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Biology

जीर्ण बाद माउस Splenocytes डीएनए में नुकसान और मरम्मत मापने Published: July 3, 2015 doi: 10.3791/52912
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

Abstract

कम खुराक विकिरण जोखिम उच्च विकिरण खुराक द्वारा उत्पादित प्रभाव से मात्रा और गुणवत्ता में अलग हैं कि जैविक प्रभाव की एक किस्म का उत्पादन कर सकते हैं। एक उचित और वैज्ञानिक रूप से उचित ढंग से, पर्यावरण व्यावसायिक और सार्वजनिक स्वास्थ्य सुरक्षा से संबंधित सवालों को संबोधित भारी सही रूप में इस तरह के विकिरण और रासायनिक पदार्थों आयनीकरण के रूप में कम खुराक प्रदूषण, का जैविक प्रभाव को मापने की क्षमता पर निर्भर करता है। डीएनए की क्षति और मरम्मत के कारण इस तरह के कैंसर के रूप में उनके संभावित दीर्घकालिक परिणामों के लिए स्वास्थ्य जोखिम का सबसे महत्वपूर्ण जल्दी संकेतक हैं। यहाँ हम माउस तिल्ली कोशिकाओं में डीएनए की क्षति और मरम्मत पर γ- और β-विकिरण की खुराक कम करने के लिए इन विवो जोखिम में जीर्ण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। डीएनए डबल कतरा टूट की एक सामान्य स्वीकार मार्कर का उपयोग करना, γH2AX बुलाया phosphorylated हिस्टोन H2AX, हम इसे डीएनए की क्षति का न केवल स्तर का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदर्शन कैसे, लेकिन यह भी बदलता हैडीएनए की मरम्मत की क्षमता में संभावित विवो जोखिम में कम खुराक द्वारा उत्पादित। नमूनों की एक बड़ी संख्या में immunofluorescently में लेबल γH2AX के तेजी से, सही और विश्वसनीय माप की अनुमति देता प्रवाह cytometry। डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (डीएनए की मरम्मत को गति प्रदान करने के लिए टूट के लिए पर्याप्त संख्या में निर्माण करने के लिए 2 Gy की एक चुनौतीपूर्ण खुराक के लिए निकाले splenocytes उजागर करके और प्रेरित (1 घंटा के बाद विकिरण) और अवशिष्ट डीएनए की क्षति को मापने के द्वारा 24 घंटे का मूल्यांकन किया जा सकता है बाद के विकिरण)। अवशिष्ट डीएनए की क्षति अधूरा मरम्मत और लंबी अवधि के जीनोमिक अस्थिरता और कैंसर के जोखिम का संकेत होगा। आसानी से vivo अध्ययन (जैसे, गुणसूत्र aberrations, अस्थि मज्जा reticulocytes में micronuclei आवृत्तियों, जीन अभिव्यक्ति, आदि) में ऐसे में मापा जा सकता है कि अन्य assays और अंत अंक के साथ संयुक्त, इस दृष्टिकोण जैविक प्रभाव का एक सटीक और प्रासंगिक मूल्यांकन की अनुमति देता है का स्तर कम तनाव।

Introduction

(मास मीडिया द्वारा exacerbated) विकिरण और हिरोशिमा और नागासाकी परमाणु बम विस्फोट की और दुर्लभ परमाणु संयंत्र दुर्घटनाओं की छवियों द्वारा संचालित विकिरण की जनता का डर, आयनीकरण की कम या बहुत कम मात्रा या तो की संभावित हानिकारक प्रभाव से अधिक महत्वपूर्ण विवाद, करने के लिए प्रेरित किया है बहुत सख्त विकिरण सुरक्षा विनियमन और संभावित वैज्ञानिक दृष्टि से उचित नहीं हैं कि मानकों। पिछले तीन दशकों में, कई रिपोर्टों हानिकारक की कमी और कम खुराक विकिरण 1-4 से प्रेरित संभावित लाभकारी जैविक प्रभाव की उपस्थिति दोनों दस्तावेज है। प्रमुख विकिरण स्वास्थ्य जोखिम कारक विकिरण के उच्च या मध्यम खुराक प्राप्त परमाणु बम के बचे के महामारी विज्ञान के अध्ययन के आधार पर अनुमान लगाया गया कैंसर की संभावना है। (ताकि रैखिक कोई सीमा या LNT मॉडल कहा जाता है) इन आंकड़ों के रैखिक एक्सट्रपलेशन कम मात्रा में कैंसर के जोखिम आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण दुनिया भर में व्यापक वैज्ञानिक स्वीकृति प्राप्त नहीं हुआ हैऔर भारी 5 बहस हो रही है।

यह और अधिक अध्ययनों से इस मुद्दे को स्पष्ट और संभवतः विकिरण संरक्षण के मानकों में सुधार करने की आवश्यकता है कि स्पष्ट है। इस तरह के अध्ययन डीएनए की क्षति दरें, डीएनए की मरम्मत और उत्परिवर्तजनन के रूप में और इस तरह के अंत अंक (मानव को प्रभाव extrapolating के लिए सबसे अच्छा) विवो पशु मॉडल में पुरानी उपचार (पर्यावरण और व्यावसायिक जोखिम का सबसे अच्छा सन्निकटन), को शामिल करना चाहिए। यह डीएनए उत्परिवर्तजनन और कैंसर के विकास में 6 को जन्म दे सकती विकिरण के प्रभाव और अधूरी या गलत मरम्मत को नुकसान पहुँचाए के लिए प्राथमिक लक्ष्य है कि जाना जाता है।

