Abstract
Lavdose stråling kan gi en rekke biologiske effekter som er annerledes i kvantitet og kvalitet fra virkningene produsert av høye stråledoser. Adressering spørsmål knyttet til miljø, yrkesmessig og folkehelse sikkerhet på en god og vitenskapelig begrunnet måte tungt avhengig av evnen til å måle de biologiske effektene av lave doser miljøgifter, som for eksempel ioniserende stråling og kjemiske stoffer. DNA skade og reparasjon er de viktigste tidlige indikatorer på helserisiko på grunn av deres potensielle langsiktige konsekvenser, som kreft. Her beskriver vi en protokoll for å studere effekten av kronisk in vivo eksponering for lave doser av γ- og β-stråling på DNA-skade og reparasjon i musemiltceller. Ved hjelp av en allment akseptert markør for DNA dobbelttrådbrudd, fosforylert histon H2AX kalt γH2AX viser vi hvordan den kan brukes til å vurdere ikke bare de nivåer av DNA-skader, men også endringeri DNA-reparasjon kapasiteten potensielt produsert ved lave doser in vivo-eksponering. Flowcytometri gir rask, nøyaktig og pålitelig måling av immunofluorescently merket γH2AX i et stort antall prøver. DNA dobbel tråd pause reparasjon kan evalueres ved å utsette ekstrahert splenocytter til en utfordrende dose på 2 Gy for å produsere et tilstrekkelig antall DNA brytes for å utløse reparasjon og ved å måle den induserte (1 timer etter bestråling) og gjenværende DNA-skade (24 timer post-bestråling). Gjenværende DNA skade ville være en indikasjon på ufullstendig reparasjon og risiko for langvarig genomisk instabilitet og kreft. Kombinert med andre analyser og endepunkter som lett kan måles på en slik in vivo studier (f.eks, kromosomavvik, mikrokjerner frekvenser i benmarg retikulocytter, genekspresjon, etc.), gir denne tilnærmingen en nøyaktig og kontekstuell vurdering av de biologiske effektene av lavt nivå stressfaktorer.
Introduction
Betydelig striden om de potensielle skadevirkningene av enten lav eller svært lave doser av ioniserende stråling og publikums frykt for stråling, drevet av bilder av Hiroshima og Nagasaki atombombing og sjeldne atomanlegg ulykker (forverret av massemedia), har ført til svært streng strålevern regulering og standarder som er potensielt ikke vitenskapelig begrunnet. I de siste tre tiår har mange rapporter dokumentert både mangel på skadelige og nærværet av potensielt gunstige biologiske effekter indusert ved lav dose stråling 1-4. Den store stråling helse risikofaktor er sannsynligheten for kreft, beregnet basert på epidemiologiske studier av atombombens overlevende får høye eller middels doser av stråling. Lineær ekstrapolering av disse data (såkalt lineær-no-terskel eller modell LNT) blir brukt til å estimere risiko for kreft ved lave doser. Imidlertid har denne tilnærmingen ikke mottatt verdensomspennende vitenskapelig akseptog er sterkt debattert 5.
Det er tydelig at flere studier er nødvendig for å avklare dette spørsmålet og muligens forbedre strålevernstandarder. Slike studier bør involvere kroniske behandlinger (beste tilnærming av miljømessige eksponeringer og yrkes), in vivo dyremodeller (best for å ekstrapolere effekter på human) og slike endepunkter som DNA skader priser, DNA-reparasjon og mutagenese. Det er kjent at DNA er det primære målet for skadelige stråling effekter og ufullstendig eller mis-reparasjon kan føre til mutagenese og kreftutvikling 6.
