيخ نهايات الحمض النووي مكسورة وتوفير إمكانية الوصول للبروتينات تصليح أخرى (إعادة النظر في 12). عند الانتهاء من إصلاح الحمض النووي DSB، ويحصل على γH2AX إلغاء فسفرته و / أو يخضع لتدهور، والجزيئات H2AX مركبة جديدة تحل محل γH2AX في المناطق المتضررة من لونين 10. رصد تشكيل وفقدان γH2AX يمكن،لذلك، تقديم تقدير دقيق للDNA DSB حركية الإصلاح. وقد استخدم هذا النهج لدراسة إصلاح جهاز تسوية المنازعات في مختلف خطوط الخلايا السرطانية البشرية المشع مع جرعات عالية من الإشعاع ومعدل ومستويات DSB المتبقية وقد ثبت للربط مع حساسية للأشعة 13-15.

نحن تعديل هذا المنهج التجريبي وتطبيقه على دراسة الماوس في الجسم الحي لدراسة آثار الجرعات المنخفضة من γ- المزمنة وβ-التشعيع على مستويات الحمض النووي DSB و إصلاحها (الشكل 1). أولا، علينا أن نظهر وسيلة لإجراء التعرض على المدى الطويل المزمن من الفئران إلى β-الإشعاعات المنبعثة إما عن طريق التريتيوم (هيدروجين 3) في شكل الماء معالج بالتريتيوم (HTO) أو التريتيوم ملزمة عضويا (OBT) الذائب في مياه الشرب . ومن المتوقع أن تتراكم و / أو توزيع مختلف في الجسم، وبالتالي، تنتج تأثيرات بيولوجية مختلفة الأشكال اثنين. كلا الشكلين هي الأخطار المحتملة في الصناعة النووية. هذا العلاجيقابل من جانب التعرض المزمن للγ للإشعاع بمعدل جرعة مكافئة للسماح مقارنة الصحيحة من أنواع الإشعاع اثنين، وهو أمر حاسم لتقييم فعالية البيولوجية النسبية. يتكون بيتا للإشعاع من إلكترونات، مما يجعلها تختلف كثيرا عن γ للإشعاع، الفوتونات ذات الطاقة العالية. ونتيجة لهذا الاختلاف، Β للإشعاع يمثل خطرا على الصحة في الغالب الداخلي وربما يكون لها آثار بيولوجية مختلفة مقارنة γ للإشعاع. وأسفرت هذه المضاعفات في خلافات كبيرة على تنظيم التعرض لβ-الاشعاع المنبعث من HTO. وهكذا، ومستويات تنظيمية من HTO في المياه الصالحة للشرب للجمهور تختلف من 100 بيكريل / L في أوروبا إلى 75000 بيكريل / L في أستراليا. ولذلك، من المهم للمقارنة التأثيرات البيولوجية للHTO لجرعات يعادل γ للإشعاع. ثانيا، يتم قياس معدل الحمض النووي DSB في splenocytes معزولة عند الانتهاء من التعرض المزمن باستخدام المسمى immunofluorescently γH2AX كشفإد التدفق الخلوي. وهذا يسمح للتقييم مدى التلف في الحمض النووي من قبل في الجسم الحي التعرض الواقع. ومع ذلك، فمن المنطقي أن نتوقع أن مثل هذه التعرضات مستوى منخفض قد لا ينتج أي نسب ملحوظة من الحمض النووي DSB. بدلا من ذلك، بعض التغييرات الخفية / قد يكون من المتوقع من شأنها أن تؤثر على قدرة الخلايا على إصلاح الحمض النووي من التلف الردود. هذه التغيرات، إذا وجدت، قد تكون إما المحفزة (تنتج تأثير مفيد) أو المثبطة (إحداث تأثير ضار). البروتوكول المقترح يسمح تكشف هذه التغيرات من خلال تحدي splenocytes المستخرجة مع جرعة عالية من الإشعاع التي تنتج قدرا كبيرا من الضرر (على سبيل المثال، 2 غراي إنتاج ما يقرب من 50 DNA جهاز تسوية المنازعات في خلية أو 3 - زيادة بنسبة 5 أضعاف في المستوى الإجمالي γH2AX) . وفي وقت لاحق، وتشكيل وفقدان γH2AX، مما يعكس بدء والانتهاء من إصلاح جهاز تسوية المنازعات، ويتم رصد التدفق الخلوي. بهذه الطريقة، ليس فقط القاعدية والمستويات التي يسببها العلاج من الحمض النووي DSB يمكن قياسها، ولكنأيضا تأثيره المحتمل على قدرة الخلايا على الاستجابة وإصلاح الحمض النووي من التلف الناجم عن مستويات الإجهاد أعلى من ذلك بكثير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وينبغي لجميع إجراءات التعامل مع والعلاج الماوس الالتزام بالقواعد التي وضعتها برامج التشريعية و / أو رعاية الحيوان والتي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان المحلية. تم تنفيذ جميع الطرق الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان بموافقة لجنة رعاية الحيوان المحلية.