डीएनए डबल कतरा विराम (डीएसबी) डीएनए घावों के सबसे हानिकारक प्रकार के होते हैं और कोशिका मृत्यु और tumorigenesis के 7 को जन्म दे सकती। यह इसलिए महत्वपूर्ण है, मज़बूती से और सही ढंग से कम खुराक विकिरण और / या इस तरह के रासायनिक प्रदूषण के रूप में अन्य तनाव, से संपर्क के बाद डीएसबी के स्तर को मापने के लिए सक्षम हो जाता है। सबसे संवेदनशील और विशिष्ट मार्करों में से एकडीएनए डीएसबी के γH2AX 8 कहा जाता है, phosphorylated हिस्टोन H2AX है, फिर भी अन्य मार्करों और तरीकों 9,10 सुझाव दिया गया है। यह H2AX अणुओं के हजारों, एक प्रेरित डीएसबी के आसपास के क्षेत्र में, एक विरोधी γH2AX एंटीबॉडी और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 11 के साथ Immunofluorescent लेबलिंग करने से व्यक्ति डीएसबी का पता लगाने के लिए सक्षम करने γH2AX के गठन में शामिल कर रहे हैं कि अनुमान लगाया गया है। प्रतिक्रिया मिनट 30 और 60 के बीच इसकी अधिकतम तक पहुंच गया है, बहुत जल्दी है। साक्ष्य γH2AX टूट की साइटों के लिए अन्य मरम्मत कारकों को आकर्षित करने और टूटे डीएनए समाप्त होता है लंगर और (12 में समीक्षा) अन्य मरम्मत प्रोटीन के लिए पहुँच प्रदान करने के क्रोमेटिन संरचना को संशोधित करके डीएनए डीएसबी की मरम्मत की सुविधा है कि मौजूद है। डीएनए डीएसबी की मरम्मत के पूरा होने पर, γH2AX-phosphorylated डे और / या गिरावट से होकर गुजरती है, और नए संश्लेषित H2AX अणुओं क्रोमेटिन 10 के प्रभावित क्षेत्रों में γH2AX की जगह हो जाता है। ΓH2AX के गठन और नुकसान कर सकते हैं निगरानी,इसलिए, डीएनए डीएसबी मरम्मत कैनेटीक्स का सही अनुमान प्रदान करते हैं। यह दृष्टिकोण radiosensitivity 13-15 के साथ सहसंबंधी दिखाया गया है विकिरण और इसकी दर और अवशिष्ट डीएसबी के स्तर की उच्च खुराक के साथ विकिरणित विभिन्न मानव ट्यूमर सेल लाइनों में डीएसबी की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

हम इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण संशोधित और डीएनए डीएसबी स्तर और मरम्मत (चित्रा 1) पर पुरानी γ- और β-विकिरण की खुराक कम के प्रभाव की जांच करने के लिए एक इन विवो माउस अध्ययन करने के लिए आवेदन किया। सबसे पहले, हम पीने के पानी में भंग β-विकिरण के tritiated पानी (HTO) के रूप में या तो ट्रिटियम द्वारा उत्सर्जित (हाइड्रोजन-3) के रूप में या बवाल बाध्य ट्रिटियम (OBT) चूहों की एक लंबी अवधि पुरानी जोखिम प्रदर्शन करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन । दो रूपों जमा और / या अलग ढंग से शरीर में है और इसलिए वितरण, विभिन्न जैविक प्रभाव उत्पन्न करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं। दोनों रूपों परमाणु उद्योग में संभावित खतरों रहे हैं। इस उपचारउनके रिश्तेदार जैविक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है जो दो विकिरण प्रकार की एक सही तुलना की अनुमति के लिए एक बराबर खुराक दर पर γ विकिरण को पुरानी जोखिम से paralleled है। बीटा-विकिरण γ विकिरण, उच्च ऊर्जा फोटॉनों से यह बहुत अलग है, जिससे इलेक्ट्रॉनों से बना है। इस वजह से यह अंतर करने के लिए, Β-विकिरण ज्यादातर आंतरिक स्वास्थ्य के लिए खतरा प्रतिनिधित्व करता है और γ विकिरण की तुलना में अलग अलग जैविक प्रभाव उत्पन्न कर सकते हैं। इस जटिलता β-विकिरण के HTO द्वारा उत्सर्जित लोगों तक पहुंचाने के नियमन से अधिक महत्वपूर्ण विवादों में हुई। इस प्रकार, जनता के लिए पीने के पानी में HTO के नियामक का स्तर यूरोप में 100 BQ / एल से ऑस्ट्रेलिया में 75,000 BQ / एल से बदलती हैं। यह γ विकिरण के बराबर खुराक के लिए HTO का जैविक प्रभाव तुलना करने के लिए है, इसलिए महत्वपूर्ण है। दूसरे, डीएनए डीएसबी की दर immunofluorescently का पता लगाने के γH2AX में लेबल का उपयोग कर पुरानी जोखिम के पूरा होने पर पृथक splenocytes में मापा जाता हैफ्लो द्वारा एड। इस vivo में जोखिम के कारण डीएनए क्षति की सीमा के मूल्यांकन की अनुमति देता है। हालांकि, यह इस तरह के कम स्तर जोखिम डीएनए डीएसबी के किसी भी detectable दरों का उत्पादन नहीं हो सकता है उम्मीद है कि समझदार है; इसके बजाय, कुछ छिपा परिवर्तन / प्रतिक्रियाओं का डीएनए की क्षति की मरम्मत के लिए कोशिकाओं की क्षमता को प्रभावित करती है कि उम्मीद की जा सकती है। ये परिवर्तन, अगर मिल गया, हो सकता है या तो उत्तेजक (एक हानिकारक प्रभाव उत्पादन) (एक लाभदायक प्रभाव उत्पादन) या निरोधात्मक। प्रस्तावित प्रोटोकॉल नुकसान का एक महत्वपूर्ण राशि है कि उत्पादन विकिरण के एक उच्च खुराक के साथ निकाली splenocytes चुनौती देने के द्वारा इस तरह के बदलाव का खुलासा अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, 2 Gy के लगभग 50 सेल प्रति डीएनए डीएसबी या एक 3 उत्पादन -। कुल γH2AX स्तर में 5 गुना वृद्धि) । इसके बाद, डीएसबी मरम्मत की दीक्षा और पूरा होने को दर्शाती गठन और γH2AX की हानि, फ्लो द्वारा नजर रखी है। इस तरह, बेसल और डीएनए डीएसबी के उपचार प्रेरित स्तरों न केवल मापा जाता है, लेकिन हो सकता हैयह भी कोशिकाओं की क्षमता पर इसके संभावित प्रभाव प्रतिक्रिया करने के लिए और मरम्मत के डीएनए की क्षति बहुत अधिक तनाव के स्तर से प्रेरित किया।

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Protocol

सभी माउस हैंडलिंग और उपचार प्रक्रिया एक स्थानीय पशु की देखभाल समिति द्वारा विधायिका और / या जानवरों की देखभाल के कार्यक्रमों द्वारा निर्धारित और मंजूरी दे दी नियमों का पालन करना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी तरीकों स्थानीय पशु की देखभाल समिति के अनुमोदन के साथ पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।