DNA-dobbeltstrengbrudd (DSB) som er en av de mest skadelige typer av DNA-lesjoner og kan føre til celledød og tumorigenesis 7. Det er derfor viktig å være i stand til på en pålitelig og nøyaktig å måle nivået av DSB etter eksponering for lav dose stråling og / eller andre stressfaktorer, slik som kjemiske forurensninger. En av de mest sensitive og spesifikke markørerDNA DSB er fosforylert histon H2AX, kalt γH2AX 8, men andre markører og metoder har blitt foreslått 9,10. Det er anslått at tusener av H2AX molekyler, i nærheten av en indusert DSB, er involvert i dannelsen av γH2AX muliggjør deteksjon av individuelle DSB ved immunofluorescent merking med et anti-γH2AX antistoff og fluorescensmikroskopi 11. Reaksjonen er meget rask, og nådde sitt maksimum mellom 30 og 60 min. Bevis eksisterer som γH2AX forenkler reparasjon av DNA DSB ved å tiltrekke andre reparasjons faktorer til områder av pauser og ved å endre kromatinstruktur å forankre ødelagte DNA endene og gi tilgang for andre reparasjons proteiner (anmeldt i 12). Ved ferdigstillelse av reparasjon av DNA DSB, blir γH2AX de-fosforylert og / eller gjennomgår nedbrytning, og nylig syntetiserte H2AX molekyler erstatte γH2AX i de berørte områdene av kromatin 10. Overvåking dannelse og tap av γH2AX kan,derfor gi et nøyaktig estimat av DNA DSB reparasjon kinetikk. Denne fremgangsmåten har blitt brukt til å studere reparasjon av DSB i forskjellige humane tumorcellelinjer bestrålt med høye doser av stråling og dens hastighet og rest DSB nivåer har vist seg å korrelere med Radiosensitivity 13-15.
Vi endret denne eksperimentell tilnærming og brukt den til en in vivo mus studie for å undersøke effekten av lave doser av kronisk γ- og β-bestråling på DNA DSB nivåer og reparasjon (figur 1). For det første, vi vise en metode for å utføre en langvarig kronisk eksponering av mus til β-stråling enten slippes ut av tritium (hydrogen-3) i form av tritiert vann (MTO) eller som organisk bundet tritium (OBT) løst i drikkevann . De to formene er forventet å samle og / eller fordele annerledes i kroppen, og derfor gi forskjellige biologiske effekter. Begge former er potensielle farer i atomindustrien. Denne behandlingener parallell med kronisk eksponering for γ-stråling med en ekvivalent dose hastighet for å tillate en riktig sammenligning av de to stråletyper, noe som er viktig for vurdering av deres relative biologiske effektivitet. Beta-stråling består av elektroner, slik at det er meget forskjellig fra det γ-stråling, høye energi fotoner. På grunn av denne forskjellen, representerer Β-stråling stort sett indre helserisiko og kan frembringe forskjellige biologiske effekter sammenlignet med γ-stråling. Denne komplikasjonen resultert i betydelige kontroverser over regulering av eksponering for β-stråling fra MTO. Dermed regulatoriske nivåer av MTO i drikkevann for publikum varierer fra 100 Bq / L i Europa til 75.000 Bq / L i Australia. Det er derfor viktig å sammenligne biologiske effekter av HTO for ekvivalente doser av γ-stråling. Dernest er frekvensen av DNA DSB målt i isolerte splenocytes ved fullføring av kroniske eksponeringer ved hjelp immunofluorescently merket γH2AX detektereed ved strømningscytometri. Dette tillater evaluering av graden av DNA-skade påført av in vivo-eksponering. Men det er fornuftig å forvente at slike lavt nivå eksponeringer ikke kan gi noen påviselige priser av DNA DSB; I stedet noen skjulte endringer / responser kan ventes som vil påvirke cellenes evne til å reparere DNA-skade. Disse forandringene, hvis det blir funnet, kan enten være stimulerende (fremstilling av en fordelaktig effekt) eller hemmende (produsere en skadelig effekt). Den foreslåtte protokollen kan avsløre slike endringer ved å utfordre de ekstraherte splenocyttene med en høy dose av stråling som frembringer en betydelig mengde skade (for eksempel 2 Gy leverer ca. 50 DNA DSB per celle eller en 3 -. 5 gangers økning i total γH2AX nivå) . Deretter dannelse og tap av γH2AX, reflekterer initiering og fullføring av DSB reparasjon, blir målt ved flowcytometri. På denne måten kan ikke bare basal og behandlingsinduserte nivåer av DNA DSB skal måles, menogså dens virkning på cellenes evne til å reagere og reparere DNA-skader indusert av mye høyere stressor nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus håndtering og behandling prosedyrer bør holde seg til reglene fastsatt av lovgiver og / eller dyr omsorg programmer og godkjent av en lokal dyr omsorg komiteen. Alle metoder som er beskrevet i denne protokollen ble utført i samsvar med retningslinjene i den kanadiske Council on Animal Care med godkjenning av den lokale dyr omsorg komiteen.
