Abstract
Esposizione radiazione bassa dose può produrre una varietà di effetti biologici che sono diversi nella quantità e qualità degli effetti prodotti dalle alte dosi di radiazioni. Affrontare le questioni relative alla sicurezza della salute ambientale, occupazionale e del pubblico in modo adeguato e scientificamente giustificata pesantemente si basa sulla capacità di misurare con precisione gli effetti biologici degli inquinanti a basso dosaggio, come ad esempio le sostanze ionizzanti radiazioni e chimiche. Danno al DNA e riparazione sono i più importanti indicatori precoci di rischi per la salute a causa delle loro potenziali conseguenze a lungo termine, come il cancro. Qui si descrive un protocollo per studiare l'effetto di cronica esposizione vivo a basse dosi di γ- e β-radiazione sul danno e riparazione del DNA nelle cellule del mouse milza. Con un pennarello comunemente accettata di DNA rotture del doppio filamento, fosforilata H2AX istone chiamato γH2AX, dimostriamo come può essere utilizzato per valutare non solo i livelli di danno al DNA, ma cambia anchenella capacità di riparazione del DNA potenzialmente prodotto da basse dosi di esposizione in vivo. Citometria a flusso consente la misurazione veloce, precisa e affidabile di immunofluorescently etichettato γH2AX in un gran numero di campioni. DNA a doppio filamento break riparazione può essere valutata esponendo splenociti estratte ad una dose di 2 Gy impegnativo per produrre un numero sufficiente di DNA rompe per innescare riparazione e misurando l'indotto (1 hr post-irradiazione) e danno al DNA residuo (24 ore post-irraggiamento). Danno al DNA residuo sarebbe indicativo di riparazione incompleta e il rischio di instabilità genomica a lungo termine e il cancro. In combinazione con altri metodi e punti finali che possono essere facilmente misurati in tali studi in vivo (ad esempio, aberrazioni cromosomiche, frequenze micronuclei in reticolociti midollo osseo, l'espressione genica, ecc), questo approccio consente una valutazione accurata e contestuale degli effetti biologici dei fattori di stress di basso livello.
Introduction
Polemiche significativo sopra i potenziali effetti dannosi di una dosi basse o molto basse di radiazioni e la paura del pubblico delle radiazioni, guidata da immagini dei bombardamenti atomici di Hiroshima e Nagasaki e di incidenti impianti nucleari rari ionizzanti (aggravato dai mass media), ha portato a molto regolamento sulla radioprotezione rigorosa e standard che non sono potenzialmente scientificamente giustificata. Negli ultimi tre decenni, numerosi studi hanno documentato sia la mancanza di nocivo e la presenza di effetti biologici potenzialmente benefici indotti da radiazioni a basso dosaggio 1-4. Il principale fattore di rischio per la salute di radiazioni è la probabilità di cancro, stimato sulla base di studi epidemiologici di sopravvissuti alla bomba atomica che ricevono dosi medio-alti di radiazioni. Estrapolazione lineare di questi dati (cosiddetti lineare senza soglia o il modello LNT) viene utilizzato per stimare i rischi di cancro a basse dosi. Tuttavia, questo approccio non ha ricevuto l'accettazione scientifica a livello mondialeed è fortemente dibattuto 5.
E 'evidente che sono necessari ulteriori studi per chiarire questo punto e possibilmente migliorare gli standard di protezione dalle radiazioni. Tali studi dovrebbero coinvolgere trattamenti cronici (meglio ravvicinamento delle esposizioni ambientali e professionali), in modelli animali in vivo (migliore per gli effetti per la salute umana estrapolando) e tali end-point come la frequenza dei danni del DNA, riparazione del DNA e mutagenesi. E 'noto che il DNA è l'obiettivo primario per danneggiare gli effetti delle radiazioni e incomplete o mis-riparazione può portare a mutagenesi e cancro sviluppo 6.