تنبيه: كل عمل مع النشاط الإشعاعي (بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على التعامل مع التريتيوم، الخارجي γ-التشعيع، والتعامل مع الأنسجة الحيوانية المشعة والنفايات الفراش) يجب أن تلتزم القواعد المنصوص عليها من قبل السلطات التشريعية و / أو الحماية من الإشعاع وأن يقوم بها أذن الموظفين في مختبر معتمد و / أو المرفق.

1. العمل الحيوان

  1. التجمع الحيوان
    1. إذا الفئران يصلون من مؤسسة خارجية، تأقلم الحيوانات لمدة 10 يوما على الأقل في منشأة الحيوان. إذا تضمنت الدراسة مجموعة العلاج متعددة، تأكد من أن المورد الحيوان يمكن أن ترسل آلالحيوانات لتر كما دفعة واحدة.
    2. عشوائيا تخصيص الفئران إلى مجموعات العلاج من 10 الفئران في المجموعة. في حالة استخدام ذكور الفئران من سلالة C57BL / 6، لدينا المورد الحيوان قبل ترتيب العشوائي من C57BL صغيرة جدا / 6 ذكور في تسهيلهم للتخفيف من قضايا العدوان.
  2. التعرض المزمن من الفئران إلى داخلي β-الإشعاع
    1. إعداد تركيزات العمل من التريتيوم (10 كيلو بيكيريل / L و 1 من mbq / L) في الماوس مياه الشرب عن طريق تمييع المخزون الأصلي من HTO وOBT (خليط من البرولين معالج بالتريتيوم، ألانين والأحماض الأمينية الجلايسين) الحلول.
    2. التحقق من صحة تركيزات النهائي من التريتيوم في مياه الشرب من خلال قياس النشاط الإشعاعي باستخدام عداد التلألؤ السائل. ضبط تركيز، إذا لزم الأمر.
    3. علاج الحيوانات لمدة شهر واحد من خلال توفير بالمال وبالشهرة أيضا وصول الإعلان إلى الماء التريتيوم. إذا وصل الماء إلى العلاج منخفضة خلال فترة أسبوعين، إضافة المزيد من الماء. خلاف ذلك، تغيير الزجاجات على أسبوعين.
    4. علاج الشام المشع السيطرةالفئران مماثل. الاحتفاظ بها في غرفة منفصلة "نظيفة" أو على رف منفصل "نظيف" تحت ضغط الهواء الإيجابي لتجنب التريتيوم انتقال التلوث من الجو.
  3. التعرض المزمن من الفئران لالخارجي γ من الإشعاع
    ملاحظة: مرفق γ-تشعيع / المعدات تختلف تبعا للموقع.
  4. باستخدام الوسائل المتاحة من قياس الجرعات، وتحديد المسافات من مصدر γ للإشعاع التي تحتوي على حقول الإشعاع إنتاج معدلات الجرعة المطلوبة. ضمان تجانس مجالات الإشعاع داخل المناطق التي تغطي أقفاص الحيوانات.
    ملاحظة: 1.7 μGy / ساعة، أي ما يعادل نسبة الجرعة التي تنتجها 1 من mbq / L التريتيوم في الجسم.
  5. تعرض الفئران عن طريق وضع أقفاص الماوس على مسافات تحديدها في الخطوة 1.3.1 لمدة شهر واحد. تقليل انقطاع يومي للγ-التشعيع لمدة 30 دقيقة. استخدام مقاييس الجرعات معان بالحرارة لقياس مجموع الجرعات الممتصة.