FORSIKTIG: Alt arbeid med radioaktivitet (inkludert, men ikke begrenset til håndtering av tritium, ekstern γ-bestråling, håndtering av radioaktive dyr vev, sengetøy avfall) bør holde seg til reglene fastsatt av lovgiver og / eller strålevernmyndighetene og utføres av autorisert personell i laboratorium og / eller anlegget.
1. Animal Work
- Animal Gruppering
- Hvis mus ankommer fra en ekstern organisasjon, akklimatisere dyrene i minst 10 dager i dyrefasilitet. Dersom studien omfatter flere behandlingsgrupper, sikre at dyret leverandøren kan sende aldyr l som et enkelt parti.
- Tilfeldig fordele mus i behandlingsgrupper på 10 mus per gruppe. Hvis du bruker hannmus av C57BL / 6 belastning, har dyret leverandøren pre-arrange randomisering av svært unge C57BL / 6 menn i sine anlegg for å dempe aggresjon problemer.
- Kronisk Eksponering av mus til Internt β-stråling
- Forbered konsentrasjoner av tritium (10 kBq / l og en MBq / l) i mus drikkevann ved å fortynne den opprinnelige lager av HTO og OBT (en blanding av tritiert prolin, alanin og glycin aminosyrer) løsninger.
- Validere de endelige konsentrasjoner av tritium i drikkevannet ved å måle radioaktiviteten ved bruk av en væskescintillasjonsteller. Juster konsentrasjoner, om nødvendig.
- Behandle dyr for én måned ved å gi tilgang ad libitum til tritium vann. Hvis behandlingen vann blir lavt i løpet av to ukers periode, tilsett mer vann. Hvis ikke, endrer flasker på to uker.
- Treat humbug-bestrålt kontrollmus identisk. Oppbevar dem i en egen "ren" rom eller på en egen "ren" rack under positivt lufttrykk for å unngå tritium krysskontaminering fra luften.
- Kronisk Eksponering av mus til ekstern γ-stråling
Merk: γ-bestråling innretning / utstyr vil variere avhengig av plasseringen. - Ved hjelp av tilgjengelige metoder for dosimetri, bestemme avstandene fra et γ-strålekilde som har strålefelt som produserer de ønskede doserater. Sikre homogenitet av strålefelt innenfor områdene dekker dyr merdene.
Merk: 1.7 μGy / t tilsvarer en dose produsert av en MBq / L tritium i kroppen. - Expose mus ved å plassere muse bur på avstander bestemt i trinn 1.3.1 for en måned. Minimalisere daglig avbrudd av γ-bestråling i 30 min. Bruk Termoluminescente dosimetre til å måle total absorberte doser.
2. Offer og Sampling
Note: Hentet spleens kan holdes i 60 mm retter med media (for inntil 2 timer), mens resten av musene er sacrificed. Avhengig av antall personer som deltar, mellom 5 og 15 mus kan behandles i en dag.
3. Utarbeidelse av splenocytt kulturer
- Homogen milten ved maling inne i et cellefilter med steril pinsett med en buet ende.