DNA rotture del doppio filamento (DSB) sono uno dei tipi più deleteri di lesioni del DNA e possono portare a morte cellulare e tumorigenesi 7. È quindi importante poter affidabile e preciso misurare il livello di DSB dopo esposizione a radiazioni dose bassa e / o di altri fattori di stress, come le sostanze chimiche. Uno dei marcatori più sensibili e specificidi DSB DNA è fosforilata istone H2AX, chiamato γH2AX 8, ma altri indicatori e metodi sono stati suggeriti 9,10. Si stima che migliaia di molecole H2AX, in prossimità di un DSB indotto, sono coinvolti nella formazione del γH2AX consentire l'individuazione dei singoli DSB, mediante l'etichettatura immunofluorescenza con un anti-γH2AX anticorpi e microscopia a fluorescenza 11. La risposta è molto rapida, raggiungendo il massimo tra 30 e 60 min. Esistono prove che γH2AX facilita la riparazione del DNA DSB, attirando altri fattori di riparazione per i siti di pause e modificando la struttura della cromatina per ancorare le estremità del DNA rotto e l'accesso di altre proteine di riparazione (recensito in 12). Al termine della riparazione di DSB DNA, γH2AX viene de-fosforilata e / o subisce il degrado, e le molecole di nuova sintesi H2AX sostituire γH2AX nelle zone colpite della cromatina 10. Formazione e la perdita di γH2AX monitoraggio può,di conseguenza, fornire una stima accurata dei DSB DNA cinetica di riparazione. Questo approccio è stato utilizzato per studiare la riparazione di DSB in varie linee cellulari tumorali umane irradiate con dosi elevate di radiazioni e il suo tasso e livelli DSB residui hanno dimostrato di correlazione con radiosensibilità 13-15.
Abbiamo modificato questo approccio sperimentale e applicata a un studio sui topi in vivo per esaminare gli effetti di basse dosi di γ- cronica e β-irradiazione sui livelli e di riparazione (Figura 1) DSB DNA. In primo luogo, abbiamo dimostrato un metodo per eseguire un lungo periodo di esposizione cronica di topi di β-radiante emessa da trizio (idrogeno-3) in forma di acqua triziata (HTO) o trizio organicamente (OBT) disciolto in acqua potabile . Le due forme dovrebbero accumulo e / o distribuire diverso nel corpo e, quindi, produrre diversi effetti biologici. Entrambe le forme sono potenziali rischi nel settore nucleare. Questo trattamentoè affiancata da esposizione cronica a γ-radiazioni ad una dose equivalente di consentire un corretto confronto tra i due tipi di radiazione, che è cruciale per la valutazione della loro efficacia biologica relativa. Beta-radiazioni è composto di elettroni, il che rende molto diversa dalla γ-radiazioni, fotoni ad alta energia. A causa di questa differenza, Β-radiazioni rappresenta pericolo per la salute principalmente interno e può produrre effetti biologici diversi rispetto a γ-radiazioni. Questa complicanza provocato controversie significativi rispetto alla regolazione di esposizione a β-radiazione emessa da HTO. Pertanto, i livelli di regolamentazione degli HTO in acqua potabile per il pubblico variano da 100 Bq / L in Europa a 75.000 Bq / L in Australia. È, quindi, importante confrontare gli effetti biologici di HTO a dosi equivalenti di γ-radiazioni. In secondo luogo, il tasso di DSB DNA viene misurata in splenociti isolati al completamento delle esposizioni croniche utilizzando immunofluorescently etichettato γH2AX rilevarecato mediante citometria di flusso. Ciò permette di valutare l'entità del danno al DNA inflitto dalle esposizioni in vivo. Tuttavia, è ragionevole aspettarsi che tali esposizioni di basso livello non può produrre alcun tasso rilevabili di DNA DSB; invece, alcune modifiche nascosti / risposte si può aspettare che interesserebbe la capacità delle cellule per riparare i danni del DNA. Questi cambiamenti, se trovato, possono essere sia stimolante (producendo un effetto benefico) o inibitoria (producendo un effetto deleterio). Il protocollo proposto permette di rivelare tali cambiamenti sfidando i splenociti estratti con una dose elevata di radiazioni che produce una notevole quantità di danni (per esempio, 2 Gy producendo circa il 50 DNA DSB per cellula o un 3 -. Aumento di 5 volte del livello γH2AX totale) . Successivamente, la formazione e la perdita di γH2AX, che riflette l'avvio e il completamento della riparazione DSB, è monitorato mediante citometria a flusso. In questo modo, non solo basale e livelli indotte dal trattamento di DSB DNA possono essere misurate, maanche il suo potenziale effetto sulla capacità delle cellule di rispondere e riparare i danni al DNA indotti da livelli molto più alti stressanti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure di manipolazione e di trattamento del mouse dovrebbero aderire alle regole stabilite dai programmi legislatore e / o la cura degli animali e approvati da un comitato di cura degli animali locale. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali, con l'approvazione del comitato di cura degli animali locale.