2. التضحيات وأخذ العينات

إعداد الأدوات الجراحية المعقمة، 60 مم أطباق بتري مع إدراج مصافى خلية 70 ميكرون، 15 مل و 1.5 مل أنابيب، ووسائل الإعلام RPMI تستكمل مع المصل 5٪ بقري جنيني (FBS) ومكان كل ما في خزانة السلامة البيولوجية. ضمان عقم العمل أمر بالغ الأهمية.
  • الاستغناء عن 5 مل من وسائل الاعلام RPMI في كل 60 مم طبق بتري.
  • التضحية الفئران باستخدام أسلوب معتمد من قبل لجنة رعاية الحيوان المحلية. خلع عنق الرحم هو خيار جيد للعمل خلية طحالية الموصوفة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة عينات الدم لفحوصات أخرى (على سبيل المثال، لmFISH، والنواة الصغرى كتلة مثبط حركة الخلايا أو غيرها من المقايسات genetoxicity شيوعا)، واستخدام ثقب داخل القلب بعد التخدير مع isoflurane.
  • وضع الحيوان في الاستلقاء الظهري، مع رئيس لافتا بعيدا عنك. رش الماوس لأسفل مع الايثانول 70٪. باستخدام ملقط، والاستيلاء على الجلد الأمامية لفتح مجرى البول وإجراء شق صغير مع مقص في منطقة العجان. من هذا الشق، وقطع على طول خط الوسط بطني إلى تجويف الصدر، والحرص على قطع فقط الجلد وليس الجدار العضلي تحتها. تشريح الجلد بعيدا عن خط الوسط.
  • فهم جدار البطن مع ملقط وقطع على طول محور وسيطة من الجدار العضلي لفتح تجويف البطن.
  • استئصال الطحال تجتاح بخفة مع ملقط معقم وبلطف سحب على أنه في حين خفض في وقت واحد بعيدا عن النسيج الضام مع مقص.
  • قطع قطعة صغيرة من الطحال (حوالي 1/10 من الطحال) ووضعها في أنبوب 1.5 مل. المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل لتخزين اللاحق في -80 ° C لفحوصات تكميلية.
  • وضع ما تبقى من الطحال إلى مصفاة الخلية داخل طبق بتري 60 ملم مع 5 مل من وسائل الإعلام الاستغناء قبل RPMI.
  • انتقل إلى الماوس المقبل.
    يمكن الاحتفاظ المستخلصة والطحال في 60 ملم الأطباق مع وسائل الإعلام (لمدة تصل إلى 2 ساعة) في حين أن بقية الفئران هي التضحيه: مذكرةأد. اعتمادا على عدد من الناس المشاركة، ما بين 5 و 15 الفئران يمكن معالجتها في يوم واحد.

    • 3. التحضير للثقافات خلية طحالية

    1. التجانس الطحال تنميق داخل مصفاة الخلية مع ملقط معقم مع نهاية منحنية.
    2. إزالة مصفاة الخلية وجمع تعليق خلية تصفيتها من 60 مم طبق في أنبوب 15 مل.
    3. شطف مصفاة الخلية مع 5 مل من وسائل الإعلام لجمع ما تبقى من الخلايا.
    4. أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    5. طاف صب وإعادة تعليق بيليه في 10 مل من RPMI.
    6. أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    7. طاف صب وإعادة تعليق بيليه في 5 مل من RPMI.
    8. نقل 4 مل من التعليق الخلية إلى ثقافة قارورة 25 مل الأنسجة وإزالة لحاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2، الرطوبة 80٪)

    4. تحدي الإشعاع وإصلاح

    1. نقلالمتبقية 1 مل من تعليق الخلية من الخطوة 3.8 في أنبوب 1.5 مل على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. والحمض النووي من التلف تقاس في هذه العينة تمثل كل من الأضرار التي يسببها العلاج ور = 0 بيانات نقطة لبناء منحنى إصلاح الحمض النووي.
    2. نضح بعناية طاف باستخدام مضخة فراغ. بلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS العازلة (20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل).
    3. أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف باستخدام مضخة فراغ. بلطف اعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولتر من TBS.
    4. في حين أن الاختلاط في دوامة في سرعة منخفضة، إضافة 700 ميكرولتر من -20 ° C الإيثانول بنسبة 100٪. إغلاق الغطاء وعكس عدة مرات لخلط.
    5. تخزين العينات في -20 ° C. Splenocytes ثابتة في الإيثانول يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 12 شهرا على الأقل بدون أي خسارة ملحوظة في إشارة γH2AX.
    6. أشرق الثقافات خلية طحالية من الخطوة 3.8 مع تحديا γ-راد جرعة ينتقم من 2 غراي في ≥ معدل الجرعة 200 mGy / دقيقة باستخدام جهاز تشعيع المتاحة.
      ملاحظة: إن الغرض من هذا الإشعاع هو للحث على الحمض النووي DSB للطعن في آلية إصلاح. ويمكن أيضا الأشعة السينية يمكن استخدامها لهذا الغرض.
    7. العودة فورا الثقافات إلى CO 2 الحاضنة.
    8. 1 ساعة بعد التحدي 2 غراي التشعيع، وإزالة الثقافات من الحاضنة لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية. لجمع عينة تمثيلية قسامة، بلطف اعادة تعليق الخلايا باستخدام pipettor ونقل 1 مل من تعليق خلية إلى أنبوب 1.5 مل على الجليد. العودة الثقافات الخلية إلى CO 2 الحاضنة.
    9. أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف باستخدام مضخة فراغ. بلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS.
    10. كرر الخطوات من 4،3-4،5.
    11. 24 ساعة بعد التحدي 2 غراي γ-التشعيع، والحصاد وإصلاح في = 24 ساعة العينة كما هو موضح في الخطوة 4،8-4،10.
    TLE "> 5. مناعي وصفها مع لمكافحة γH2AX جسم

    ملاحظة: عادة، 15-30 عينات يوميا يمكن أن توصف immunofluorescently ويعاير بواسطة التدفق الخلوي في شوط واحد. لضمان إجراء مقارنة دقيقة بين مجموعات العلاج، وتشمل العينة (ق) من كل مجموعة. انظر أيضا مرجع 16 لمزيد من التفاصيل.