- Fjern cellefilter og samle det filtrerte cellesuspensjonen fra 60 mm skål i et 15 ml rør.
- Skyll cellefilter med 5 ml av mediet for å samle opp resten av cellene.
- Sentrifugerør ved 300 xg i 5 min ved RT.
- Dekanter supernatanten og re-suspendere pelleten i 10 ml RPMI.
- Sentrifugerør ved 300 xg i 5 min ved RT.
- Dekanter supernatanten og re-suspendere pelleten i 5 ml RPMI.
- Overføring 4 ml av cellesuspensjonen i et 25 ml vevkultur-kolbe og flyttes til en CO 2 inkubator (37 ° C, 5% CO2, 80% luftfuktighet)
4. Utfordrende Bestråling og festing
- Overførresterende 1 ml av cellesuspensjonen fra trinn 3,8 til et 1,5 ml rør på is og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. DNA-skade målt i denne prøven vil representere både behandlings-indusert skade og t = 0 datapunkt for konstruksjon av et DNA-reparasjon kurve.
- Aspirer forsiktig supernatanten ved hjelp av en vakuumpumpe. Forsiktig re-suspendere pelleten i 1 ml TBS-buffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Sentrifugerør ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirer forsiktig supernatanten ved hjelp av en vakuumpumpe. Forsiktig re-suspendere pellet i 300 mL av TBS.
- Under blanding på en vortex ved lav hastighet, tilsett 700 ul av -20 ° C 100% etanol. Lukk lokket og snu et par ganger for å blande.
- Oppbevar prøvene ved -20 ° C. Splenocytter løst i etanol kan oppbevares ved -20 ° C i minst 12 måneder uten noe merkbart tap i γH2AX signal.
- Bestråle de splenocytt kulturer fra trinn 3.8 med en utfordrende γ-rad iation dose på 2 Gy i en dose hastighet ≥ 200 mGy / min ved hjelp av tilgjengelig bestrålingsinnretning.
Merk: Formålet med denne bestråling er å indusere DNA DSB å utfordre reparasjon maskiner. X-stråler kan også brukes for dette formål. - Umiddelbart returnere kulturene til en CO 2 inkubator.
- 1 time etter den utfordrende 2 Gy bestråling, fjerne kulturer fra inkubatoren til et biologisk sikkerhetskabinett. For å samle et representativt prøvealiquoten, forsiktig resuspendere cellene ved hjelp av en pipette og overføres 1 ml av cellesuspensjonen til et 1,5 ml rør på is. Returner cellekulturer til en CO 2 inkubator.
- Sentrifugerør ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirer forsiktig supernatanten ved hjelp av en vakuumpumpe. Forsiktig re-suspendere pellet i 1 ml TBS.
- Gjenta trinn 04.03 til 04.05.
- 24 timer etter at utfordrende 2 Gy γ-bestråling, innhøsting og fikse på = 24 timer prøven som beskrevet i trinn 04.08 til 04.10.
Merk: Vanligvis 15 - kan 30 prøver per dag bli immunofluorescently merket og analysert ved flowcytometri i et enkelt løp. For å sikre en nøyaktig sammenligning mellom behandlingsgruppene, inkluderer prøven (e) fra hver gruppe. Se også Referanse 16 for ytterligere detaljer.
- Forbered en merket sett av rør for antall prøver som skal behandles, og legg på is. Bruke 12 x 75 mm uavdekkede glassrør. Sterilitet er ikke nødvendig for dette arbeidet. Omfatte ytterligere ett historisk kontrollutvalget for merking med sekundært antistoff bare ("andre Ab only"). Bruk denne historiske kontrollutvalget i hver flowcytometri kjøres i en studie.
- Tilsett 0,5 ml iskald TBS til hvert rør.
- Fjerne faste splenocytter fra -20 ° C, vortex i 5 sekunder og overføre en 0,5 ml aliquot til preparerte rør med TBS. Sett resten av prøvene tilbake til -20 ° C og lagringbeholde som en backup prøve.