ATTENZIONE: Tutti i lavori con la radioattività (tra cui, ma non solo, il trattamento del trizio, γ-irradiazione esterna, la gestione tessuti animali radioattivi, rifiuti biancheria da letto) deve rispettare le regole stabilite dalle autorità legislatore e / o di protezione dalle radiazioni ed è realizzato da personale autorizzato personale in un laboratorio e / o struttura certificata.
1. Lavoro Animal
- Raggruppamento degli animali
- Se i topi sono in arrivo da un organismo esterno, acclimatarsi animali per almeno 10 giorni nella struttura degli animali. Se lo studio include più gruppi di trattamento, in modo che il fornitore di animali in grado di inviare alanimali l come un unico lotto.
- Casualmente allocare topi per gruppi di trattamento di 10 topi per gruppo. Se si utilizzano topi maschi del ceppo C57BL / 6, hanno il fornitore di animali pre-organizzare la randomizzazione di giovanissimi C57BL / 6 maschi nella loro struttura per attenuare i problemi di aggressione.
- L'esposizione cronica di topi su Internal β-Radiation
- Preparare le concentrazioni di lavoro di trizio (10 kBq / L e 1 MBq / L) in acqua potabile del mouse diluendo lo stock originale di HTO e OBT (una miscela di prolina triziata, alanina e glicina acidi amminoacidi) soluzioni.
- Convalidare le concentrazioni finali di trizio nell'acqua potabile misurando la radioattività utilizzando un contatore a scintillazione liquida. Regolare concentrazioni, se necessario.
- Trattare gli animali per un mese, fornendo l'accesso ad libitum all'acqua trizio. Se l'acqua si sta scaricando il trattamento durante il periodo di due settimane, aggiungere più acqua. Altrimenti, modificare bottiglie a due settimane.
- Trattare sham-irradiati controllotopi identico. Tenerli in una stanza separata "pulito" o su un telaio di montaggio "pulito" sotto pressione positiva per evitare trizio contaminazioni dall'aria.
- L'esposizione cronica di topi a γ-radiazioni esterne
Nota: impianto γ-irraggiamento / attrezzatura varia a seconda della posizione. - Utilizzando metodi disponibili di dosimetria, determinare le distanze da una fonte γ-radiazioni che hanno campi di radiazione che producono le dosi desiderate. Garantire l'omogeneità dei campi di radiazione all'interno delle aree che coprono le gabbie per gli animali.
Nota: 1,7 Gy / h è equivalente ad una dose prodotto da 1 MBq / L trizio nel corpo. - Esporre topi collocando gabbie topo alle distanze determinati nella fase 1.3.1 per un mese. Minimizzare interruzione giornaliera di γ-irradiazione a 30 min. Utilizzare dosimetri a termoluminescenza per misurare totale dosi assorbite.
2. Sacrifici e campionamento
Nota: Estratto milze possono essere tenuti in 60 millimetri piatti con supporti (fino a 2 ore), mentre il resto dei topi sono Sacrificed. A seconda del numero di persone che partecipano, tra 5 e 15 topi possono essere elaborati in un giorno.