चेतावनी: रेडियोधर्मिता के साथ सभी काम (सहित, लेकिन रेडियोधर्मी जानवरों के ऊतकों, बिस्तर कचरे से निपटने, ट्रिटियम की हैंडलिंग, बाहरी γ विकिरण तक सीमित नहीं) विधायिका और / या विकिरण सुरक्षा अधिकारियों द्वारा निर्धारित नियमों का पालन करना चाहिए और अधिकृत द्वारा निष्पादित किया एक प्रमाणित प्रयोगशाला और / या सुविधा में कर्मियों।

1. पशु कार्य

  1. पशु समूहन
    1. चूहों के लिए एक बाहरी संगठन से आ रहे हैं, जानवरों की सुविधा में कम से कम 10 दिनों के लिए जानवरों जलवायु के अनुकूल बनाना। अध्ययन के लिए कई उपचार समूहों में शामिल हैं, पशु आपूर्तिकर्ता अल भेज सकते हैं कि यह सुनिश्चित करने केएक ही बैच के रूप में एल जानवरों।
    2. बेतरतीब ढंग से समूह में 10 चूहों के उपचार के समूहों के लिए चूहों का आवंटन। C57BL 6 / तनाव के पुरुष चूहों का उपयोग करते हैं, तो आक्रामकता मुद्दों को कम करने के लिए अपनी सुविधा में बहुत युवा C57BL 6 / पुरुषों के यादृच्छिकीकरण पूर्व की व्यवस्था पशु आपूर्तिकर्ता है।
  2. आंतरिक β विकिरण चूहों की पुरानी जोखिम
    1. HTO और OBT समाधान (tritiated प्रोलाइन, एलनाइन और ग्लाइसिन अमीनो एसिड का एक मिश्रण) का मूल स्टॉक गिराए द्वारा माउस पीने के पानी में काम कर ट्रिटियम की सांद्रता (10 kBq / एल और 1 MBq / एल) तैयार करें।
    2. एक तरल जगमगाहट काउंटर का उपयोग रेडियोधर्मिता मापने के द्वारा पीने के पानी में ट्रिटियम का अंतिम सांद्रता मान्य। यदि आवश्यक हो, सांद्रता समायोजित करें।
    3. ट्रिटियम पानी के लिए उपयोग यथेच्छ प्रदान करके एक महीने के लिए पशुओं का इलाज। उपचार पानी दो सप्ताह की अवधि के दौरान कम हो जाता है, अधिक पानी जोड़ें। अन्यथा, दो सप्ताह में बोतलों बदल जाते हैं।
    4. दावत नकली विकिरणित नियंत्रणचूहों हूबहू। एक अलग "" साफ कमरे में या हवा से ट्रिटियम पार संक्रमण से बचने के लिए सकारात्मक हवा के दबाव के तहत एक अलग "साफ" रैक पर रखें।
  3. बाहरी γ विकिरण चूहों की पुरानी जोखिम
    नोट: γ विकिरण सुविधा / उपकरण स्थान के आधार पर अलग अलग होंगे।
  4. Dosimetry के उपलब्ध तरीकों का उपयोग करना, यात्रा की खुराक दरों उत्पादन विकिरण क्षेत्रों है कि एक γ विकिरण स्रोत से दूरी का निर्धारण। पशु पिंजरों को कवर क्षेत्रों में विकिरण क्षेत्रों की एकरूपता सुनिश्चित करें।
    नोट: 1.7 μGy / एच 1 MBq / शरीर में एल ट्रिटियम द्वारा उत्पादित एक खुराक दर के बराबर है।
  5. एक महीने के लिए कदम 1.3.1 में निर्धारित दूरी पर माउस पिंजरों रखकर चूहों को बेनकाब। 30 मिनट के लिए γ विकिरण के दैनिक रुकावट न्यूनतम। कुल अवशोषित खुराक को मापने के लिए thermoluminescence dosimeters का प्रयोग करें।

2. बलिदान और सैम्पलिंग

डाला 70 माइक्रोन सेल strainers, 15 मिलीग्राम और 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के साथ बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों, 60 मिमी पेट्री डिश तैयार करें, सब एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और जगह के साथ पूरक RPMI मीडिया। काम के बाँझपन सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है।
  • प्रत्येक 60 मिमी पेट्री डिश में RPMI मीडिया के 5 एमएल बांटना।
  • स्थानीय पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित एक विधि का उपयोग चूहों बलिदान। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था इस प्रोटोकॉल में वर्णित splenocyte काम के लिए एक अच्छा विकल्प है। (MFISH, cytochalasin ब्लॉक micronucleus या अन्य आम genetoxicity assays के लिए उदाहरण के लिए,) अन्य assays के लिए रक्त के नमूने की आवश्यकता होती है, तो हालांकि, isoflurane के साथ संज्ञाहरण के बाद इंट्रा-हृदय पंचर का उपयोग करें।
  • सिर आप से दूर ओर इशारा करते हुए के साथ, पृष्ठीय लेटना में पशु रखें। 70% इथेनॉल के साथ माउस नीचे स्प्रे। संदंश का प्रयोग, मूत्रमार्ग खोलने के लिए पूर्व से त्वचा को पकड़ो और perineal क्षेत्र में कैंची के साथ एक छोटा सा चीरा बनाते हैं। इस चीरा से, केवल नीचे पेशी दीवार त्वचा में कटौती और नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है, छाती गुहा को उदर midline के साथ काटा। Midline से दूर त्वचा काटना।
  • संदंश के साथ पेट की दीवार समझ और उदर गुहा को खोलने के लिए पेशी दीवार के मंझला अक्ष के साथ काटा।
  • हल्के से एक साथ कैंची से संयोजी ऊतक दूर काटने, जबकि उस पर खींच धीरे बाँझ संदंश के साथ यह मनोरंजक और से तिल्ली आबकारी।
  • एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में तिल्ली (प्लीहा के लगभग 1/10) और जगह का एक छोटा सा टुकड़ा काट। स्नैप अनुपूरक assays के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर बाद में भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्रीज।
  • पूर्व तिरस्कृत RPMI मीडिया के 5 एमएल के साथ एक 60 मिमी पेट्री डिश के अंदर एक सेल झरनी में तिल्ली के शेष रखें।
  • अगले माउस के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: निकाले spleens मीडिया के साथ 60 मिमी बर्तन में रखा जा सकता है चूहों के बाकी sacrific रहे हैं, जबकि (अप करने के लिए 2 घंटे के लिए)एड। 5 और 15 चूहों के बीच, भाग लेने वाले लोगों की संख्या पर निर्भर करता है कि एक दिन में कार्रवाई की जा सकती है।