- Sentrifuger splenocytter ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og forsiktig re-suspendere pelleten i 1 ml iskald TBS inneholdende 1% FBS
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og forsiktig re-suspendere pelleten i 1 ml av TST-buffer (0,05% Triton X-100, 2% FBS i TBS). Inkuber i 20 minutter på is.
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og forsiktig re-suspendere pelleten i 200 ul av primær anti γH2AX antistoff fortynnet 1: 150 i TST-buffer. Bruk 200 ul TST for "andre Ab bare" kontrollutvalget.
- Posisjons rør på en roterende ristemaskin ved en vinkel på 45 - 60 ° og det hele rystes i 1,5 time ved 300 xg ved romtemperatur.
- Mens rørene inkubering, forberede et tilstrekkelig volum (200 ul / prøve) av geit anti-mus sekundært antistoff konjugert med Alexa-488 ved en 1: 200 fortynning i TST-buffer.
Merk: Alt arbeid med Alexa-488konjugert antistoff (trinn 5.10 til 5.16 nedenfor) bør gjøres under dim lysforhold og merkede prøver bør beskyttes mot lys ved å pakke rør i aluminiumsfolie. - Når 1.5 timer inkubasjon er fullført, tilsett 1 ml iskald TBS inneholdende 2% FBS til hvert rør og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og forsiktig re-suspendere pelleten i 1 ml TBS inneholdende 2% FBS.
- Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og forsiktig re-suspendere pelleten i 200 pl av det sekundære antistoffet fra trinn 5.8.
- Inkuber prøvene på en risting plattform for en time som i trinn 5.7.
- Tilsett 1 ml iskald TBS inneholdende 1% FBS.
- Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og forsiktig re-suspendere pellet i 1 ml iskald TBS.
- Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og forsiktig re-suspendere pelleten i 0,5 ml TBS inneholdende 50 pg / mlpropidiumjodid.
- Inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur beskyttet mot lys.
- Analysere prøver på et strømningscytometer ved bruk av instrument-spesifikke protokoller 16. Les minst 10 000 celler per prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser eksempler på flowcytometri grafer som forventes for splenocytter fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet her. Cellene er første gated basert på <elektronisk volum-side scatter> spredningsdiagram (Figur 2A og 2D, er elektronisk volum tilsvarer fremover scatter). FL3 / Propidium jod histogrammer (figur 2B og 2E) bekrefte normal cellesyklusfordeling. Mener γH2AX signal beregnes med FL1 kanalen bekrefter a> 2 ganger økning i DNA DSB i 2-Gy bestrålte celler (figur 2F) i forhold til ubehandlet kontroll (figur 2C). Deretter undersøkte vi følsomheten av den beskrevne metode for måling immunofluorescently merket γH2AX ved flowcytometri på musesplenocyter. Figur 3A viser γH2AX nivåer, som indikerer DNA DSB, i musesplenocyter 1 time etter at ex vivo eksponering for enten lav (0,1Gy) eller høy (2) Gy doser av γ-stråling i forhold til den ubehandlede kontroll. Det kan sees at 0,1 Gy induserte en svak økning i DSB-nivå, og at økningen var statistisk signifikant. Den sterke 3-fold induksjon var ventet, og oppdaget etter 2 Gy eksponering. For å bekrefte spesifisiteten av γH2AX immuno-merking som beskrevet i protokollen, ble merkede celler undersøkes med et fluorescensmikroskop. Den markerte foci-lignende mønster observert angir at fluorescens-signalet stammer fra den enkelte DNA DSB innenfor kromatin (figur 3B).
