Abstract
低線量放射線被曝は、高い放射線量によって生じる効果の量と質が異なる種々の生物学的効果を生成することができます。適切かつ科学的に正当な方法で、環境職業と公衆衛生の安全性に関連した質問に対処することは頻繁に正確に、放射線や化学物質をイオン化するような低線量の汚染物質の生物学的効果を測定する能力に依存しています。 DNA損傷と修復は、癌などのそれらの潜在的な長期的結果に起因する健康リスクの最も重要な初期の指標です。ここでは、マウス脾臓細胞におけるDNA損傷と修復のγ-及びβ-低線量の放射線に、インビボの曝露の慢性の効果を研究するためのプロトコルについて説明します。 DNA二本鎖切断、γH2AX呼ばれるリン酸化ヒストンH2AXの一般に受け入れられて、マーカーを使用して、我々は、DNA損傷のレベルだけでなく、評価することができる方法を示すだけでなく、変化しますDNA修復能に潜在的に生体内のエクスポージャーにおける低用量によって生成さ。フローサイトメトリーは、多数のサンプル中の免疫蛍光標識されたγH2AXの、高速で正確かつ信頼性の高い測定を可能にします。 DNA二本鎖切断修復DNAの十分な数の修復を誘発するために破壊生成するために2 Gyでの挑戦的な線量に抽出した脾細胞を曝露することによっておよび誘導を測定することによって評価することができる（1時間の照射後）および残留DNA損傷（24時間照射後）。残存DNA損傷は不完全修復と長期ゲノム不安定性と癌のリスクの指標となるであろう。容易にインビボ研究（ 例えば 、染色体異常、骨髄網状赤血球における小核頻度、遺伝子発現など） に 、このような測定することができる他のアッセイとエンドポイントと組み合わせることで、このアプローチは、生物学的効果の正確なコンテキストを評価することができの低レベルのストレス要因。
Introduction
広島·長崎原爆のと（マスメディアによって悪化）まれな原子力発電所事故の画像によって駆動、低または放射線と放射線の国民の恐怖をイオン化、非常に低用量のいずれかの潜在的な有害な影響を超える有意な論争は、非常につながっています厳格な放射線防護規制および潜在的に科学的に正当化されない規格。過去30年では、多くの報告は、有害性の欠如と低線量放射線1-4により誘発される潜在的に有益な生物学的効果の存在の両方を文書化しています。主要な放射線健康リスク因子は、放射線の高または中用量を受けた原爆被爆者の疫学的研究に基づいて推定、癌の確率です。 （そのように線形無閾値またはLNTモデルと呼ばない）、これらのデータの線形外挿は、低用量で癌のリスクを推定するために使用されます。しかし、このアプローチは、世界中の科学的受け入れを受信していません重く5を議論されています。
これは、より多くの研究がこの問題を明確にし、おそらく放射線防護基準を改善するために必要とされることは明らかです。このような研究は、DNA損傷率、DNA修復と突然変異誘発など、そのようなエンドポイント（ヒトへの影響を推定するための最良の） インビボ動物モデルにおける慢性治療（環境および職業暴露の最良の近似）を関与させるべきです。これは、DNAが変異誘発および癌開発6につながる可能性が放射線の影響と不完全または誤修復を損傷するための主要な標的であることが知られています。
DNA二重鎖切断（DSB）は、DNA損傷の最も有害なタイプの一つであり、細胞死および腫瘍形成7につながる可能性があります。これは、確実かつ正確に、低線量放射線及び/又は化学的汚染物質のような他のストレスへの曝露後のDSBのレベルを測定できるようにすることが重要です。最も高感度で特異的なマーカーの一つDNA DSBのγH2AX8と呼ばれる、リン酸化ヒストンH2AXで、まだ他のマーカーおよび方法は、9,10を提案されています。これは、誘導されたDSBの近傍におけるH2AX分子の数千が、抗γH2AX抗体および蛍光顕微鏡11で免疫標識することによって、個々のDSBの検出を可能にするγH2AXの形成に関与していると推定されます。反応は30分〜60をその最大値に達し、非常に迅速です。証拠は、γH2AXは切断の部位への他の修復因子を誘引することによって、壊れたDNA末端を固定し、（12に概説）他の修復タンパク質のためのアクセスを提供するために、クロマチン構造を修飾することによってDNA DSBの修復を促進することが存在します。 DNA DSBの修復が完了すると、γH2AXは、リン酸化脱および/ または分解を受け、新たに合成されたH2AX分子はクロマチン10の影響を受けた地域でγH2AXを交換します。 γH2AXの形成と損失をすることができます監視、したがって、DNA DSB修復速度の正確な推定値を提供します。このアプローチは、放射線感受性13-15と相関することが示されている放射線と速度と残留DSBレベルの高用量を照射し、様々なヒト腫瘍細胞株におけるDSBの修復を研究するために使用されてきました。