    1. إعداد مجموعة المسمى أنابيب لعدد من العينات التي سيتم تجهيزها ومكان على الجليد. استخدام 12 × 75 ملم أنابيب زجاجية لم يسبق لهم اللعب. غير مطلوب العقم لهذا العمل. وتشمل العينة الضابطة واحدة إضافية تاريخية لوضع العلامات مع الأجسام المضادة الثانوية فقط ("2 أب فقط"). استخدام هذه العينة السيطرة التاريخية في كل التدفق الخلوي تشغيل ضمن دراسة.
    2. إضافة 0.5 مل من TBS الجليد الباردة إلى كل أنبوب.
    3. إزالة splenocytes الثابتة من -20 ° C، دوامة لمدة 5 ثوانى ونقل 0.5 مل قسامة إلى أنابيب مستعدة مع TBS. وضع ما تبقى من عينات مرة أخرى إلى -20 ° C تخزين والحفاظ على عينة احتياطية.
    4. splenocytes أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من الجليد الباردة TBS تحتوي على 1٪ FBS
    5. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من تجارة الرقيق عبر الأطلسي العازلة (0.05٪ تريتون X-100، 2٪ FBS في TBS). احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد.
    6. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من الابتدائي مكافحة γH2AX الأجسام المضادة المخفف 1: 150 العازلة في تجارة الرقيق عبر الأطلسي. استخدام 200 ميكرولتر من تجارة الرقيق عبر الأطلسي ل"2 أب فقط" العينة الضابطة.
    7. أنابيب موقف على شاكر الدورية في زاوية من 45 - 60 درجة ويهز لمدة 1.5 ساعة عند 300 x ج في RT.
    8. في حين أنابيب تحتضن، وإعداد حجم كاف (200 ميكرولتر / عينة) من الماعز لمكافحة فأر الضد الثانوية مترافق مع اليكسا-488 في 1: 200 التخفيف العازلة في تجارة الرقيق عبر الأطلسي.
      ملاحظة: كل عمل يستدعي اليكسا-488وينبغي أن يتم الضد مترافق (الخطوات 5،10-5،16 أدناه) في ظل ظروف الإضاءة الخافتة ويجب حماية العينات وصفت من الضوء من خلال التفاف الأنابيب في رقائق الألومنيوم.
    9. وبمجرد الانتهاء من 1.5 ساعة الحضانة، إضافة 1 مل من TBS الجليد الباردة التي تحتوي على 2٪ FBS إلى كل أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS تحتوي على 2٪ FBS.
    10. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية من الخطوة 5.8.
    11. احتضان العينات على منصة تهتز لمدة 1 ساعة كما في الخطوة 5.7.
    12. إضافة 1 مل من TBS الجليد الباردة التي تحتوي على 1٪ FBS.
    13. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS الجليد الباردة.
    14. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 0.5 مل من TBS تحتوي على 50 ميكروغرام / مليوديد propidium.
    15. احتضان لمدة 5 دقائق على RT محمية من الضوء.
    16. تحليل العينات على تدفق عداد الكريات باستخدام بروتوكولات أداة محددة 16. قراءة لا يقل عن 10،000 الخلايا لكل عينة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    ويبين الشكل 2 أمثلة من التدفق الخلوي الرسوم البيانية المتوقعة لsplenocytes أعدت باستخدام الطريقة الموصوفة هنا. هي بوابات الخلايا أولا على أساس <الإلكترونية مبعثر الجانب حجم> مؤامرة مبعثر (الشكل 2A و 2D، حجم الإلكترونية ما يعادل مبعثر إلى الأمام). FL3 / propidium رسوم بيانية اليود (الشكل 2B و2E) تؤكد العادي توزيع دورة الخلية. يعني إشارة γH2AX حسابها باستخدام قناة FL1 يؤكد زيادة> 2 أضعاف في الحمض النووي DSB في 2-غراي المشع الخلايا (الشكل 2F) مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة (الشكل 2C). بعد ذلك، درسنا حساسية الطريقة الموصوفة لقياس المسمى immunofluorescently γH2AX التدفق الخلوي في splenocytes الماوس. ويبين الشكل 3A مستويات γH2AX، مما يدل على الحمض النووي DSB، في splenocytes الماوس 1 ساعة بعد التعرض فيفو السابقين إما منخفضة (0.1غراي) أو العالية (2 غراي) جرعة من γ للإشعاع بالنسبة للضابطة. ويمكن أن ينظر إلى 0.1 غراي الناجم عن زيادة طفيفة في مستوى جهاز تسوية المنازعات وكان ذلك زيادة ذات دلالة إحصائية. وكان من المتوقع والكشف عن بعد غراي التعرض 2 قوي تحريض 3 أضعاف. للتحقق من صحة خصوصية γH2AX وضع العلامات مناعي كما هو موضح في البروتوكول، تم فحص الخلايا المسمى مع المجهر مضان. نمط مثل بؤر ملحوظ لوحظ يشير إلى أن إشارة مضان تنبع من الحمض النووي DSB الفردية داخل لونين (الشكل 3B).