3. Preparazione delle Culture splenocyte
- Omogeneizzare la milza tritando dentro un colino cella con una pinza sterile con una estremità ricurva.
- Rimuovere il filtro cellulare e raccogliere la sospensione cellulare filtrato dalla parabola di 60 mm nel tubo 15 ml.
- Risciacquare il filtro cellule con 5 ml di media per raccogliere il resto delle cellule.
- Tubi centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Decantare il surnatante e risospendere pellet in 10 ml di RPMI.
- Tubi centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Decantare il surnatante e risospendere pellet in 5 ml di RPMI.
- Trasferimento 4 ml di sospensione cellulare in un pallone di coltura tissutale da 25 ml e trasportarlo in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2, 80% di umidità)
4. Sfidare irradiazione e di fissaggio
- Trasferire ilrestante 1 ml di sospensione cellulare dal punto 3.8 in una provetta da 1,5 ml su ghiaccio e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Danno al DNA misurata in questo campione rappresentare sia un danno indotto dal trattamento e t = 0 dati punti per la costruzione di una curva di riparazione del DNA.
- Con attenzione aspirare il surnatante utilizzando una pompa a vuoto. Delicatamente risospendere pellet in 1 ml di tampone TBS (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM).
- Provette per centrifuga a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Con attenzione aspirare il surnatante utilizzando una pompa a vuoto. Delicatamente risospendere pellet in 300 ml di TBS.
- Mentre miscelazione su un vortex a bassa velocità, aggiungere 700 ml di -20 ° C 100% di etanolo. Chiudere il coperchio e capovolgere un paio di volte per mescolare.
- Conservare i campioni a -20 ° C. Splenociti fissati in etanolo possono essere conservati a -20 ° C per almeno 12 mesi senza alcuna perdita evidente nel segnale γH2AX.
- Irradiare la cultura splenocyte dal punto 3.8 con un impegnativo γ-rad Dose iation di 2 Gy in un dosaggio ≥ 200 mGy / min utilizzando disponibili dispositivo di irradiazione.
Nota: Lo scopo di questo irradiazione è indurre DSB DNA per tentare la riparazione macchinari. I raggi X possono anche essere utilizzati per questo scopo. - Restituire immediatamente le culture per un incubatore CO 2.
- 1 ora dopo la sfida 2 Gy di irradiazione, rimuovere le culture dal termostato di una cappa di sicurezza biologica. Per raccogliere un campione rappresentativo un'aliquota, delicatamente risospendere cellule usando una pipetta e trasferire 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 ml su ghiaccio. Riportare le colture cellulari di un incubatore CO 2.
- Provette per centrifuga a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Con attenzione aspirare il surnatante utilizzando una pompa a vuoto. Delicatamente risospendere pellet in 1 ml di TBS.
- Ripetere i passaggi 4,3-4,5.
- 24 ore dopo la sfida 2 Gy γ-irradiazione, raccolta e fissare a = campione 24 ore come descritto al punto 4,8-4,10.
Nota: in genere, 15-30 campioni al giorno possono essere immunofluorescently etichettati e dosati con citometria a flusso in un unico passaggio. Al fine di garantire un confronto accurato tra i gruppi di trattamento, includere campione (s) per ogni gruppo. Riferimenti 16 per ulteriori dettagli.
- Preparare una serie etichetta di tubi per il numero di campioni da processare e posto sul ghiaccio. Utilizzare 12 x 75 mm tubi di vetro senza cappuccio. La sterilità non è necessario per questo lavoro. Includere un campione di controllo storico aggiuntivo per l'etichettatura con anticorpo secondario solo ("solo 2 ° Ab"). Utilizzare questo esempio di controllo storico in ogni citometria a flusso eseguito all'interno di uno studio.
- Aggiungere 0,5 ml di TBS ghiacciata a ciascuna provetta.
- Rimuovere splenociti fissi da -20 ° C, vortex per 5 secondi e trasferire 0,5 ml aliquota da provette preparate con TBS. Mettere il resto dei campioni di nuovo in -20 ° C e stoccaggiomantenere come campione di backup.