我々は、この実験的なアプローチを変更し、DNA DSBレベルの慢性γ-及びβ線照射の低用量の効果を調べると（図1）を修復するために、in vivoでのマウスの研究に適用しました。まず、我々は、飲料水に溶解トリチウム水（HTO）、または有機的に結合したトリチウム（OBT）の形でトリチウム（水素-3）で放出されたいずれかの放射線をβにマウスの長期慢性暴露を実行するための方法を実証します。二つの形式は、蓄積および/または体内の異なる配布、したがって、異なる生物学的効果をもたらすことが期待されます。両方の形態は、原子力産業における潜在的な危険です。この処理それらの相対的な生物学的な有効性の評価のために重要である2つの放射タイプの正しい比較を可能にするための等価線量率でγ線への慢性暴露によって並列されています。ベータ放射線は、γ線照射、高エネルギー光子から、それは非常に異なる作り、電子から構成されています。これにより差に、Β-放射線は、主に内部の健康被害を表し、γ線と比較して異なる生物学的効果を生じることがあります。この合併症は、HTOによって放出されるβ-放射線への暴露の規制に重要な論争をもたらしました。このように、公共のために飲料水中のHTOの規制レベルはヨーロッパで100ベクレル/ Lからオーストラリアの75,000ベクレル/ Lに変化します。これは、γ線の等価線量にHTOの生物学的効果を比較することが重要です。第二に、DNA DSBの速度が検出免疫蛍光標識したγH2AXを用いた慢性露出の完了時に分離された脾臓細胞で測定されますフローサイトメトリーによってエド。これは、in vivoでの暴露によって与えDNA損傷の程度を評価することができます。しかし、このような低レベルの曝露がDNA DSBの任意の検出率を生成しない可能性があることを期待するのは賢明です。代わりに、いくつかの隠れた変更/応答は、DNA損傷を修復する細胞の能力に影響を与えることが期待されてもよいです。これらの変化は、見つかった場合、（有害な効果を生じる）刺激（有益な効果を生成する）または阻害のいずれであってもよいです。提案されたプロトコルは、被害のかなりの量を生成する放射線の高用量で抽出した脾細胞をチャレンジすることにより、このような変化を明らかにすることができます（ 例えば 、2 Gyで約50細胞あたりのDNA DSBまたは3生産- 。総γH2AXレベルの5倍の増加を） 。その後、γH2AXの形成および消失は、DSB修復の開始及び終了を反映し、フローサイトメトリーによりモニターされます。このように、基礎およびDNA DSBの治療によって誘導されるレベルではないだけを測定することができるが、また、はるかに高いストレッサーレベルによって誘発されるDNA損傷に応答して修復する細胞の能力に対する潜在的影響。
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Protocol
すべてのマウス操作や処理手順は、地元の動物管理委員会が議会および/または動物のケアプログラムで記載され、承認ルールに従う必要があります。このプロトコルに記載されている全ての方法は、ローカルの動物管理委員会の承認を得て、動物ケアに関するカナダ評議会のガイドラインに従って実施しました。
注意：放射能を持つすべての作業は（を含む、放射性動物組織、寝具廃棄物の取り扱い、トリチウムの取り扱い、外部γ線照射に限定されない）立法府および/または放射線防護当局が定める規則に準拠する必要がありますし、許可することにより行うことが認定実験室および/または施設内の職員。
1.動物作業
- 動物のグループ化
- マウスは、外部組織から到着している場合は、動物施設で少なくとも10日間のために動物を慣らします。研究では、複数の治療群が含まれている場合は、動物の供給者がアルを送信できることを確認してください単一のバッチとしてL動物。