    وتعرض نتائج ممثلة لتقييم معدل DNA جهاز تسوية المنازعات وإصلاح في splenocytes من الفئران المعرضة لمدة شهر واحد لتركيزات منخفضة جدا من الماء معالج بالتريتيوم (10 كيلو بيكيريل / L) في الشكل رقم (4). ويمكن أن يرى الشكل (4A) أنه بالرغم من أن أسفرت العلاج في زيادة بنسبة 10٪ من مستوى γH2AX القاعدية، كان التغيير لار ذات دلالة إحصائية (N = 5، عينة واحدة الطالب اختبار تي). وعلاوة على ذلك، وتشكيل قياس وفقدان γH2AX بعد التحدي 2 غراي التشعيع، التي تمثل حركية الحمض النووي DSB إصلاح، لا يختلف بين الخلايا من السيطرة والفئران HTO المعاملة (الشكل 4B).

    الشكل 1
    الشكل 1. رسم التجريبية لتقييم تأثير الإشعاع المزمن في الجسم الحي على الحمض النووي من التلف وإصلاح الحمض النووي. وبعد المجراة علاج الفئران مع التشعيع المزمن لفترة من الوقت المطلوب، وضحى الفئران وأنشأت الثقافات خلية طحالية ويتعرض لتحدي التشعيع. يتم جمع قسامات خلية طحالية وثابتة في أوقات مختلفة بعد الجرعة الصعبة. ومن ثم يتم قياس مستويات γH2AX باستخدام مناعي لاbeling والكشف عن طريق التدفق الخلوي. المؤامرة على الجزء السفلي من الشكل هو التخطيطي من البيانات المتوقعة. غاما H2AX مستوى يزيد بشكل كبير في وقت مبكر بعد التشعيع تحديا يليه انخفاض مرة أخرى إلى القيمة الرقابية، إن إصلاح الحمض النووي كاملة. الحمض النووي من التلف Δ تمثل الأضرار الناجمة بسبب المعالجة التجريبية من الفئران وإصلاح الحمض النووي Δ يمثل تأثير العلاج من الفئران على الحمض النووي DSB قدرة إصلاح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 2
    تتدفق الشكل 2. الممثل الخلوي البيانات الخام. (A، D) المؤامرات مبعثر والمناطق المعزولة لsplenocytes والحطام الخلية وخلايا الدم الحمراء. (B، E) رسوم بيانية DNA التي تمثل توزيعات دورة الخلية. (AC) من خلايا الطحال السيطرة غير المعالجة التمثيلية، في حين تم الحصول على البيانات في مجموعات (D- F) من الخلايا المشع مع 2 غراي γ للإشعاع وتحصد 1 ساعة بعد التشعيع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)
    الشكل 3. الكشف عن H2AX γ التدفق الخلوي حساس ومحدد. (A) والمشع Splenocytes المعزولة حديثا من الفئران CBA الذكور إما 0.1 أو 2 غراي من γ للإشعاع، أو وسمح لتطوير استجابة γH2AX لمدة 1 ساعة المعالجة الصورية. والخلايا ثم ثابتة، immunofluorescentlyوصفت مع مكافحة γH2AX الأجسام المضادة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. يتم عرض القيم المتوسطة تطبيع ± SD (N = 12). المشع * و*** دلالة الفرق الإحصائي مع p <0.05 و p <0.001، باحترام (عينة واحدة الطالب ر -test). (B) microphotographs الممثل السيطرة غير المعالجة (UT) أو 2 غراي splenocytes المسمى immunofluorescently مع مكافحة γH2AX الأجسام المضادة. نمط مثل بؤر مخضر يؤكد خصوصية وضع العلامات مناعي لγH2AX. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 4
    الرقم 4. ممثل النتائج تبين عدم وجود تأثير تنتج عن التعرض 1-شهر الفئران لتوفير المياه معالج بالتريتيومص (HTO) على مستوى الحمض النووي DSB والإصلاح. تم عزل (A) Splenocytes من الفئران التي عولجت مع 10 كيلو بيكيريل / L من HTO في الحيوانات المائية والتحكم الشرب. وقد تم قياس مستوى γH2AX باستخدام الوسم مناعي والتدفق الخلوي كما هو موضح في البروتوكول. يعني ترد مستويات مضان γH2AX النسبية لتلك السيطرة ± SD (N = 5). تم إنشاء هذه البيانات من T = 0 الوقت نقطة الذي تم استخدامه في الشكل 3B لتقييم DNA DSB إصلاح. تعرض (B) splenocytes المعزولة إلى تحدي 2 غراي جرعة من γ للإشعاع، وكانت ثابتة aliquots من الخلايا في مرات ر = 0، 1 و 24 ساعة بعد التشعيع تحديا. يعني مضان من γH2AX مقارنة الخاصة T = 0 السيطرة يظهر ± SD (N = 5). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    بروتوكول الواردة في هذه الورقة هو مفيد لإجراء الماوس على نطاق واسع في الدراسات المجراة دراسة الآثار السامة للجينات من مستويات منخفضة من مختلف العوامل الكيميائية والفيزيائية، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة. منشأتنا الحيوانات خالية من مسببات الأمراض محدد فريدة من نوعها مجهزة GammaBeam 150 irradiator و30 متر قاعة التشعيع طويلة تسمح بإجراء الدراسات مدى الحياة التي تنطوي على irradiations معدل جرعة منخفضة أو منخفضة جدا على مئات أو حتى آلاف من الفئران. يمكن تعيين مرافق أشعة أصغر لالمزمن جرعة منخفضة الإشعاع تصل في إحدى الجامعات أو بيئة المستشفى حيث أجريت دراسات البيولوجيا الإشعاعية بشكل روتيني والمبادئ التوجيهية الحماية من الإشعاع / تنفذ اللوائح. ومع ذلك، تطبيق لوائح أكثر صرامة عادة إلى المرافق المصممة للإشعاع الحيوان الداخلي حيث التعامل مع النويدات المشعة، مثل التريتيوم، وتنفيذها. وإن كان نادرا، والمختبرات المعتمدة لمثل هذه الدراسات التعرض للإشعاع الداخلية موجودة في مختلف إعادةويمكن استخدام مؤسسات البحث في جميع أنحاء العالم وقدرات فريدة من نوعها للدراسات الموصوفة في هذا البروتوكول.