    • Splenocyte संस्कृति की 3. तैयारी

    1. एक घुमावदार अंत के साथ बाँझ संदंश के साथ एक सेल झरनी के अंदर नख़रेबाज़ द्वारा तिल्ली homogenize।
    2. सेल झरनी निकालें और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 60 मिमी पकवान से फ़िल्टर सेल निलंबन इकट्ठा।
    3. कोशिकाओं के शेष इकट्ठा करने के लिए मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ सेल झरनी कुल्ला।
    4. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब।
    5. छानना सतह पर तैरनेवाला और RPMI के 10 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित।
    6. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब।
    7. छानना सतह पर तैरनेवाला और RPMI के 5 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित।
    8. एक 25 मिलीलीटर टिशू कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरण सेल निलंबन के 4 मिलीलीटर और सीओ 2 इनक्यूबेटर से हटा दें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 80% आर्द्रता)

    4. विकिरण चुनौतीपूर्ण और फिक्सिंग

    1. स्थानांतरण4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर बर्फ और सेंट्रीफ्यूज पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कदम 3.8 से सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर शेष। इस नमूने में मापा डीएनए की क्षति एक डीएनए की मरम्मत की अवस्था के निर्माण के लिए दोनों उपचार प्रेरित नुकसान और = 0 टी डेटा सूत्रीय का प्रतिनिधित्व करेंगे।
    2. ध्यान से एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला महाप्राण। धीरे टीबीएस बफर (20 मिमी Tris 7.4 पीएच, 150 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl) के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। ध्यान से एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला महाप्राण। धीरे टीबीएस के 300 μl में गोली फिर से निलंबित।
    4. कम गति पर एक भंवर पर जबकि मिश्रण, -20 डिग्री सेल्सियस 100% इथेनॉल के 700 μl जोड़ें। ढक्कन बंद करें और मिश्रण करने के लिए एक बार कुछ पलटना।
    5. -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान। इथेनॉल में तय Splenocytes γH2AX संकेत में किसी भी ध्यान देने योग्य हानि के बिना कम से कम 12 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
    6. एक चुनौतीपूर्ण γ रेड के साथ कदम 3.8 से splenocyte संस्कृतियों चमकाना उपलब्ध विकिरण उपकरण का उपयोग कर एक खुराक दर ≥ 200 MGY / मिनट पर 2 Gy की iation खुराक।
      नोट: इस विकिरण का उद्देश्य मरम्मत मशीनरी चुनौती देने के लिए डीएनए डीएसबी प्रेरित करने के लिए है। एक्स-रे भी इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    7. इसके तत्काल बाद सीओ 2 इनक्यूबेटर संस्कृतियों वापसी।
    8. 1 घंटे चुनौतीपूर्ण 2 Gy के विकिरण के बाद, एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट को इनक्यूबेटर से संस्कृतियों को हटा दें। एक प्रतिनिधि नमूने विभाज्य इकट्ठा करने के लिए, धीरे बर्फ पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक pipettor और सेल निलंबन के स्थानांतरण 1 मिलीलीटर का उपयोग कोशिकाओं को फिर से रोक देते हैं। सीओ 2 इनक्यूबेटर करने के लिए सेल संस्कृतियों लौटें।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। ध्यान से एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला महाप्राण। धीरे टीबीएस के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित।
    10. दोहराएँ 4.3 कदम - 4.5।
    11. 24 बजे चुनौतीपूर्ण 2 Gy के γ विकिरण, कटाई के बाद और कदम 4.8 में वर्णित के रूप में 24 बजे नमूना = पर ठीक कर - 4.10।
    TLE "> 5। विरोधी γH2AX एंटीबॉडी के साथ Immunofluorescent लेबल

    नोट: आमतौर पर, 15 - प्रति दिन 30 नमूने immunofluorescently लेबल और एक ही समय में प्रवाह cytometry द्वारा assayed किया जा सकता है। उपचार समूहों के बीच एक सटीक तुलना सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक समूह से नमूना (एस) शामिल हैं। भी अधिक जानकारी के लिए 16 संदर्भ देखें।