- 無作為に群当たり10匹のマウスの処置群にマウスを割り当てます。 C57BL / 6系統の雄マウスを使用している場合は、攻撃性の問題を軽減するために、それらの施設に非常に若いC57BL / 6雄のランダム化を事前に手配した動物のサプライヤーを持っています。
- 内部β-放射線にマウスの慢性暴露
- HTOとOBT（トリチウム化プロリン、アラニンおよびグリシンのアミノ酸の混合物）ソリューションの元の株式を希釈することにより、マウスの飲料水にトリチウム（10 kBq / Lと1 MBqで/ L）の作業濃度を準備します。
- 液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定することによって、飲料水中のトリチウムの最終濃度を検証します。必要に応じて、濃度を調整します。
- トリチウム水へのアクセスを自由に提供することで、一ヶ月のために動物を扱います。処理水は、2週間の期間中に少なくなった場合は、より多くの水を追加します。それ以外の場合は、2週間後にボトルを変更します。
- 偽照射コントロールを扱いますマウス全く同じ。独立した「クリーン」ルームまたは空気からトリチウムクロスコンタミネーションを避けるために正の空気圧の下に別個の「クリーン」なラックに保管してください。
- 外部γ線にマウスの慢性暴露
注：γ線照射施設/設備の場所によって異なります。 - 線量測定の利用可能な方法を使用して、所望の線量率を生成する放射フィールドを持つγ線源からの距離を決定します。動物ケージをカバーする領域内の放射線場の均一性を確認してください。
注：1.7μGy/ hが1 MBqで/体におけるLトリチウムによって生成される線量率に相当します。 - 1ヶ月のステップ1.3.1で決定した距離で、マウスのケージを配置することによって、マウスを公開します。 30分にγ線照射の毎日の中断を最小限に抑えます。総吸収線量を測定するための熱ルミネッセンス線量計を使用してください。
2.犠牲とサンプリング
注：マウスの残りの部分はsacrificいる間抽出脾臓（最大2時間）、メディア、60 mmディッシュに保つことができますエド。 5〜15匹のマウスの間で、参加する人の数に応じて、一日で処理することができます。
脾細胞培養物の調製
- 湾曲した端部に滅菌ピンセットを用いて細胞ストレーナーの内部に細かく刻むことによって脾臓を均質化。
- セルストレーナーを取り外し、15ミリリットルチューブに60ミリメートル皿から濾過した細胞懸濁液を収集します。
- 残りの細胞を収集するために、メディアの5mlでセルストレーナーを洗浄します。
- RTで5分間、300×gで遠心分離管。
- 上清をデカントし、RPMI 10ml中のペレットを再懸濁します。
- RTで5分間、300×gで遠心分離管。
- 上清をデカントし、RPMI 5ml中のペレットを再懸濁します。
- 転送4 25ミリリットルの組織培養フラスコに細胞懸濁液1ml及びCO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2、湿度80％）に移します
4.挑戦照射と定着
- 転送4℃で5分間、300×gで氷と遠心分離機に1.5mlチューブにステップ3.8から1mlの細胞懸濁液を、残りの。このサンプルで測定DNA損傷は、DNA修復曲線の構築のために両方の治療誘発性損傷及びt = 0のデータポイントを表します。
- 慎重に真空ポンプを用いて上清を吸引除去します。ゆっくりTBS緩衝液（20mMトリスpH7.4中、150mMのNaCl、2.7ミリモルのKCl）1ml中にペレットを再懸濁します。
- 4℃で5分間、300×gで遠心分離管。慎重に真空ポンプを用いて上清を吸引除去します。 TBS300μlの中に静かに再懸濁ペレット。
- 低速でボルテックスで混合しながら、-20℃の100％エタノール700μlを添加します。ふたを閉めて混合するために数回転倒。
- -20℃でサンプルを保管してください。エタノールで固定した脾細胞は、γH2AXシグナルにおける顕著損失なしに少なくとも12ヶ月間、-20℃で保存することができます。
- 挑戦的なγ-RADでステップ3.8からの脾臓細胞培養を照射利用可能な照射装置を用いて線量率≥200 MGY /分で2 Gyでのiation用量。