- Splenociti centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di ghiacciata TBS contenente 1% FBS
- Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il supernatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di tampone TST (0,05% Triton X-100, 2% FBS in TBS). Incubare per 20 min in ghiaccio.
- Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 200 ml di anticorpo anti-γH2AX primario diluito 1: 150 in tampone TST. Utilizzare 200 ml di TST per il "solo 2 ° Ab" campione di controllo.
- Tubi posizione su un agitatore rotante a un angolo di 45 - 60 ° e agitare per 1,5 ore a 300 xg a RT.
- Mentre tubi sono incubazione preparare un volume sufficiente (200 pl / campione) di capra anti-topo coniugato con anticorpo secondario Alexa-488 ad una diluizione 1: 200 in tampone TST.
Nota: Tutti i lavori che coinvolgono Alexa-488anticorpo coniugato (passi 5,10-5,16 sotto) dovrebbe essere fatto in condizioni di luce fioca e campioni etichettati deve essere protetto dalla luce avvolgendo i tubi in un foglio di alluminio. - Una volta che il 1,5 ore di incubazione è completato, aggiungere 1 ml di TBS ghiacciata contenente 2% FBS a ciascuna provetta e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il supernatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di TBS contenente 2% FBS.
- Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 200 ml di soluzione di anticorpo secondario dal punto 5.8.
- Incubare i campioni su una piattaforma che agita per 1 ora come al punto 5.7.
- Aggiungere 1 ml di TBS ghiacciata contenente 1% FBS.
- Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di TBS ghiacciata.
- Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il supernatante e delicatamente risospendere pellet in 0,5 ml di TBS contenente 50 mg / mlpropidio ioduro.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
- Analizzare i campioni su un citofluorimetro utilizzando protocolli specifici dello strumento 16. Leggere almeno 10.000 cellule per campione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 2 mostra esempi di citometria a flusso grafici previsti per splenociti preparate con il metodo descritto qui. Le cellule vengono prima gated in base alla <elettronica scatter volume-side> diagramma a dispersione (Figura 2A e 2D, il volume elettronico equivale a scatter in avanti). FL3 / Propidium istogrammi iodio (figura 2B e 2E) confermano distribuzione normale ciclo cellulare. Media segnale γH2AX calcolato utilizzando il canale FL1 conferma un aumento> 2 volte in DSB DNA in 2-Gy cellule (Figura 2F) irradiato rispetto al controllo non trattato (Figura 2C). Avanti, abbiamo esaminato la sensibilità del metodo descritto di misurare immunofluorescently etichettato γH2AX mediante citometria di flusso in splenociti mouse. Figura 3A mostra livelli γH2AX, indicativi di DSB DNA, in splenociti di topo 1 ora dopo l'esposizione ex vivo a uno basso (0,1Gy) o (2 Gy) alte dosi di γ-radiazioni rispetto al controllo non trattato. Si può notare che 0,1 Gy indotto un lieve incremento del livello DSB e tale aumento era statisticamente significativa. Il forte induzione 3 volte era atteso e rilevata dopo l'esposizione 2 Gy. Per convalidare la specificità di etichettatura immunofluorescenza γH2AX come descritto nel protocollo, cellule marcate sono state esaminate con un microscopio a fluorescenza. Il modello foci simile marcato osservato indica che il segnale di fluorescenza origina dall'individuo DSB DNA all'interno della cromatina (Figura 3B).
Risultati rappresentativi della valutazione del tasso DSB DNA e loro riparazione in splenociti di topi esposti per un mese a concentrazioni molto basse di acqua triziata (10 kBq / L) sono presentate nella figura 4. Si può vedere (Figura 4A) che, sebbene la trattamento hanno portato ad un aumento del 10% del livello γH2AX basale, la variazione erat statisticamente significativa (N = 5, un campione test t di Student). Inoltre, la formazione misurata e la perdita di γH2AX dopo l'impegnativo 2 Gy, che rappresenta la cinetica di riparazione DSB DNA, non era differente fra le cellule dal controllo e topi HTO-trattati (Figura 4B).