    1. बर्फ पर एक लेबल नमूनों की संख्या के लिए ट्यूबों के सेट संसाधित करने के लिए और जगह तैयार करें। 12 x 75 मिमी uncapped ग्लास ट्यूब का प्रयोग करें। बाँझपन इस कार्य के लिए आवश्यक नहीं है। ("2 अब केवल") केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग के लिए एक अतिरिक्त ऐतिहासिक नियंत्रण नमूना शामिल करें। एक अध्ययन के भीतर चला cytometry के हर प्रवाह में इस ऐतिहासिक नियंत्रण नमूना का प्रयोग करें।
    2. प्रत्येक ट्यूब ठंडा टीबीएस के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 5 सेकंड के लिए -20 डिग्री सेल्सियस, भंवर से तय splenocytes निकालें और टीबीएस के साथ तैयार ट्यूबों के लिए एक 0.5 मिलीलीटर विभाज्य हस्तांतरण। -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण में वापस नमूने के शेष रखें औरएक बैकअप नमूने के रूप में रहते हैं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र splenocytes। सतह पर तैरनेवाला छानना और धीरे 1% FBS युक्त ठंडा टीबीएस के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। TST बफर (टीबीएस में 0.05% ट्राइटन X-100, 2% एफ बी एस) के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित धीरे सतह पर तैरनेवाला छानना और। बर्फ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला छानना और धीरे 1 पतला प्राथमिक विरोधी γH2AX एंटीबॉडी के 200 μl में गोली फिर से निलंबित: TST बफर में 150। "2 अब केवल" नियंत्रण नमूना के लिए TST के 200 μl का प्रयोग करें।
    7. 45 का एक कोण पर एक घूर्णन प्रकार के बरतन पर स्थिति ट्यूबों - 60 डिग्री और आरटी पर 300 XG पर 1.5 घंटे के लिए हिला।
    8. TST बफर में 200 कमजोर पड़ने: ट्यूबों incubating कर रहे हैं, एक 1 पर एलेक्सा-488 के साथ संयुग्मित बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी की पर्याप्त मात्रा (200 μl / नमूना) तैयार करते हैं।
      नोट: एलेक्सा-488 को शामिल सभी का कामसंयुग्मित एंटीबॉडी (5.10 नीचे 5.16 करने के लिए कदम) मंद प्रकाश शर्तों के तहत किया जाना चाहिए और लेबल नमूने एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूबों लपेटकर द्वारा प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
    9. 1.5 बजे ऊष्मायन पूरा हो जाने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर प्रत्येक ट्यूब और अपकेंद्रित्र करने के लिए 2% FBS युक्त ठंडा टीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 2% FBS युक्त टीबीएस के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित धीरे सतह पर तैरनेवाला छानना और।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। कदम 5.8 से माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 μl में गोली फिर से निलंबित धीरे सतह पर तैरनेवाला छानना और।
    11. कदम 5.7 में के रूप में 1 घंटे के लिए एक मिलाते हुए मंच पर नमूने सेते हैं।
    12. 1% FBS युक्त ठंडा टीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला छानना और धीरे ठंडा टीबीएस के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित।
    14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला छानना और धीरे 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर युक्त टीबीएस के 0.5 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबितप्रोपीडियम आयोडाइड।
    15. प्रकाश से सुरक्षित आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    16. साधन-विशिष्ट प्रोटोकॉल 16 का उपयोग एक प्रवाह cytometer पर नमूनों का विश्लेषण। नमूना प्रति कम से कम 10,000 कोशिकाओं पढ़ें।

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    Representative Results

    Splenocytes के लिए उम्मीद की रेखांकन यहाँ वर्णित विधि का उपयोग कर तैयार cytometry, चित्रा 2 प्रवाह के उदाहरण से पता चलता है। कोशिकाओं पहले <इलेक्ट्रॉनिक मात्रा साइड तितर बितर> तितर बितर साजिश के आधार पर gated हैं (2A चित्रा और 2 डी, इलेक्ट्रॉनिक मात्रा आगे तितर बितर करने के लिए बराबर है)। FL3 / propidium आयोडीन histograms (चित्रा 2 बी और 2 ई) सामान्य कोशिका चक्र वितरण की पुष्टि करें। FL1 चैनल उपयोग कर की गणना γH2AX संकेत मतलब अनुपचारित नियंत्रण (चित्रा -2) की तुलना में कोशिकाओं (चित्रा 2 एफ) किरणित 2-Gy के डीएनए में डीएसबी में एक> 2 गुना वृद्धि की पुष्टि करता है। अगला, हम immunofluorescently माउस splenocytes में प्रवाह cytometry द्वारा γH2AX में लेबल को मापने का वर्णित विधि की संवेदनशीलता की जांच की। चित्रा 3 ए माउस splenocytes में γH2AX स्तर, डीएनए डीएसबी का संकेत, से पता चलता है के लिए पूर्व vivo प्रदर्शन के बाद 1 घंटा या तो कम (0.1Gy) या अनुपचारित नियंत्रण करने के लिए γ विकिरण रिश्तेदार की उच्च (2 Gy) खुराक। यह 0.1 Gy के डीएसबी स्तर में मामूली वृद्धि प्रेरित किया और कहा कि वृद्धि सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था कि देखा जा सकता है। मजबूत 3 गुना प्रेरण होने की उम्मीद है और 2 Gy के प्रदर्शन के बाद पता चला था। प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में γH2AX Immunofluorescent लेबलिंग की विशिष्टता को मान्य करने के लिए, लेबल कोशिकाओं एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ जांच की गई। मनाया चिह्नित foci पैटर्न की तरह प्रतिदीप्ति संकेत क्रोमेटिन भीतर अलग-अलग डीएनए डीएसबी (3B चित्रा) से निकलती है कि इंगित करता है।

    डीएनए डीएसबी दर के आकलन और tritiated पानी की बहुत कम मात्रा (10 kBq / एल) के लिए एक महीने के लिए खुल चूहों के splenocytes में उनकी मरम्मत के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं। यह (चित्रा -4 ए) कि देखा जा सकता है, हालांकि उपचार बेसल γH2AX स्तर की एक 10% वृद्धि हुई, परिवर्तन नहीं थाटी सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (एन = 5, एक नमूना छात्र के टी परीक्षण)। इसके अलावा, डीएनए डीएसबी मरम्मत के कैनेटीक्स का प्रतिनिधित्व चुनौतीपूर्ण 2 Gy के विकिरण के बाद मापा गठन और γH2AX की हानि, नियंत्रण और HTO इलाज चूहों (4B चित्रा) से कोशिकाओं के बीच अलग नहीं था।

    चित्र 1
    चित्रा 1. प्रायोगिक आरेख डीएनए की क्षति और डीएनए की मरम्मत पर पुरानी vivo में विकिरण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए। समय के एक वांछित अवधि के लिए पुरानी विकिरण के साथ चूहों के vivo उपचार के बाद, चूहों बलिदान कर रहे हैं और splenocyte संस्कृतियों एक चुनौतीपूर्ण करने के लिए स्थापित किया है और सामने आ रहे हैं विकिरण। Splenocyte aliquots के एकत्र और चुनौतीपूर्ण खुराक के बाद विभिन्न समय पर तय कर रहे हैं। ΓH2AX का स्तर तो Immunofluorescent ला मापा का उपयोग कर रहे हैंbeling और फ्लो द्वारा पता लगाने। चित्रा के तल पर भूखंड की उम्मीद है और डेटा की एक योजनाबद्ध है। डीएनए की मरम्मत पूरा हो गया है यदि गामा-H2AX स्तर काफी जल्दी वापस नियंत्रण मूल्य के लिए एक कमी के बाद चुनौतीपूर्ण विकिरण के बाद बढ़ जाती है। डीएनए की क्षति Δ डीएनए डीएसबी की मरम्मत की क्षमता पर चूहों के उपचार के प्रभाव का प्रतिनिधित्व करता है चूहों और डीएनए की मरम्मत Δ की प्रयोगात्मक उपचार की वजह से उत्पादन क्षति का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2. प्रतिनिधि कच्चे डेटा प्रवाह cytometry। (ए, डी) splenocytes और सेल मलबे और एरिथ्रोसाइट्स के लिए तितर बितर भूखंडों और gating क्षेत्रों के। (बी, ई) कोशिका चक्र वितरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए डीएनए histograms। (डी एफ) में डेटा 2 Gy के γ विकिरण के साथ विकिरणित कोशिकाओं से प्राप्त की है और विकिरण के बाद 1 घंटे काटा गया, जबकि सेटों में डाटा (एसी), एक प्रतिनिधि अनुपचारित नियंत्रण तिल्ली कोशिकाओं से प्राप्त किया गया। एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण।