注：この照射の目的は、修復機構に挑戦するDNA DSBを誘導することです。 X線は、この目的に使用することもできます。 - すぐにCO 2インキュベーターに文化を返します。
- 挑戦2 Gyの照射後1時間、生物学的安全キャビネットにインキュベーターから培養液を除去します。代表的なサンプルのアリコートを収集するには、静かに氷上で1.5mlチューブに分注し、細胞懸濁液の転送1ミリリットルを用いて細胞を再懸濁します。 CO 2インキュベーターに細胞培養物を返します。
- 4℃で5分間、300×gで遠心分離管。慎重に真空ポンプを用いて上清を吸引除去します。ゆっくりTBS 1mlのペレットを再懸濁します。
- 4.5 - 繰り返して、4.3を繰り返します。
- 24時間挑戦2 Gyでのγ線照射、収穫後、ステップ4.8で説明したように24時間サンプル=に固定 - 4.10。
注意：一般的に、15 - 1日30サンプルは免疫蛍光標識し、単一の実行で、フローサイトメトリーによりアッセイすることができます。治療群間の正確な比較を確保するために、各群からのサンプル（複数可）を含みます。詳細については、16を参照も参照してください。
- 処理されるサンプルの数のための管の標識されたセットを用意し、氷上に置きます。 12×75ミリメートルキャップされていないガラス管を使用してください。無菌性は、この作業は必要ありません。 （「第2抗体のみ」）のみの二次抗体で標識するために一つの追加の歴史的対照サンプルを含めます。研究内で実行すべてのフローサイトメトリーでは、この歴史的なコントロールサンプルを使用してください。
- 各チューブに氷冷TBSの0.5ミリリットルを追加します。
- 5秒間-20℃、渦から固定脾細胞を除去し、TBSで準備されたチューブに0.5ミリリットルのアリコートを転送します。 -20℃の保存に戻すサンプルの残りを置き、バックアップサンプルとして保持します。
- 4℃で5分間、300×gで遠心分離脾細胞。上清を除去し、穏やかに、1％FBSを含む氷冷TBS 1ml中にペレットを再懸濁
- 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。上清を除去し、穏やかTST緩衝液1ml中に再懸濁ペレット（0.05％トリトンX-100、TBS中2％FBS）。氷上で20分間インキュベートします。
- 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。上清を除去し、穏やかに1希釈した一次抗γH2AX抗体200μlにペレットを再懸濁：TST緩衝液中で150。 「第2のAbのみ」対照試料のためのTSTの200μLを使用してください。
- 45°の角度で回転シェーカー上の位置チューブ - 60°、室温で300×gで1.5時間振盪します。
- TSTバッファー中で200倍希釈チューブをインキュベートしている間、1にアレクサ488結合ヤギ抗マウス二次抗体の十分な容量（200μL/サンプル）を準備します。
注：アレクサ488を含むすべての仕事コンジュゲート抗体は、（以下5.16に5.10ステップ）薄暗い光の条件下で行われるべきであるとラベルされたサンプルは、アルミホイルで管を包むことにより、光から保護されるべきです。 - 1.5時間のインキュベーションが完了した後、4℃で5分間、300×gで遠心分離し、各チューブに2％FBSを含有する氷冷TBSを1ml加えます。 2％のFBSを含むTBS 1ml中にペレットを再懸濁優しく上清を除去し。
- 4℃で5分間、300×gで遠心分離します。上清を除去し、穏やかにステップ5.8からの二次抗体溶液の200μl中に再サスペンドペレット。
- ステップ5.7のように1時間振とうプラットフォーム上でサンプルをインキュベートします。
- 1％FBSを含む氷冷TBSの1ミリリットルを追加します。
- 4℃で5分間、300×gで遠心分離します。上清を除去し、静かに氷冷TBS 1ml中にペレットを再懸濁します。
- 4℃で5分間、300×gで遠心分離します。上清を除去し、穏やかに、50μg/ mlのを含むTBS 0.5 ml中にペレットを再懸濁ヨウ化プロピジウム。
- 光から保護し、室温で5分間インキュベートします。
- 楽器固有のプロトコル16を使用して、フローサイトメーターでサンプルを分析します。サンプルあたり少なくとも10,000個の細胞を読みます。