Representative resultater av vurderingen av DNA DSB hastighet og deres reparasjon i splenocytter fra mus eksponert for en måned til meget lave konsentrasjoner av tritiert vann (10 kBq / l) er vist i figur 4. Det kan bli sett (figur 4A) at selv om behandling resulterte i en 10% økning av basal γH2AX nivå, var det ingen endringt statistisk signifikant (N = 5, en sample-Student 's t-test). Videre er den målte dannelse og tap av γH2AX etter utfordrende 2 Gy bestråling, som representerer kinetikken av DNA DSB reparasjon, var ikke forskjellig mellom cellene fra kontroll og HTO-behandlede mus (Figur 4B).
Figur 1. Experimental diagram for å evaluere effekten av kronisk in vivo bestråling på DNA-skade og DNA-reparasjon. Etter in vivo-behandling av mus med kronisk bestråling i en ønsket tidsperiode, blir musene avlivet, og splenocytt kulturer er etablert og utsatt for en utfordrende bestråling. Splenocytt alikvoter blir samlet og festet ved forskjellige tidspunkter etter den utfordrende dose. Nivåer av γH2AX måles deretter bruker immunofluorescent laBeling og deteksjon av flowcytometri. Plottet på bunnen av figuren er en skjematisk fremstilling av forventede dataene. Gamma-H2AX nivå øker drastisk tidlig etter den utfordrende bestråling, etterfulgt av en reduksjon tilbake til kontrollverdien, hvis DNA reparasjonen er fullført. DNA-skader Δ representerer skaden produsert på grunn av den eksperimentelle behandlingen av mus og DNA reparasjon Δ representerer effekten av behandling av mus på DNA DSB reparasjonskapasitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative strømningscytometri rådata. (A, D) Scatter plott og port regioner for splenocytes og cellerester og erytrocytter. (B, E) DNA-histogram representerer cellesyklus distribusjoner.
Figur 3. Påvisning av γ H2AX ved strømningscytometri er sensitiv og spesifikk. (A) Splenocytter nyisolerte fra mannlige CBA mus ble bestrålt med enten 0,1 eller 2 Gy av γ-stråling, eller humbug behandlet og får utvikle γH2AX respons for en time. Cellene ble deretter fiksert, immunofluorescentlymerket med anti-γH2AX antistoff og analysert ved flow-cytometri. Normaliserte middelverdier ± SD er vist (N = 12). * Og *** betegne statistisk forskjell p <0,05 og p <0,001, respektfullt (en-utvalg Student t-test). (B) Representative microphotographs av ubehandlet kontroll (UT) eller 2 Gy bestrålt splenocytes immunofluorescently merket med anti-γH2AX antistoff. Foci-lignende mønster av grønn fluorescens bekrefter spesifisiteten av immunofluorescent merking for γH2AX. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Representative resultater som viser mangel på effekt produsert av en måned eksponering av mus til tritiumbehandlet water (MTO) på DNA DSB nivå og reparasjon. (A) Splenocytter ble isolert fra mus behandlet med 10 kBq / l MTO i drikkevann dyr vann og kontroll. Nivået av γH2AX ble målt ved anvendelse av immunfluorescens-merking og flow-cytometri som beskrevet i protokollen. Bety γH2AX fluorescens nivåer i forhold til de av styre ± SD er vist (N = 5). Disse data ble samlet inn fra t = 0 Tid-punktet som ble brukt i figur 3B for evaluering av DNA DSB reparasjon. (B) isolerte splenocytter ble utsatt for et krevende 2 Gy dose av γ-stråling og porsjoner av celler ble satt til tider t = 0, 1 og 24 timer etter den utfordrende bestråling. Mener fluorescens av γH2AX i forhold til sin egen t = 0 kontroll vises ± SD (N = 5). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen presentert i denne artikkelen er nyttig for å drive storskala mus in vivo studier som undersøker de gentoksiske effekter av lave nivåer av ulike kjemiske og fysiske midler, inkludert ioniserende stråling. Vår unike spesifikk patogen-frie dyr anlegget utstyrt med en GammaBeam 150 irradiator og en 30 meter lang bestråling hall kan drive livslange studier med lav eller svært lav dose rente bestrålinger på hundrevis eller tusenvis av mus. Mindre bestrålingsanlegg for kronisk lav dose bestråling kan settes opp på et universitet eller sykehusmiljø der strålebiologi studier er gjennomført rutinemessig og retningslinjer strålevern / forskrift blir gjennomført. Imidlertid strengere regler gjelder normalt til anlegg konstruert for innvendig dyr bestråling hvor håndteringen av radionuklider, slik som tritium, blir utført. Selv om sjeldne, laboratorier sertifisert for slike interne undersøkelser for strålings finnes i ulike reforskningsinstitusjoner verdensomspennende og deres unike evner kan brukes til studier som er beskrevet i denne protokollen.