    चित्र तीन
    फ्लो द्वारा γ H2AX की चित्रा 3. डिटेक्शन संवेदनशील और विशिष्ट है। (ए) के हौसले पुरुष CBA चूहों से अलग Splenocytes γ विकिरण, या नकली का इलाज और 1 घंटे के लिए γH2AX प्रतिक्रिया विकसित करने की अनुमति के 0.1 या 2 या तो Gy के साथ विकिरणित किया गया। कोशिकाओं तो immunofluorescently, तय किया गयाविरोधी γH2AX एंटीबॉडी के साथ लेबल और फ्लो द्वारा विश्लेषण किया। एसडी ± सामान्यीकृत मतलब मूल्यों (एन = 12) दिखाए जाते हैं। * और *** पी <0.05 और पी <0.001, सम्मान से (एक नमूना छात्र के टी -test) के साथ सांख्यिकीय फर्क दर्शाता है। (बी) अनुपचारित नियंत्रण के प्रतिनिधि microphotographs (यूटी) या 2 Gy के immunofluorescently विरोधी γH2AX के साथ लेबल splenocytes किरणित एंटीबॉडी। हरी प्रतिदीप्ति के foci पैटर्न की तरह γH2AX के लिए Immunofluorescent लेबलिंग की विशिष्टता की पुष्टि करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    Tritiated पर wate चूहों के 1 महीने के जोखिम से उत्पादित प्रभाव का अभाव दिखा चित्रा 4. प्रतिनिधि परिणामडीएनए डीएसबी के स्तर पर और मरम्मत पर आर (HTO)। (ए) Splenocytes पानी और नियंत्रण जानवरों पीने में 10 kBq HTO की / एल के साथ इलाज चूहों से अलग थे। γH2AX के स्तर Immunofluorescent लेबलिंग का उपयोग करके मापा और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में प्रवाह cytometry किया गया था। एसडी ± नियंत्रण के उन लोगों के रिश्तेदार γH2AX प्रतिदीप्ति स्तर दिखा रहे हैं इसका मतलब (एन = 5)। इन आंकड़ों डीएनए डीएसबी मरम्मत के मूल्यांकन के लिए 3B चित्रा में इस्तेमाल किया गया था कि टी 0 = समय बिंदु से उत्पन्न किया गया। (बी) पृथक splenocytes γ विकिरण की एक चुनौतीपूर्ण 2 Gy खुराक से अवगत कराया गया और कोशिकाओं की aliquots में तय किया गया टाइम्स = 0 टी, चुनौतीपूर्ण विकिरण के बाद 1 और 24 बजे। अपने टी = 0 नियंत्रण करने के लिए γH2AX रिश्तेदार के प्रतिदीप्ति मतलब एसडी ± दिखाया गया है (एन = 5)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल विकिरण सहित विभिन्न रासायनिक और शारीरिक एजेंटों के निम्न स्तर के genotoxic प्रभाव की जांच vivo अध्ययन में बड़े पैमाने पर माउस के संचालन के लिए उपयोगी है। हमारे अद्वितीय विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त जानवरों की सुविधा एक GammaBeam 150 irradiator से लैस है और एक 30 मीटर लंबी विकिरण हॉल सैकड़ों या चूहों के भी हजारों पर कम या बहुत कम खुराक दर irradiations को शामिल जीवन भर के अध्ययन के संचालन की अनुमति देता है। जीर्ण कम खुराक विकिरण के लिए छोटे विकिरण सुविधाओं radiobiology पढ़ाई नियमित तौर पर आयोजित की जाती हैं और विकिरण सुरक्षा दिशा निर्देशों / नियमों के लागू कर रहे हैं, जहां एक विश्वविद्यालय या अस्पताल के वातावरण में स्थापित किया जा सकता है। हालांकि, सख्त नियमों को आम तौर पर इस तरह के ट्रिटियम के रूप में रेडिओन्युक्लिआइड, की हैंडलिंग, बाहर किया जाता है, जहां आंतरिक पशु विकिरण के लिए डिजाइन की सुविधा के लिए लागू होते हैं। हालांकि दुर्लभ, इस तरह के आंतरिक विकिरण जोखिम के अध्ययन के लिए प्रमाणित प्रयोगशालाओं विभिन्न पुन में मौजूदखोज संस्थानों दुनिया भर में व्यापक और उनके अद्वितीय क्षमताओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