Figura 1. Schema sperimentale per valutare l'effetto di irradiazione cronica in vivo sul danno al DNA e riparazione del DNA. Dopo il trattamento in vivo di topi con irradiazione cronica per un periodo di tempo desiderato, i topi vengono sacrificati e culture splenocyte sono stabiliti ed esposti ad un impegnativo irradiazione. Aliquote splenocyte sono raccolti e fissati in vari momenti dopo la dose impegnativo. I livelli di γH2AX sono poi misurati con immunofluorescenza labeling e rilevamento mediante citometria a flusso. La trama sulla parte inferiore della figura è uno schema dei dati attesi. Gamma-H2AX livello aumenta drasticamente subito dopo l'irradiazione impegnativo, seguito da una diminuzione di nuovo al valore di controllo, se la riparazione del DNA è completa. Danno al DNA Δ rappresenta il danno prodotto a causa del trattamento sperimentale di topi e riparazione del DNA Δ rappresenta l'effetto del trattamento di topi su DSB DNA la capacità di riparazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Flusso Figura 2. Rappresentante citometria a dati grezzi. (A, D) diagrammi a dispersione e le regioni di gating per splenociti e detriti cellulari ed eritrociti. (B, E) istogrammi di DNA che rappresentano distribuzioni del ciclo cellulare.
Figura 3. Rilevamento di H2AX γ mediante citometria di flusso è sensibile e specifico. (A) Splenociti appena isolate da topi CBA sesso maschile sono stati irradiati con o 0.1 o 2 Gy di γ-radiazioni, o sham trattati e ha permesso di sviluppare la risposta γH2AX per 1 ora. Le cellule sono state poi fissati, immunofluorescentlymarcato con un anticorpo anti-γH2AX e analizzate mediante citometria a flusso. Valori medi normalizzati ± DS sono mostrati (N = 12). * E *** significare differenza statistica con p <0.05 ep <0.001, rispettosamente (su un unico campione di Student t-test). (B) microfotografie rappresentativi di controllo non trattato (UT) o 2 Gy irradiato splenociti immunofluorescently marcate con anti-γH2AX anticorpo. Il modello foci-come di fluorescenza verde ribadisce la specificità dell'etichettatura di immunofluorescenza per γH2AX. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Risultati rappresentativi mostrano la mancanza di effetto prodotto da 1 mese l'esposizione di topi a tardo triziatar (HTO) a livello e la riparazione del DNA DSB. (A) Gli splenociti sono stati isolati da topi trattati con 10 kBq / L di HTO in acqua potabile e di controllo degli animali. Il livello di γH2AX stata misurata utilizzando etichettatura immunofluorescenza e citometria a flusso come descritto nel protocollo. Significano γH2AX livelli di fluorescenza rispetto a quelle del controllo ± SD sono mostrati (N = 5). Questi dati sono stati generati dalla t = 0 time-point che è stato utilizzato nella Figura 3B per la valutazione di riparazione DSB DNA. (B) isolato splenociti sono stati esposti ad una sfida 2 dosi Gy di γ-radiazioni e aliquote di cellule sono state fissate a tempi t = 0, 1 e 24 ore dopo l'irradiazione impegnativo. Fluorescenza γH2AX rispetto al proprio t = 0 controllo medio è mostrato ± SD (N = 5). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il protocollo presentato in questo documento è utile per lo svolgimento di grandi dimensioni del mouse scala studi in vivo che esaminano gli effetti genotossici di bassi livelli di vari agenti chimici e fisici, incluse le radiazioni ionizzanti. La nostra struttura unica specifica senza germe patogeno animale dotato di una GammaBeam 150 irradiatore e una sala lunga irradiazione 30 metro permette la conduzione di studi per tutta la vita che coinvolgono irradiazioni rateo di dose bassa o molto bassa su centinaia o addirittura migliaia di topi. Impianti di irradiazione più piccole per irradiazione cronica a basse dosi può essere impostato in una università o in un ambiente ospedaliero dove vengono condotti regolarmente studi radiobiologia e le linee guida in materia di radioprotezione / norme siano applicate. Tuttavia, normative più severe normalmente applicano agli impianti progettati per irradiazione animale interna dove la manipolazione di radionuclidi, come trizio, viene effettuata. Anche se raro, laboratori certificati per questo tipo di studi di esposizione alle radiazioni interne esistono in vari reistituti di ricerca in tutto il mondo e le loro capacità uniche possono essere utilizzati per studi descritti in questo protocollo.