    ضمن البروتوكول، ونحن استخدام العلامات مناعي من γH2AX لتقييم بدقة معدلات الحمض النووي DSB التي تنتجها التعرض التجريبية. مستوى الأهم من ذلك، إدخال تشعيع تحديا تسليم خارج الحي لsplenocytes استخراج يجعل من الممكن لتقييم intactness للاستجابة DNA DSB (مستوى γH2AX في 1 ساعة بعد التحدي) والحمض النووي DSB إصلاح (γH2AX في 24 ساعة مقارنة 0 ساعة). تجدر الإشارة إلى أن القياس الكمي للγH2AX البؤر في الخلية بواسطة المجهر مضان قد توفر حساسية أعلى بالمقارنة مع التدفق الخلوي. على سبيل المثال، جرعات منخفضة تصل إلى 0،001 تم الإبلاغ غراي لإنتاج زيادات كبيرة في عدد من بؤر γH2AX لكل خلية. ومع ذلك، فإن استخدام الكشف يستند الخلوي تدفق من γH2AX يوفر مزايا أكثر من مضان التحليل المجهري بيكااستخدامها يتطلب وقتا أقل للمقاييس، أنها لا تتطلب أفراد درجة عالية من التخصص / مدربة وأنه يتجنب تتعلق γH2AX صنع القرار ذاتية بؤر الاعتراف وفرز الأصوات. هذه المزايا هي حاسمة بالنسبة الدراسات على الحيوانات على نطاق واسع. وهناك تجربة الحيوان نموذجية مع 10 مجموعات العلاج و10 الفئران في كل مجموعة تؤدي في 100 عينة × 3 = 300 الطحال، إذا اقترح طريقة (الشكل 1) يتبع. لتوليد بيانات من هذا العدد من العينات، سيلزم نحو 100 ساعة باستخدام التدفق الخلوي. بدلا من ذلك، إذا قام به التحليلات المجهرية اليدوي، فإن المهمة نفسها تأخذ مالا يقل عن 300 ساعة، وذلك باستخدام تقدير متحفظ من 40 دقيقة من تطلبا للغاية الوقت المجهر لكل عينة. على الرغم من محاولات لأتمتة التحليل والتهديف من بؤر γH2AX بذلت 17-19، أنهم جميعا لديهم عدد من القيود. على وجه الخصوص، شكل دائري وصغر حجم splenocytes الماوس والخلايا الليمفاوية يجعله غير عملي لحل جميع الكلاسيكي فرديidual γH2AX البؤر المجهر. في حين أن الخلايا الملتصقة وقد سجلت بنجاح من قبل أنظمة المجهر الآلي لγH2AX البؤر، وقد تجلى أي نجاح لأي splenocytes الماوس أو الخلايا الليمفاوية.