    प्रोटोकॉल के भीतर, हम सही प्रयोगात्मक जोखिम द्वारा उत्पादित डीएनए डीएसबी दरों का मूल्यांकन करने के γH2AX की Immunofluorescent लेबलिंग का उपयोग करें। की तुलना में 24 घंटा में इससे भी महत्वपूर्ण बात, एक चुनौतीपूर्ण विकिरण की शुरूआत निकाले splenocytes करने के लिए पूर्व vivo को जन्म दिया है कि यह डीएनए डीएसबी प्रतिक्रिया (γH2AX स्तर चुनौती के बाद 1 घंटे में) की intactness मूल्यांकन करने के लिए संभव है और डीएनए डीएसबी मरम्मत का बनाता है (γH2AX स्तर 0 घंटा)। यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल प्रति γH2AX foci के मात्रा का ठहराव प्रवाह cytometry की तुलना में अधिक संवेदनशीलता प्रदान कर सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, इस gy सेल प्रति γH2AX foci के संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि का उत्पादन करने के लिए सूचित किया गया है के रूप में कम 0,001 के रूप में खुराक। हालांकि, γH2AX के फ्लो के आधार पर पता लगाने का उपयोग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण beca से अधिक लाभ प्रदान करता हैयह माप के लिए कम समय की आवश्यकता का उपयोग करें, यह अति विशिष्ट / प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता नहीं है और यह व्यक्तिपरक निर्णय लेने की γH2AX करने के लिए संबंधित मान्यता और गिनती foci से बचा जाता है। ये लाभ बड़े पैमाने पर जानवरों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं। विधि पीछा किया जाता है (चित्रा 1) सुझाव दिया कि अगर 10 उपचार समूहों और समूह में 10 चूहों के साथ एक ठेठ पशु प्रयोग, 100 एक्स 3 = 300 तिल्ली के नमूने का परिणाम देगा। नमूनों की इस संख्या से डेटा उत्पन्न करने के लिए, लगभग 100 बजे प्रवाह cytometry का उपयोग की आवश्यकता होगी। पुस्तिका सूक्ष्म विश्लेषण के द्वारा किया जाता है यदि वैकल्पिक रूप से, एक ही कार्य नमूना प्रति अत्यधिक मांग माइक्रोस्कोप समय के 40 मिनट की एक रूढ़िवादी अनुमान का उपयोग, कम से कम 300 घंटे लगेंगे। ΓH2AX foci के विश्लेषण और स्कोरिंग को स्वचालित करने के प्रयास को 17-19 कर दिया गया है, वे सभी सीमाओं की एक संख्या है। विशेष रूप से, गोल आकार और माउस splenocytes और लिम्फोसाइटों के छोटे आकार के व्यक्ति यह अव्यावहारिक सभी को हल करने के लिए बनाता हैidual γH2AX माइक्रोस्कोप foci। पक्षपाती कोशिकाओं को सफलतापूर्वक γH2AX foci के लिए स्वचालित माइक्रोस्कोपी प्रणाली के द्वारा बनाये जा चुकी है, कोई सफलता माउस splenocytes या लिम्फोसाइटों के लिए या तो प्रदर्शन किया गया है।

    फ्लो द्वारा γH2AX संकेत के मापा मूल्यों में दिन-प्रतिदिन की परिवर्तनशीलता को खत्म करने का सबसे अच्छा तरीका एक ही समय में प्रयोगात्मक समूह और नियंत्रण के नमूने शामिल करने के लिए और हर रन के भीतर सापेक्ष γH2AX परिवर्तन की गणना करने के लिए है। अतिरिक्त सिफारिशों में शामिल हैं: एक) अनुपचारित और 2 Gy से मिलकर एक ऐतिहासिक नियंत्रण नमूना हर समय में प्रयोग किया जाता है किरणित; ख) एक व्यक्ति सभी एंटीबॉडी लेबलिंग प्रक्रियाओं करता है; ग) प्राथमिक और माध्यमिक दोनों buffers और एंटीबॉडी के एक ही बैच के एक भी शेयर, एक प्रयोग के भीतर नमूने के पूरे सेट के लिए प्रयोग किया जाता है। यह नमूने के प्रत्येक रन के लिए नियमित रूप से और पूर्व उपकरण निर्माता से सिफारिश की गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण एक प्रवाह cytometer प्रदर्शन करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। यह अनुरोध हैसाधन की ऑप्टिकल संरेखण और fluidics प्रणाली को सत्यापित करने के uired और भी तुलना या एक समूह में जमा होने के लिए नमूने के बीच मापा γH2AX प्रतिदीप्ति में दिन-प्रतिदिन की भिन्नता को कम करने में मदद करता है।

    यह बताया जाना चाहिए कि समय-अंक (उदाहरण के लिए, 1, 2, 4, 6 बजे) पद चुनौतीपूर्ण विकिरण का विश्लेषण में मदद मिलेगी और अधिक से अधिक विस्तार 16 में लघु अवधि के डीएनए डीएसबी मरम्मत कैनेटीक्स उपाय हो सकता है की एक बड़ी संख्या का उपयोग करें। हालांकि, कुल मरम्मत की क्षमता और देरी प्रभाव स्वास्थ्य की संभावना 24 बजे ही मापा जाता है और प्रारंभिक समय बिंदु (टी = 0) 13-15 (चित्रा 4) में मनाया एक की तुलना में अवशिष्ट क्षति द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाएगा।

    बेसल γH2AX स्तर, वें वर्णित विधि का उपयोग कर लंबी अवधि के जोखिम माउस स्टडीज (> 6 महीने) में प्राप्त परिणामों के और अधिक सटीक व्याख्या के लिए, पुराने जानवरों या वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं 20 में वृद्धि करने के लिए जाना जाता है के बाद सेएक युवा अनुपचारित समूह के ई का उपयोग करें, एक उम्र से मिलान नियंत्रण के अलावा, उचित होगा। कुछ रिपोर्टों γH2AX डीएनए डीएसबी से संबंधित नहीं होगा जो proliferating कोशिकाओं में वृद्धि हो सकती है संकेत मिलता है कि हालांकि, यह आसानी से एस चरण और G2 को मापने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता / एम चरण डीएनए histograms का उपयोग करते हुए सेल भिन्न (2A चित्रा, डी)। कुछ प्रयोगात्मक शर्तों अभी भी डीएनए की क्षति के एक मार्कर के रूप में γH2AX का उपयोग करने से एक शोधकर्ता को रोकने, तो इस तरह के 53BP1 के रूप में, एक और प्रोटीन के गठन डीएनए की क्षति foci, (कारण उनके संयोजन से ऊपर या उल्लिखित कारणों के लिए), 21 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