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Representative Results
図2は、脾臓細胞に期待されるフローサイトメトリーのグラフの例がここに記載された方法を用いて調製を示しています。細胞を、最初に<電子ボリューム·側方散乱>散布図に基づいてゲートされる（ 図2Aおよび2D、電子ボリュームは、前方散乱に相当します）。 FL3 /プロピジウムヨウ素ヒストグラム（ 図2Bおよび2E）は、通常の細胞周期分布を確認します。 FL1チャネルを使用して計算γH2AX信号を意味することは、未処理の対照（ 図2C）と比較して、細胞（ 図2F）を照射し、2 Gyの中のDNA DSBで> 2倍の増加を確認します。次に、我々は、免疫蛍光マウスの脾臓細胞におけるフローサイトメトリーによってγH2AXを標識した測定の記載された方法の感度を調べた。 図3Aは、マウスの脾臓細胞でγH2AXレベル、DNA DSBの指標を示しているにex vivoで暴露した後、1時間のいずれか低い（0.1GY）または未処理対照に対するγ線の相対的な高（2グレイ）の用量。これは、0.1 Gyのは、DSBのレベルのわずかな増加を誘導し、その増加は統計学的に有意であったことが分かります。強い3倍の誘導が期待され、2 Gyの曝露後に検出されました。プロトコールに記載されているようにγH2AX免疫蛍光標識の特異性を検証するために、標識した細胞を蛍光顕微鏡で検査しました。観察された顕著な巣状のパターンは、蛍光信号はクロマチン内の個々のDNA DSB（ 図3B）に由来することを示しています。
ただしその代表トリチウム水の非常に低濃度（10 kBq / L）に1ヶ月間暴露したマウスの脾臓細胞におけるDNA DSB率とその修復の評価の結果を図4に示されている。それは、見ることができる（ 図4A）治療は基礎γH2AXレベルの10％の増加をもたらし、変化はありませんでしたT統計的に有意な（N = 5、1標本スチューデント t 検定 ）。さらに、DNA DSB修復の動態を表す挑戦2 Gyの照射後のγH2AXの測定形成および損失は、対照からの細胞とHTO処理マウス（ 図4B）との間の差はなかったです。
DNA損傷とDNA修復に対するインビボ慢性照射の効果を評価するために、図1の実験の図は、所望の期間のために慢性照射によるマウスのインビボ処置の後、マウスを屠殺し、脾細胞培養物は挑戦的に確立され、露出しています照射。脾細胞のアリコートを困難な投与後の種々の時点で収集され、固定されています。 γH2AXのレベルは、その後、免疫蛍光ラを用いて測定されますbelingとフローサイトメトリーによる検出。図の底部のプロットは、期待されるデータの概略図です。 DNA修復が完了した場合ガンマH2AXのレベルが大幅に、バック制御値に減少が続く挑戦照射後早期に増加します。 DNA損傷Δが原因で実験用マウスの治療およびDNA修復Δに産損傷がDNA DSB修復能力にマウスの処置の効果を表す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2.代表的には、生データフローサイトメトリー。 （A、D）脾臓細胞および細胞残屑および赤血球用の散布図と、ゲート領域（B、E）は、細胞周期の分布を表すDNAヒストグラム。
フローサイトメトリーによるγH2AXの図3.検出は、高感度かつ特異的です。 （A）新たに雄CBAマウスから単離した脾細胞をγ線照射、または偽処置及び1時間γH2AX応答を発達させ、0.1または2 Gyで照射しました。次いで、細胞を免疫蛍光、固定し、抗γH2AX抗体で標識し、フローサイトメトリーによって分析しました。 SD±正規化平均値（N = 12）に示されています。 *および*** P <0.05およびp <0.001、丁重に（1サンプルスチューデントの t検定）で統計的有意差を意味する。（B）未処理対照の代表的な顕微鏡写真（UT）または2 Gyが免疫蛍光抗γH2AXで標識された脾細胞を照射しました抗体。緑色蛍光の巣状のパターンは、γH2AXのための免疫蛍光標識の特異性を確認している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