All'interno del protocollo, si usa l'etichettatura immunofluorescenza di γH2AX di valutare con precisione i tassi DSB DNA prodotti da esposizioni sperimentali. Livello Ancora più importante, l'introduzione di una irradiazione impegnativo consegnato ex vivo per splenociti estratti rende possibile valutare l'integrità della risposta DSB DNA (livello γH2AX a 1 ora dopo il challenge) e del DNA riparazione DSB (γH2AX a 24 ore rispetto ai 0 ore). Va notato che la quantificazione delle γH2AX foci per cella mediante microscopia a fluorescenza può fornire una maggiore sensibilità rispetto a citometria a flusso. Ad esempio, dosi a partire da 0.001 sono stati segnalati Gy per produrre un aumento significativo nel numero di focolai γH2AX per cella. Tuttavia, l'uso di rilevamento basato su citometria a flusso di γH2AX offre vantaggi rispetto a fluorescenza microscopia becautilizzarlo richiede meno tempo per le misurazioni, non richiede personale altamente specializzato / addestrato e evita soggettivo processo decisionale in materia di γH2AX Foci il riconoscimento e il conteggio. Questi vantaggi sono fondamentali per studi animali larga scala. Un esperimento animale tipico con 10 gruppi di trattamento e 10 topi per gruppo comporterà 100 campioni x 3 = 300 milza, se il metodo proposto (Figura 1) è seguita. Per generare i dati da questo numero di campioni, circa 100 ore saranno tenuti in citometria a flusso. In alternativa, se fatto da analisi al microscopio manuale, lo stesso compito ci vorranno almeno 300 ore, utilizzando una stima prudenziale di 40 minuti di tempo microscopio altamente impegnativo per campione. Sebbene siano stati fatti tentativi per automatizzare l'analisi e il punteggio di foci γH2AX 17-19, tutti hanno una serie di limitazioni. In particolare, la forma rotonda e di piccole dimensioni di splenociti di topo e linfociti rende impraticabile per risolvere tutto individual γH2AX Foci microscopio. Mentre le cellule aderenti sono stati segnati con successo da sistemi automatizzati per microscopia γH2AX fuochi, senza successo è stato dimostrato sia per splenociti di topo o linfociti.
Il modo migliore per eliminare giorno per giorno variabilità dei valori misurati di segnale γH2AX mediante citometria di flusso è quello di includere i campioni di gruppo e di controllo sperimentale nello stesso periodo e per calcolare i cambiamenti γH2AX entro il termine di ogni corsa. Ulteriori raccomandazioni includono: a) un controllo storico costituito da non trattati e 2 Gy irradiata campione viene utilizzato in ogni corsa; b) una persona realizza tutte le procedure di etichettatura di anticorpi; c) un solo magazzino di buffer e un singolo lotto di anticorpi, sia primari che secondari, viene utilizzato per l'intero insieme di campioni all'interno di un esperimento. E 'anche fondamentale per eseguire un citofluorimetro controllo di qualità consigliato dal produttore dello strumento di routine e prima di ogni serie di campioni. Questo è required per verificare sistema di allineamento e fluidica ottica dello strumento e anche aiuta minimizzando variazione giorno per giorno in fluorescenza misurata γH2AX tra i campioni da confrontare o riunito in un unico gruppo.