Innenfor protokollen, bruker vi immunofluorescent merking av γH2AX å vurdere nøyaktig DNA DSB prisene produsert av eksperimentelle eksponeringer. Enda viktigere, innføring av en utfordrende bestråling levert ex vivo for å utvinnes splenocytter som gjør det mulig å evaluere den intakte DNA DSB responsen (γH2AX nivå ved 1 time etter utfordringen) og av DNA DSB reparasjon (γH2AX nivå ved 24 timer sammenlignet 0 timer). Det bør bemerkes at kvantifisering av γH2AX foki pr celle ved fluorescens mikroskopi kan tilveiebringe høyere følsomhet sammenlignet med flowcytometri. For eksempel doser så lave som 0.001 Gy ble rapportert å gi betydelige økninger i antallet γH2AX foci per celle. Imidlertid gir bruk av flowcytometri-basert gjenkjenning av γH2AX fordeler fremfor fluorescens mikroskopi analyse becabruke det krever mindre tid for målinger, krever det ikke høyt spesialiserte / kvalifisert personell, og det unngår subjektive beslutnings relatert til γH2AX foci anerkjennelse og telling. Disse fordelene er viktige for storskala dyrestudier. En typisk dyreeksperiment med 10 behandlingsgrupper og 10 mus per gruppe vil resultere i 100 x 3 = 300 milt prøver, hvis metoden foreslått (figur 1) blir fulgt. For å generere data fra dette antallet prøver, vil ca 100 timer være nødvendig ved hjelp av flowcytometri. Alternativt, hvis det gjøres ved manuell mikroskopiske analyser, ville den samme oppgave ta minst 300 timer, ved hjelp av et konservativt estimat på 40 min av svært krevende mikroskop gang per sample. Selv om forsøk på å automatisere analyse og scoring av γH2AX foci har blitt gjort 17-19, de har alle en rekke begrensninger. Særlig den runde form og liten størrelse av musesplenocyter og lymfocytter gjør det upraktisk å løse alle individual γH2AX foci mikroskopisk. Mens heftende celler har blitt scoret av automatiserte mikroskopi systemer for γH2AX foci, har ingen suksess blitt demonstrert for enten musesplenocyter eller lymfocytter.
Den beste måte å eliminere dag-til-dag variabilitet i de målte verdier av γH2AX signal ved strømningscytometri, er å inkludere forsøksgruppe og en kontrollprøver i samme kjøring og for å beregne relative γH2AX endringer innenfor hvert løp. Andre anbefalinger er: a) en historisk kontrollgruppe bestående av ubehandlet og 2 Gy bestråles prøven brukes i alle løp; b) en person utfører alle antistoff merking prosedyrer; c) et enkelt lager av buffere og et enkelt parti av antistoff, både primære og sekundære, benyttes for hele settet av prøver i løpet av et eksperiment. Det er også viktig å utføre et strømningscytometer kvalitetskontrolltest som er anbefalt av produsenten instrumentet og rutinemessig før hver kjøring av prøver. Dette er required å kontrollere instrumentets optisk justering og fluidics system og også bidrar til å minimere dag-til-dag variasjon i målt γH2AX fluorescens mellom prøver å bli sammenlignet eller samlet i én gruppe.