トリチウム化ウォートにマウスの1ヶ月の曝露による効果の欠如を示す図4.代表的な結果DNA DSBレベルと修復のR（HTO）。 （A）脾細胞を、水と対照動物を飲んで10 kBq / HTOのLで処置したマウスから単離しました。 γH2AXのレベルは、免疫蛍光標識を用いて測定し、プロトコールに記載されているように、フローサイトメトリーを行いました。 SD±コントロールのものと相対γH2AX蛍光レベルを示す平均（N = 5）。これらのデータは、DNA DSB修復の評価のために、図3（b）で使用したT = 0時点から生成された。（B）単離された脾細胞は、γ線の挑戦2 Gyの線量に曝露された細胞のアリコートを固定しました。時刻t = 0、挑戦的な照射後1と24時間。平均独自のT = 0の制御にγH2AXの相対的な蛍光は±SDを示している（N = 5）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
本稿で提示プロトコルは、電離放射線を含む様々な化学的および物理的因子、低レベルの遺伝毒性を調べるin vivo試験で大規模なマウスを実施するのに有用です。私たちのGammaBeam 150照射を装備ユニークな特定病原体を含まない動物施設と30メートル長い照射ホールマウスの数百または数千もの低いまたは非常に低い線量率照射を伴う生涯研究を行うことができます。慢性的な低線量照射のための小さい照射施設は、放射線生物学の研究が日常的に行われており、放射線防護指針/規則が実装されている大学や病院の環境で設定することができます。しかし、規制強化は、通常、トリチウムなどの放射性核種の取扱いが行われ、内部動物照射のために設計の施設に適用されます。まれているが、そのような内部被ばく研究のために、認定試験所は、様々な再内に存在します検索機関ワールドワイド及びそれらの独自の機能は、このプロトコルに記載される研究のために使用することができます。
プロトコルの中で、私たちは正確に実験的な曝露によって生成されるDNA DSB率を評価するために、γH2AXの免疫蛍光標識を使用しています。さらに重要なことは、脾細胞を抽出するための配信に挑戦照射ex vivoでの導入は、と比較して（DNA DSB応答（チャレンジ後1時間でγH2AXレベル）のとDNA DSB修復の完全性を評価することができる24時間でγH2AXレベルになります0時間）。これは、蛍光顕微鏡により細胞あたりγH2AX病巣の定量化は、フローサイトメトリーと比較して、より高い感度を提供してもよいことに留意すべきです。例えば、グレイは、セル当たりのγH2AX病巣の数の大幅な増加を生成することが報告された0.001と低い用量。しかし、γH2AXのフローサイトメトリーベースの検出を使用すると、蛍光顕微鏡分析BECAに勝る利点を提供しますそれは測定のためのより少ない時間を必要とする使用するには、訓練を受けた/専門性の高い人材を必要としない、それは主観的な意思決定のγH2AX病巣の認識とカウントに関係を避けることができます。これらの利点は、大規模な動物実験のために重要です。方法が続く（ 図1）を提案した場合に10処置群と群当たり10匹のマウスを有する典型的な動物実験は、100×3 = 300脾臓サンプルをもたらします。サンプルのこの数のデータを生成するには、約100時間、フローサイトメトリーを用いて、必要とされます。あるいは、手動の顕微鏡分析によって行われていれば、同じタスクは非常にサンプルあたり顕微鏡時間を要求の40分の保守的な見積もりを使用して、少なくとも300時間を取るだろう。 γH2AX病巣の分析とスコアリングを自動化する試みが17-19なされてきたが、それらはすべて、多くの制限があります。具体的には、マウスの脾臓細胞とリンパ球のラウンド形状とサイズが小さいことは非現実的すべてINDIVを解決することができますidualγH2AXを顕微鏡病巣。接着細胞が正常γH2AX病巣のために自動化された顕微鏡システムによって獲得されているが、全く成功は、マウス脾細胞またはリンパ球のいずれかに示されていません。
フローサイトメトリーによるγH2AX信号の測定値の日々の変動を排除するための最良の方法は、同じ実行中の実験群と対照サンプルを含むように、すべての実行中の相対的なγH2AXの変化を計算することです。その他の推奨事項は、a）未処理および2 Gyとからなる歴史的対照試料は、すべての実行で使用されている照射しました。 b）の一人は、すべての抗体標識手順を実行します。 C）プライマリとセカンダリの両方のバッファおよび抗体の単一のバッチ、単一の在庫は、一つの実験内のサンプルのセット全体のために使用されます。それは、日常的に前のサンプルを実行するたびに、機器メーカーが推奨する品質管理試験、フローサイトメーターを行うことも重要です。これはREQです測定器の光学的整合と流体システムを検証するためにuired、また1つのグループに比べて、またはプールされるべきサンプル間の測定γH2AX蛍光の日々の変動を最小限に抑えることができます。