    أفضل طريقة للقضاء على التباين يوما بعد يوم في القيم المقاسة من إشارة γH2AX التدفق الخلوي لتشمل عينات مجموعة والسيطرة التجريبية في نفس المدى وحساب التغيرات γH2AX النسبية داخل كل شوط. وتشمل التوصيات الإضافية: أ) عنصر تحكم التاريخية التي تتألف من دون علاج و 2 غراي معرضا للاشعاع يستخدم العينة في كل شوط. ب) شخص واحد يقوم بجميع الإجراءات وضع العلامات الأجسام المضادة. ج) سهم واحد من مخازن ودفعة واحدة من الأجسام المضادة، سواء الابتدائية والثانوية، ويستخدم لمجموعة كاملة من العينات في غضون تجربة واحدة. ومن المهم أيضا إجراء قياس التدفق الخلوي اختبار مراقبة الجودة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة أداة بشكل روتيني وقبل كل شوط من العينات. هذا هو مساuired للتحقق بصري نظام التوافق وFLUIDICS الصك وأيضا يساعد على التقليل من التباين يوما بعد يوم في قياس مضان γH2AX بين عينات لمقارنة أو مجمعة في مجموعة واحدة.

    وتجدر الإشارة إلى أن استخدام عدد أكبر من نقاط الوقت (على سبيل المثال، 1، 2، 4، 6 ساعات) التشعيع آخر تحديا قد يساعد في تحليل وقياس المدى القصير حركية الحمض النووي DSB إصلاح بمزيد من التفصيل (16). ومع ذلك، وإمكانات الإصلاح الشاملة واحتمالية الآثار الصحية تأخير من شأنه أن يمثله الضرر المتبقية تقاس فقط في 24 ساعة، وبالمقارنة مع واحدة لوحظ في نقطة زمنية الأولية (ر = 0) 13-15 (الشكل 4).

    منذ معروفة مستويات γH2AX القاعدية لزيادة في الحيوانات القديمة أو خلايا هرمة 20، لتفسير أكثر دقة من النتائج التي تم الحصول عليها في دراسات التعرض الماوس على المدى الطويل (> 6 أشهر) باستخدام طريقة وصفها، عشراستخدام البريد من مجموعة غير المعالجة الشباب، بالإضافة إلى عنصر تحكم العمر المتطابقة، سيكون من المستحسن. على الرغم من أن بعض التقارير تشير إلى أن γH2AX قد يزيد في الخلايا المتكاثرة، التي لن تكون ذات صلة DNA جهاز تسوية المنازعات، وهذا يمكن بسهولة أن يسيطر عليها قياس S-مرحلة وG2 / M-المرحلة كسور الخلية باستخدام رسوم بيانية DNA (الشكل 2A، D). إذا كانت بعض الظروف التجريبية لا يزال يمنع الباحث من استخدام γH2AX كعلامة من الحمض النووي من التلف (وذلك للأسباب المبينة أعلاه أو الجمع بينهما)، وآخر البروتين تشكيل DNA الضرر البؤر، مثل 53BP1، ويمكن استخدامها 21.

    على الرغم من أننا لم حاول استخدام هذا الأسلوب لأنسجة غير اللمفاوية، مثل العضلات والقلب والدماغ وغيرها، فإنه يبدو من الصعب معالجتها لالتدفق الخلوي. سوف أقسام الأنسجة والفحص المجهري لγH2AX بؤر العد يكون الأسلوب المفضل، إذا كنت بحاجة تحليل هذه الأنسجة. ومع ذلك، الخلايا اللمفاوية الأخرى، مثل الطرفية الدم لymphocytes، الخلايا الليمفاوية نخاع العظم أو thymocytes، ويمكن استخدامها لقياس مستويات γH2AX من خلال طريقة وصفها. وميزة استخدام الخلايا الليمفاوية والطحال هي البساطة النسبية للإعداد تعليق خلية وعدد كبير من الخلايا التي يمكن عزلها من الطحال. هذا يصبح أكثر فائدة إذا تم تضمين النقاط النهائية إضافية في الدراسة. في تجربتنا، وهو عائد نموذجية من splenocytes في الماوس يسمح لجمع ما لا يقل عن 10 قسامات، كل مناسبة لأي نوع من المقايسات التالية: التدفق الخلوي، RT-QPCR عن الجينات أو ميرنا التعبير، لطخة غربية، الحمض النووي الجيني للالدليل السياسي الشامل مثيلة فحص. وبالتالي، قسامات خلية طحالية الإضافية التي تم جمعها في موازاة تلك لγH2AX نقطة النهاية التي يمكن استخدامها لقياس التعبير عن جينات لها دور في الحمض النووي من التلف مما يشير الى وإصلاح الردود. هذه الجينات كما GADD45A وCDKN1A، التي عادة ما تكون transcriptionally يصل ينظم ردا على العلاجات السامة للخلايا 22، قد توفر دليل على شحذخلايا لها ويستجيب بشكل صحيح لتأثير الإجهاد صعبة. وبالمثل، يمكن تقدير مستويات البروتين والتعديلات بعد متعدية المشاركة في استجابات التوتر. وأخيرا، وليس من المتوقع أن أيا من الخطوات لإجراء الاستخراج، إذا أجريت كما هو موضح هنا، يمكن أن تحفز γH2AX في splenocytes.