Det skal påpekes at bruken av et større antall tidspunkter (for eksempel 1, 2, 4, 6 timer) etter utfordrende bestråling kan bidra til å analysere og å måle korttids DNA DSB reparasjon kinetikk i større detalj 16. Imidlertid ville generell reparasjon potensial og sannsynligheten for forsinkede helseeffekter representeres ved ytterligere skade målt bare ved 24 timer og sammenlignet med den som ble observert ved det første tidspunkt (t = 0) 13-15 (figur 4).
Siden basal γH2AX nivåene er kjent for å øke i gamle dyr eller senescent celler 20, for mer nøyaktig tolkning av resultatene oppnådd i langtidseksponering musestudier (> 6 måneder) ved anvendelse av den beskrevne metoden, the anvendelsen av en ung ubehandlede gruppe, i tillegg til en alder-matchet kontroll, vil være tilrådelig. Selv om noen rapporter indikerer at γH2AX kan øke i prolifererende celler, som ikke ville være relatert til DNA DSB, kan dette lett kontrolleres ved måling av S-fasen og G2 / M-fase cellefraksjoner ved hjelp av DNA-histogrammer (figur 2A, D). Hvis visse eksperimentelle betingelser fortsatt hindre en forsker fra å bruke γH2AX som en markør for DNA-skade (på grunn av de årsakene som er beskrevet ovenfor, eller deres kombinasjon), et annet protein som danner DNA-skade foci som 53BP1, kan brukes 21.
Selv om vi ikke har forsøkt å bruke denne metoden for ikke-lymfevev, for eksempel muskler, hjerte, hjerne og andre, vil det synes vanskelig å behandle dem for flowcytometri. Vevssnitt og mikroskopi for γH2AX foci telling vil være metoden for valg, hvis analyse av slike vev er nødvendig. Imidlertid kan andre lymfoide celler, så som perifert blod lymphocytes, benmarg lymfocytter eller thymocytter, kan brukes for å måle γH2AX nivåer ved den beskrevne fremgangsmåte. Fordelen med å bruke miltlymfocytter er den relative enkelhet av cellesuspensjon preparatet og det store antall celler som kan bli isolert fra en milt. Dette blir enda mer fordelaktig hvis flere endepunkter er inkludert i studien. Etter vår erfaring er et typisk utbytte av splenocytter pr mus gir mulighet for oppsamling av minst 10 porsjoner, hver egnet for en hvilken som helst av følgende analyser: flowcytometri, RT-qPCR for genet eller miRNA uttrykk, western blot, genomisk DNA for CpG metylering assay. Således kan ytterligere splenocytt alikvoter innsamlet parallelt til de for γH2AX endepunkt anvendes for å måle ekspresjonen av gener som er involvert i DNA-skade signalering og reparasjons responser. Slike gener som GADD45A og CDKN1A, som normalt transkripsjonelt oppregulert i respons til cytotoksiske behandlinger 22, kan gi en anelse om å skjerpehennes celler er riktig reagerer på den utfordrende spenning innflytelse. På lignende måte kan protein nivåer og post-translasjonelle modifikasjoner er involvert i stressresponser bli vurdert. Til slutt er det ikke forventet at noen av trinnene i ekstraksjonsprosedyren, hvis det utføres som beskrevet her, kan indusere γH2AX i splenocytter.
Det ville være fordelaktig og sterkt anbefalt å prøve flere organer og vev under ofre for å supplere DNA skade og reparasjon data innhentet for splenocytes som per presenteres protokoll med andre endepunkter. For eksempel, vi rutinemessig samle benmargceller for in vivo beinmarg mikrokjerne analysen, ulike vev for senescens-forbundet β-galaktosidase og DNA reparasjon genuttrykk målinger. Evnen til å samle andre vev vil avhenge av tilgjengelig teknisk støtte under offer; men det kan i betydelig grad bidra i riktig tolkning av resultatene og bygging av en much mer biologisk relevant systemisk bilde av responsen på det lave nivået behandling under etterforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