これは、指摘されるべきである時点（ 例えば 、1、2、4、6時間）後挑戦照射分析に役立つと、より詳細16で短期DNA DSB修復速度を測定することができるより多くのの使用。しかし、全体的な修復の可能性と遅延健康影響のらしさは、わずか24時間で測定された残留損傷で表され、最初の時点（T = 0）13-15（ 図4）で観察されたものと比較されることになります。
基底γH2AXレベルは、第記載された方法を用いて、長期暴露マウス研究（> 6ヶ月）で得られた結果をより正確に解釈するために、古い動物または老化細胞20に増加することが知られているので若い未処理グループの電子の使用は、年齢をマッチさせたコントロールに加えて、賢明であろう。いくつかの報告は、γH2AXはDNA DSBに関連しないであろう、増殖細胞において増加し得ることを示しているが、これは容易にDNAヒストグラム（ 図2A、D）を用いて、S期およびG2 / M期の細胞画分を測定することによって制御することができます。特定の実験条件はまだ（これは上に概説理由またはそれらの組み合わせに）DNA損傷のマーカーとしてγH2AXを使用することから、研究者ができない場合、例えば、53BP1のようなDNA損傷焦点を形成する別のタンパク質は、21を使用することができます。
我々は、筋肉、心臓、脳および他の非リンパ系組織のためのこの方法を用いて試みられていないが、フローサイトメトリーのためにそれらを処理することは困難と思われます。このような組織の分析が必要な場合、組織切片およびγH2AX病巣カウントのための顕微鏡検査は、任意の方法であろう。しかし、このような末梢血Lなどの他のリンパ球様細胞、ymphocytes、骨髄リンパ球または胸腺細胞は、記載された方法によりγH2AXのレベルを測定するために使用することができます。脾臓リンパ球を使用する利点は、細胞懸濁液の調製および脾臓から単離することができる多数の細胞の相対的な単純さです。追加のエンドポイントが研究に含まれている場合、これはさらに有利となります。 、フローサイトメトリー遺伝子またはmiRNA発現、ウェスタンブロットのためのRT-qPCRを、CpGメチル化のためのゲノムDNA：我々の経験では、マウス当たり脾臓細胞の典型的な収量は、以下のアッセイのいずれかに適した4つの、少なくとも10のアリコートの収集を可能にしますアッセイ。したがって、γH2AXエンドポイントのためにそれらに平行に集め、追加の脾細胞のアリコートをDNA損傷シグナル伝達および修復応答に関与する遺伝子の発現を測定することができます。研ぐような細胞毒性治療22に応答してアップレギュレート転写正常でありGADD45AとCDKN1Aのような遺伝子は、手がかりを提供することができます彼女の細胞が適切に挑戦ストレスの影響に対応しています。同様に、ストレス応答に関与するタンパク質レベルおよび翻訳後修飾を評価することができます。最後に、抽出手順のステップのいずれかは、ここで説明したように実行した場合、脾細胞でγH2AXを誘導することが期待されません。
それは有益性の高い他のエンドポイントで提示プロトコールとして脾臓細胞について得られたDNA損傷および修復データを補足するための犠牲の間に追加の臓器や組織をサンプリングすることをお勧めだろう。例えば、私たちは日常的に、骨髄のin vivo骨髄小核試験のための細胞、老化関連βガラクトシダーゼおよびDNA修復遺伝子発現測定のための種々の組織を収集します。犠牲中にご利用いただけるテクニカルサポートに依存するであろう他の組織を収集する機能。しかし、それはかなりの結果の適切な解釈とムーの建設を支援することができますCHより生物学的に低レベルの治療に対する反応の関連する全身画像が検討されて。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
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