    हम इस तरह की मांसपेशी, हृदय, मस्तिष्क और दूसरों के रूप में गैर-ल्य्म्फोइड ऊतकों, के लिए इस पद्धति का उपयोग करने का प्रयास नहीं किया है, यह फ्लो के लिए उन्हें प्रक्रिया के लिए मुश्किल प्रतीत होता है। इस तरह के ऊतकों का विश्लेषण आवश्यक है, तो γH2AX foci गिनती के लिए ऊतक वर्गों और माइक्रोस्कोपी, पसंद की विधि होगा। हालांकि, इस तरह परिधीय रक्त एल के रूप में अन्य ल्य्म्फोइड कोशिकाओं,ymphocytes, अस्थि मज्जा लिम्फोसाइट या thymocytes, वर्णित विधि द्वारा γH2AX के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। तिल्ली लिम्फोसाइटों का उपयोग करने का लाभ यह है कि सेल निलंबन की तैयारी और एक तिल्ली से अलग किया जा सकता है कि कोशिकाओं की बड़ी संख्या के रिश्तेदार सादगी है। अतिरिक्त अंत अंक अध्ययन में शामिल किए गए हैं, तो यह और भी अधिक लाभप्रद हो जाता है। प्रवाह cytometry जीन या miRNA अभिव्यक्ति, पश्चिमी धब्बा के लिए आर टी-qPCR, CPG मेथिलिकरण के लिए जीनोमिक डीएनए: हमारे अनुभव में, माउस प्रति splenocytes का एक विशिष्ट उपज निम्नलिखित assays के किसी के लिए प्रत्येक उपयुक्त, कम से कम 10 aliquots के संग्रह के लिए अनुमति देता है परख। इस प्रकार, γH2AX अंत बिंदु के लिए उन लोगों के लिए समानांतर में एकत्र अतिरिक्त splenocyte aliquots के डीएनए की क्षति संकेतन और मरम्मत प्रतिक्रियाओं में शामिल जीनों की अभिव्यक्ति को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Whet के रूप में साइटोटोक्सिक उपचार 22 के जवाब में विनियमित अप transcriptionally सामान्य रूप से कर रहे हैं कि GADD45A और CDKN1A के रूप में इस तरह के जीन, एक सुराग प्रदान कर सकता हैउसकी कोशिकाओं को ठीक चुनौतीपूर्ण तनाव प्रभावित करने के लिए प्रतिक्रिया कर रहे हैं। इसी तरह, तनाव प्रतिक्रियाओं में शामिल प्रोटीन का स्तर और बाद translational संशोधनों का आकलन किया जा सकता है। अंत में, यह निष्कर्षण प्रक्रिया के किसी भी चरण के यहाँ वर्णित है, के रूप में प्रदर्शन करते हैं, तो splenocytes में γH2AX पैदा कर सकते हैं कि उम्मीद नहीं है।

    यह फायदेमंद है और बहुत ही दूसरे छोर अंकों के साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार splenocytes के लिए प्राप्त डीएनए की क्षति की मरम्मत और डेटा के पूरक के लिए बलिदान के दौरान अतिरिक्त अंगों और ऊतकों के नमूने के लिए सिफारिश की जाएगी। उदाहरण के लिए, हम नियमित रूप से अस्थि मज्जा में विवो अस्थि मज्जा micronucleus परख के लिए कोशिकाओं, वार्धक्य जुड़े β-galactosidase और डीएनए की मरम्मत जीन अभिव्यक्ति माप के लिए विभिन्न ऊतकों इकट्ठा। बलिदानों के दौरान उपलब्ध तकनीकी सहायता पर निर्भर करेगा कि अन्य ऊतकों को इकट्ठा करने की क्षमता; हालांकि, यह काफी परिणामों की उचित व्याख्या और एक म्यू के निर्माण में मदद कर सकते हैंCH अधिक जैविक रूप से निम्न स्तर के उपचार के लिए प्रतिक्रिया की प्रासंगिक प्रणालीगत तस्वीर की जांच की जा रही है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    HTO: tritiated water, [3H] locally obtained from a nuclear reactor  stock activity 3.7 GBq/mL;  can be substituted with HTO from Perkin Elmer
    OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) Perkin Elmer NET348005MC 1 mCi/ml (185 MBq)
    OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium Perkin Elmer NET004005MC 1 mCi/ml (185 MBq)
    OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) Perkin Elmer NET323005MC 1 mCi/ml (185 MBq)
    tritiated water, [3H] (HTO) Perkin Elmer NET001B005MC substitute for HTO of local origin  
    GammaBeam 150 irradiator Atomic Energy of Canada Limited locally manufactured can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity 
    Tween-20 Sigma Aldrich P1379-500ML
    RPMI Fisher Scientific SH3025501 Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL
    fetal bovine serum Sigma Aldrich F1051-100ML
    anti-gH2AX antibody, clone JBW301 Millipore 05-636
    Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody Life Technologies (formerly Invitrogen) A21121
    propidium iodine Sigma Aldrich P4864-10ML 1 mg/ml
    ethanol Commercial Alcohols P006-EAAN 500 ml bottles Absolute Ethanol
    1.5 ml tubes Fisher Scientific 2682550 microcentrifuge tubes
    15 ml tubes Fisher Scientific 05-539-5 sterile polypropylene centrifuge tubes
    liquid nitrogen Linde P110403
    12 x 75 mm uncapped glass tubes Fisher Scientific K60B1496126 disposable borosilicate glass tubes with plain end
    T25 flasks VWR CA15708-120 nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)
    scissors Fine Science Tools 14068-12 Wagner scissors 12 cm sharp/sharp
    forceps, straight Fine Science Tools 11008-13 Semken forceps 13 cm, straight
    forceps, curved Fine Science Tools 11003-12 Narrow Pattern forceps 12 cm, curved
    60 mm petri dishes VWR CA25382-100 BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm
    cell strainers, 70 mm Fisher Scientific 08-771-2 Falcon cell strainers 50/case
    PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. Sigma Aldrich P4417-100TAB Phosphate Buffered Saline Tablets
    TBS recipe: to make 10x stock
    30 g TRIS HCl Sigma Aldrich T3253-1KG Trizma hydrochloride
    88 g NaCl Fisher Scientific S271-500 Sodium Chloride
    2 g KCl Fisher Scientific P217-500 Potassium Chloride
    Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4

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    References

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    आण्विक जीवविज्ञान अंक 101 डीएनए की क्षति डीएनए टूट जाता है डीएनए की मरम्मत γ-H2AX कम खुराक विकिरण ट्रिटियम β डबल कतरा - विकिरण γ विकिरण पुरानी जोखिम प्रवाह cytometry, माउस मॉडल
    जीर्ण बाद माउस Splenocytes डीएनए में नुकसान और मरम्मत मापने<em&gt; Vivo</em&gt; बीटा और गामा विकिरण की बहुत कम मात्रा के संपर्क में
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    Flegal, M., Blimkie, M. S., Wyatt, H., Bugden, M., Surette, J., Klokov, D. Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation. J. Vis. Exp. (101), e52912, doi:10.3791/52912 (2015).

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