Va sottolineato che l'utilizzo di un numero maggiore di punti temporali (per esempio, 1, 2, 4, 6 ore) irradiazione postale impegnativo può aiutare analizzare e misurare breve termine cinetica riparazione DSB DNA in maggior dettaglio 16. Tuttavia, il potenziale riparazione complessiva e la probabilità di effetti sulla salute ritardati sarebbero rappresentati da danni residua misurata solo a 24 ore e rispetto a quello osservato per il punto temporale iniziale (t = 0) 13-15 (Figura 4).
Poiché i livelli basali γH2AX sono noti per aumentare in animali vecchi o cellule senescenti 20, per l'interpretazione più precisa dei risultati ottenuti in studi topo esposizione a lungo termine (> 6 mesi) con il metodo descritto, the l'uso di una giovane gruppo non trattato, in aggiunta a un controllo di pari età, sarebbe auspicabile. Sebbene alcuni rapporti indicano che γH2AX può aumentare nelle cellule proliferanti, che non sarebbe in relazione con DSB DNA, questo può facilmente essere controllato misurando fase S e G2 / M-fase frazioni cellulari utilizzando istogrammi di DNA (Figura 2A, D). Se certe condizioni sperimentali impediscono ancora un ricercatore di utilizzare γH2AX come marcatore di danno al DNA (per i motivi di cui sopra o la loro combinazione), un'altra proteina che forma il DNA danni focolai, come 53BP1, può essere utilizzato 21.
Anche se non abbiamo cercato di utilizzare questo metodo per tessuti non linfoidi, come i muscoli, il cuore, il cervello e gli altri, sembrerebbe difficile elaborarli per citometria a flusso. Le sezioni di tessuto e la microscopia per γH2AX conteggio focolai sarebbe il metodo di scelta, se è necessaria un'analisi di tali tessuti. Tuttavia, altre cellule linfoidi, come sangue periferico lymphocytes, linfociti midollo osseo o timociti, possono essere utilizzati per misurare i livelli γH2AX con il metodo descritto. Il vantaggio di utilizzare linfociti splenici è la relativa semplicità di preparazione sospensione cellulare e il gran numero di celle che possono essere isolate da un milza. Questo diventa ancora più vantaggioso se punti finali supplementari sono inclusi nello studio. Nella nostra esperienza, un rendimento tipico di splenociti per il mouse consente la raccolta di almeno 10 aliquote, ogni adatto per uno dei seguenti saggi: citometria a flusso, RT-qPCR per gene o miRNA, Western Blot, DNA genomico per CpG metilazione test. Così, aliquote splenocyte aggiuntivi raccolti in parallelo a quelli per il punto finale γH2AX possono essere usati per misurare l'espressione di geni coinvolti nella segnalazione e riparazione risposte danno del DNA. Tali geni come Gadd45a e CDKN1A, che sono normalmente trascrizionalmente up-regolata in risposta a trattamenti citotossici 22, possono fornire un indizio per stuzzicarele sue cellule sono adeguatamente rispondendo all'influenza sforzo impegnativo. Allo stesso modo, i livelli di proteina e modificazioni post-traduzionali coinvolte nella risposta allo stress possono essere valutate. Infine, non si prevede che una qualsiasi delle fasi della procedura di estrazione, se eseguita come descritto qui, può indurre γH2AX in splenociti.
Sarebbe utile e altamente raccomandato per assaggiare organi e tessuti supplementari durante i sacrifici per integrare DNA danno e riparazione dati ottenuti per splenociti come da protocollo presentato con altri punti finali. Per esempio, abbiamo quotidianamente raccogliamo le cellule del midollo osseo per la in vivo del midollo osseo test del micronucleo, vari tessuti per senescenza associata β-galattosidasi e di espressione genica misure di riparazione del DNA. La capacità di raccogliere altri tessuti potrebbero dipendere il supporto tecnico disponibile durante i sacrifici; tuttavia, può contribuire in modo significativo nella corretta interpretazione dei risultati e la costruzione di un much biologicamente più immagine sistemica rilevante della risposta al trattamento di basso livello in fase di studio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