    وسيكون من المفيد ويوصى بشدة أن يجرب الأعضاء والأنسجة إضافية خلال التضحيات لاستكمال البيانات الضرر وإصلاح الحمض النووي التي تم الحصول عليها عن splenocytes حسب بروتوكول المعروضة مع غيرها من النقاط النهائية. على سبيل المثال، نقوم بجمع روتيني خلايا نخاع العظام للفي الجسم الحي نخاع العظام للفئران الاختبار، الأنسجة المختلفة للالمرتبط الشيخوخة β غالاكتوزيداز وإصلاح الحمض النووي القياسات التعبير الجيني. القدرة على جمع الأنسجة الأخرى أن تعتمد على الدعم التقني المتاح خلال التضحيات. ومع ذلك، يمكن أن يساعد بشكل كبير في التفسير الصحيح للنتائج وبناء موالفصل أكثر بيولوجيا الصورة النظامية ذات الصلة من الاستجابة لعلاج انخفاض مستوى قيد التحقيق.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    HTO: tritiated water, [3H] locally obtained from a nuclear reactor  stock activity 3.7 GBq/mL;  can be substituted with HTO from Perkin Elmer
    OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) Perkin Elmer NET348005MC 1 mCi/ml (185 MBq)
    OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium Perkin Elmer NET004005MC 1 mCi/ml (185 MBq)
    OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) Perkin Elmer NET323005MC 1 mCi/ml (185 MBq)
    tritiated water, [3H] (HTO) Perkin Elmer NET001B005MC substitute for HTO of local origin  
    GammaBeam 150 irradiator Atomic Energy of Canada Limited locally manufactured can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity 
    Tween-20 Sigma Aldrich P1379-500ML
    RPMI Fisher Scientific SH3025501 Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL
    fetal bovine serum Sigma Aldrich F1051-100ML
    anti-gH2AX antibody, clone JBW301 Millipore 05-636
    Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody Life Technologies (formerly Invitrogen) A21121
    propidium iodine Sigma Aldrich P4864-10ML 1 mg/ml
    ethanol Commercial Alcohols P006-EAAN 500 ml bottles Absolute Ethanol
    1.5 ml tubes Fisher Scientific 2682550 microcentrifuge tubes
    15 ml tubes Fisher Scientific 05-539-5 sterile polypropylene centrifuge tubes
    liquid nitrogen Linde P110403
    12 x 75 mm uncapped glass tubes Fisher Scientific K60B1496126 disposable borosilicate glass tubes with plain end
    T25 flasks VWR CA15708-120 nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)
    scissors Fine Science Tools 14068-12 Wagner scissors 12 cm sharp/sharp
    forceps, straight Fine Science Tools 11008-13 Semken forceps 13 cm, straight
    forceps, curved Fine Science Tools 11003-12 Narrow Pattern forceps 12 cm, curved
    60 mm petri dishes VWR CA25382-100 BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm
    cell strainers, 70 mm Fisher Scientific 08-771-2 Falcon cell strainers 50/case
    PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. Sigma Aldrich P4417-100TAB Phosphate Buffered Saline Tablets
    TBS recipe: to make 10x stock
    30 g TRIS HCl Sigma Aldrich T3253-1KG Trizma hydrochloride
    88 g NaCl Fisher Scientific S271-500 Sodium Chloride
    2 g KCl Fisher Scientific P217-500 Potassium Chloride
    Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
    2. Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
    3. Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
    4. Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
    5. Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
    6. Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
    7. Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
    8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
    9. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
    10. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
    11. Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
    12. Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
    13. Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
    14. Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
    15. Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
    16. Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
    17. Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
    18. Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
    19. Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
    20. Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
    21. Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
    22. Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).

    Tags

    علم الأحياء الجزيئي، العدد 101، الحمض النووي من التلف، DNA المزدوج حبلا فواصل، وإصلاح الحمض النووي، γ-H2AX، منخفضة من الإشعاع جرعة، التريتيوم، β - الإشعاع، γ للإشعاع، والتعرض المزمن، وتدفق الخلوي،
    قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة<em&gt; في فيفو</em&gt; التعرض لجرعات منخفضة جدا من بيتا وغاما والأشعة السينية
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Flegal, M., Blimkie, M. S., Wyatt,… More

    Flegal, M., Blimkie, M. S., Wyatt, H., Bugden, M., Surette, J., Klokov, D. Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation. J. Vis. Exp. (101), e52912, doi:10.3791/52912 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter