Abstract
Lav strålingsdosis udsættelse kan producere en række biologiske virkninger, der er forskellige i mængde og kvalitet af de virkninger af høje strålingsdoser. Adressering spørgsmål vedrørende miljø, arbejdsmiljø og folkesundhed sikkerhed i en korrekt og videnskabeligt begrundet måde stærkt afhængig af evnen til præcist at måle de biologiske virkninger af doser forurenende stoffer med lav, såsom ioniserende stråling og kemiske stoffer. DNA-skader og reparation er de vigtigste tidlige indikatorer for sundhedsrisici på grund af deres potentielle langsigtede konsekvenser, såsom cancer. Her beskriver vi en protokol til at undersøge virkningen af kronisk in vivo eksponering for lave doser af γ- og β-stråling på DNA-skader og reparation i musemiltceller. Under anvendelse af et almindeligt accepteret markør af DNA dobbelt-strengbrud, phosphoryleret histon H2AX kaldet γH2AX, vi vise, hvordan den kan bruges til at vurdere ikke kun niveauet af DNA-skader, men også ændringeri DNA-reparation kapacitet potentielt produceres af lav dosis in vivo eksponering. Flowcytometri giver mulighed for hurtig, præcis og pålidelig måling af immunofluorescently mærket γH2AX i et stort antal prøver. DNA dobbeltstrenget brud reparation kan evalueres ved at udsætte ekstraherede splenocytter til en udfordrende dosis på 2 Gy at frembringe et tilstrækkeligt antal DNA pauser at udløse reparation og ved at måle den inducerede (1 time efter bestråling) og resterende DNA-skade (24 hrs efter bestråling). Resterende DNA-skader ville være tegn på ufuldstændig reparation og risikoen for langsigtede genomisk ustabilitet og kræft. Kombineret med andre assays og endepunkter, der nemt kan måles i en sådan in vivo studier (f.eks, kromosomforandringer, mikrokerner frekvenser i knoglemarv reticulocytter, genekspression, etc.), denne tilgang giver en nøjagtig og kontekstuelle vurdering af de biologiske effekter af lavt niveau stressfaktorer.
Introduction
Betydelig kontrovers over de potentielle skadelige virkninger af enten lave eller meget lave doser af ioniserende stråling og offentlighedens frygt for stråling, drevet af billeder af Hiroshima og Nagasaki atomare bombninger og sjældne ulykker nukleare anlæg (forværret af massemedierne), har ført til meget streng regulering strålingsbeskyttelse og standarder, der er potentielt ikke videnskabeligt begrundet. I de sidste tre årtier har talrige rapporter dokumenteret både manglen på skadelig og tilstedeværelsen af potentielt gavnlige biologiske virkninger induceret af lav dosis stråling 1-4. Den største stråling sundhed risikofaktor er sandsynligheden for kræft, anslået på grundlag af epidemiologiske undersøgelser af atomare bombe overlevende får høje eller mellemstore doser af stråling. Lineær ekstrapolation af disse data (såkaldte lineær-no-grænseværdi eller LNT model) anvendes til at estimere risikoen for kræft ved lave doser. Imidlertid har denne fremgangsmåde ikke modtaget verdensomspændende videnskabelige acceptog er stærkt debatteret 5.
Det er klart, at flere undersøgelser er nødvendige for at afklare dette spørgsmål og eventuelt forbedre strålingsbeskyttelsesstandarder. Sådanne undersøgelser bør involvere kroniske behandlinger (bedste tilnærmelse af miljø- og erhvervsmæssig eksponering), in vivo dyremodeller (bedst til at ekstrapolere virkninger for menneskers) og sådanne endepunkter som DNA skader priser, DNA-reparation og mutagenese. Det er kendt, at DNA er det primære mål for at beskadige strålingsvirkninger og ufuldstændig eller mis-reparation kan føre til mutagenese og cancerudvikling 6.
DNA dobbelt-strenget pauser (DSB) er en af de mest skadelige typer af DNA-læsioner og kan føre til celledød og tumorigenese 7. Det er derfor vigtigt at være i stand til pålideligt og nøjagtigt at måle niveauet af DSB efter udsættelse for lav dosis stråling og / eller andre stressfaktorer, såsom kemiske forurenende stoffer. En af de mest følsomme og specifikke markøreraf DNA DSB phosphoryleres histon H2AX, kaldet γH2AX 8, men andre markører og fremgangsmåder er blevet foreslået 9,10. Det anslås, at tusindvis af H2AX molekyler, i nærheden af en induceret DSB, er involveret i dannelsen af γH2AX muliggør påvisning af enkelte DSB af immunfluorescerende mærkning med et anti-γH2AX antistof og fluorescensmikroskopi 11. Reaktionen er meget hurtig og nåede sit maksimum mellem 30 og 60 min. Bevis for, at γH2AX letter reparation af DNA DSB ved at tiltrække andre reparationsfaktorer til de steder, pauser og ved at ændre chromatinstruktur at forankre brudte DNA ender og give adgang til andre reparation proteiner (gennemgået i 12). Ved afslutningen af reparation af DNA DSB, bliver γH2AX de-phosphoryleret og / eller undergår nedbrydning, og nyligt syntetiserede H2AX molekyler erstatter γH2AX i de berørte områder i kromatin 10. Overvågning dannelse og tab af γH2AX kan,derfor give et nøjagtigt estimat af DNA DSB-reparation kinetik. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at undersøge reparation af DSB i forskellige humane tumorcellelinjer bestrålet med høje doser af stråling og dens hastighed og resterende DSB niveauer er blevet vist at korrelere med radiosensitivitet 13-15.
Vi ændrede denne eksperimentelle tilgang og anvendt det til en in vivo mus undersøgelse for at undersøge virkningerne af lave doser af kronisk γ- og β-bestråling på DNA DSB-niveauer og reparation (figur 1). For det første viser vi en metode til at udføre en langvarig kronisk eksponering af mus for at β-stråling enten udsendes af tritium (hydrogen-3) i form af tritieret vand (HTO) eller som organisk bundet tritium (OBT) opløst i drikkevand . De to former forventes at akkumulere og / eller distribuere forskelligt i kroppen og derfor fremstille forskellige biologiske virkninger. Begge former er potentielle farer i nukleare industri. Denne behandlinger parallelt med kronisk eksponering for γ-stråling ved en ækvivalent dosishastighed for at tillade en korrekt sammenligning af de to strålingstyper, som er afgørende for vurderingen af deres relative biologiske effektivitet. Beta-stråling er sammensat af elektroner, hvilket gør det meget forskellig fra γ-stråling, høj energi fotoner. På grund af denne forskel, Β-stråling betegner meste intern sundhedsfare og kan frembringe forskellige biologiske virkninger sammenlignet med γ-stråling. Denne komplikation resulteret i væsentlige kontroverser over reguleringen af udsættelse for β-stråling fra HTO. Således regulatoriske niveauer af HTO i drikkevand for offentligheden varierer fra 100 Bq / l i Europa til 75.000 Bq / l i Australien. Det er derfor vigtigt at sammenligne biologiske virkninger af HTO til ækvivalente doser af γ-stråling. For det andet er antallet af DNA DSB målt i isolerede splenocytter efter afslutningen af kroniske eksponeringer ved hjælp immunofluorescently mærket γH2AX opdageed ved flowcytometri. Dette tillader evaluering af omfanget af DNA-skade påført af de in vivo engagementer. Men det er fornuftigt at forvente, at sådanne lavt niveau eksponering ikke kan frembringe nogen påviselige satser DNA DSB; stedet, nogle skjulte ændringer / svar kan forventes, at ville påvirke cellernes evne til at reparere DNA-skader. Disse ændringer, hvis det findes, kan være enten stimulerende (at frembringe en fordelagtig virkning) eller hæmmende (der producerer en skadelig virkning). Den foreslåede protokol tillader afslørende sådanne ændringer ved at udfordre de ekstraherede splenocytter med en høj dosis af stråling, der producerer en betydelig mængde af skader (f.eks 2 Gy producerer ca. 50 DNA DSB per celle eller en 3 -. 5 gange stigning i total γH2AX niveau) . Efterfølgende dannelse og tab af γH2AX, hvilket afspejler initiering og afslutning af DSB-reparation, overvåges ved flowcytometri. På denne måde kan måles ikke blot basal og behandlingsrelaterede inducerede niveauer af DNA DSB, menogså dens potentielle virkning på cellernes evne til at reagere og reparere DNA skader fremkaldt af meget højere stressor niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle håndterings- og behandlingsprocedurer mus skal overholde regler, der er fastsat af lovgiver og / eller animalsk plejeprogrammer og godkendt af en lokal dyr pleje udvalg. Alle metoder, der er beskrevet i denne protokol blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i den canadiske Rådet om Animal Care med godkendelse af den lokale dyrepleje udvalg.
ADVARSEL: Alt arbejde med radioaktivitet (herunder, men ikke begrænset til håndtering af tritium, ekstern γ-bestråling, håndtering af radioaktive animalsk væv, sengetøj affald) skal overholde regler, der er fastsat af strålingsbeskyttelse lovgiver og / eller myndigheder, og skal udføres af autoriseret personale i et certificeret laboratorium og / eller facilitet.
1. Animalske Work
- Animal gruppering
- Hvis mus ankommer fra en ekstern organisation, akklimatisere dyr i mindst 10 dage i dyret facilitet. Hvis undersøgelsen indeholder flere behandlingsgrupper, at leverandøren dyr kan sende all dyr som et enkelt parti.
- Tilfældigt tildele mus til behandlingsgrupper af 10 mus per gruppe. Hvis bruger hanmus af C57BL / 6-stammen, har dyret leverandør pre-arrange randomisering af meget unge C57BL / 6 hanner i deres anlæg til at mindske aggression problemer.
- Kronisk eksponering af mus til Intern β-stråling
- Forbered arbejder koncentrationer af tritium (10 kBq / L og 1 MBq / l) i muse drikkevand ved at fortynde den oprindelige bestand af HTO og OBT (en blanding af tritieret prolin, alanin og glycin aminosyrer) løsninger.
- Validere de endelige koncentrationer af tritium i drikkevandet ved måling af radioaktivitet under anvendelse af en væskescintillationstæller. Juster koncentrationer, hvis det kræves.
- Behandle dyr i en måned ved at give adgang ad libitum til tritium vand. Hvis behandling vand bliver for lav i perioden to uger, tilsættes mere vand. Ellers ændre flasker på to uger.
- Treat fingeret bestrålet kontrolmus identisk. Opbevar dem i en separat "ren" værelse eller på en separat "ren" rack under positivt lufttryk for at undgå tritium krydskontaminering fra luften.
- Kronisk eksponering af mus til ekstern γ-stråling
Bemærk: γ-bestråling facilitet / udstyr vil variere afhængigt af placeringen. - Ved hjælp af tilgængelige metoder til dosimetri, bestemme afstande fra en γ-stråling kilde, der har strålingsfelter producerer de ønskede doser. Sikre homogenitet af strålingsfelter inden for de områder, der dækker dyrenes bure.
Bemærk: 1.7 μGy / h svarer til en dosishastighed produceret af 1 MBq / L tritium i kroppen. - Udsætte mus ved at placere musen bure på afstandene bestemt i trin 1.3.1 i en måned. Minimere daglig afbrydelse af γ-bestråling til 30 min. Brug thermoluminescence dosimetre til måling samlede absorberede doser.
2. Ofre og Sampling
Note: Ekstraherede milte kan holdes i 60 mm skåle med medier (i op til 2 timer), mens resten af musene sacrificred. Afhængig af antallet af mennesker, der deltager, mellem 5 og 15 mus kan behandles på én dag.
3. Fremstilling af splenocytkulturer
- Homogenisere milten ved hakning inde i en celle si med steril pincet med en buet ende.
- Fjern cellefilter og indsamle den filtrerede cellesuspension fra 60 mm skål i et 15 ml rør.
- Skyl cellefilter med 5 ml medium til at indsamle den resterende del af cellerne.
- Centrifugerør ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Dekanter supernatanten og resuspender pellet i 10 ml RPMI.
- Centrifugerør ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Dekanter supernatanten og resuspender pellet i 5 ml RPMI.
- Overførsel 4 ml cellesuspension i en 25 ml vævsdyrkningskolbe og fjern til CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2, 80% fugtighed)
4. Udfordrende Bestråling og Fixing
- Overførresterende 1 ml cellesuspension fra trin 3.8 i et 1,5 ml rør på is og centrifugeres ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C. DNA beskadigelse målt i denne prøve vil repræsentere både behandling-induceret beskadigelse og t = 0 data-punkt for konstruktionen af en DNA-reparation kurve.
- Aspirere omhyggeligt supernatanten under anvendelse af en vakuumpumpe. Blidt genopslæmmes pellet i 1 ml TBS-buffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCI).
- Centrifugerør ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirere omhyggeligt supernatanten under anvendelse af en vakuumpumpe. Forsigtigt re-suspendere pellet i 300 pi TBS.
- Under blanding på en hvirvel ved lav hastighed, tilsættes 700 pi -20 ° C 100% ethanol. Luk låget og vend et par gange for at blande.
- Opbevare prøverne ved -20 ° C. Splenocytter fastsat i ethanol kan opbevares ved -20 ° C i mindst 12 måneder uden mærkbart tab i γH2AX signalet.
- Bestråle splenocytkulturer fra trin 3.8 med en udfordrende γ-rad iation dosis på 2 Gy i en dosis på ≥ 200 mGy / min under anvendelse af tilgængelige bestrålingsanordning.
Bemærk: Formålet med denne bestråling er at inducere DNA DSB til at udfordre reparation maskiner. Røntgenstråler kan også anvendes til dette formål. - Straks returnere kulturerne til en CO2-inkubator.
- 1 time efter den udfordrende 2 Gy bestråling fjerne kulturer fra inkubatoren til et biologisk sikkerhedsskab. At indsamle en repræsentativ prøve portion, forsigtigt igen suspendere celler ved hjælp af en pipette og overførsel 1 ml af cellesuspensionen til et 1,5 ml rør på is. Returnere cellekulturerne til en CO2-inkubator.
- Centrifugerør ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirere omhyggeligt supernatanten under anvendelse af en vakuumpumpe. Forsigtigt re-suspendere pellet i 1 ml TBS.
- Gentag trin 4,3-4,5.
- 24 timer efter udfordrende 2 Gy γ-stråling, høst og løse på = 24 timer prøve som beskrevet i trin 4,8-4,10.
Bemærk: Typisk 15 - kan 30 prøver om dagen være immunofluorescently mærkes og analyseret ved flowcytometri i en enkelt løb. For at sikre en nøjagtig sammenligning mellem behandlingsgrupper, indbefatter prøve (r) fra hver gruppe. Se også Referencer 16 for yderligere oplysninger.
- Forbered en mærket sæt rør til det antal prøver, der skal behandles og sted på is. Brug 12 x 75 mm reducerede glas rør. Sterilitet er ikke påkrævet for dette arbejde. Medtag en ekstra historisk prøve til mærkning med sekundært antistof kun kontrol ("kun 2nd Ab"). Brug denne historiske kontrolprøve i hver flowcytometri køre inden for en undersøgelse.
- Tilsættes 0,5 ml iskold TBS til hvert rør.
- Fjerne faste splenocytter fra -20 ° C, vortex i 5 sekunder og overføre en 0,5 ml alikvot tilberedte rør med TBS. Placer de resterende prøver tilbage i -20 ° C opbevaring ogholde som backup prøve.
- Centrifuger splenocytter ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og forsigtigt resuspender pellet i 1 ml iskold TBS indeholdende 1% FBS
- Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres og forsigtigt resuspender pellet i 1 ml TST-buffer (0,05% Triton X-100, 2% FBS i TBS). Der inkuberes i 20 minutter på is.
- Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres og forsigtigt igen suspendere pellet i 200 pi primære anti-γH2AX antistof fortyndet 1: 150 i TST buffer. Anvende 200 pi TST til "2nd Ab kun" kontrolprøve.
- Position reagensglas til et roterende rysteapparat ved en vinkel på 45-60 ° og omrystes i 1,5 timer ved 300 xg ved stuetemperatur.
- Mens rørene er inkubering, udarbejde et tilstrækkeligt volumen (200 ul / prøve) af gede-anti-muse-sekundært antistof konjugeret med Alexa-488 ved en 1: 200 fortynding i TST-buffer.
Bemærk: Alt arbejde, der involverer Alexa-488konjugeret antistof (trin 5,10-5,16 nedenfor) bør ske under dim lysforhold og mærket prøver bør beskyttes mod lys ved indpakning rør i aluminiumfolie. - Når 1,5 timer inkubation er afsluttet, tilsættes 1 ml iskold TBS indeholdende 2% FBS til hvert rør og centrifugeres ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C. Dekanteres og forsigtigt resuspender pellet i 1 ml TBS indeholdende 2% FBS.
- Centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og forsigtigt resuspender pellet i 200 pi af det sekundære antistof opløsningen fra trin 5.8.
- Inkuber prøverne på et rystebord i 1 time som i trin 5.7.
- Der tilsættes 1 ml iskold TBS indeholdende 1% FBS.
- Centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres supernatanten og forsigtigt igen suspendere pellet i 1 ml iskold TBS.
- Centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres og forsigtigt resuspender pellet i 0,5 ml TBS indeholdende 50 ug / mlpropidiumiodid.
- Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Analysere prøver på et flowcytometer bruge instrumentspecifikke protokoller 16. Læse mindst 10.000 celler pr prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser eksempler på flowcytometri grafer forventes for splenocyter fremstillet ved den her beskrevne metode. Celler først gated baseret på <elektronisk volumen-side scatter> punktdiagram (figur 2A og 2D, elektronisk volumen svarer til fremad spredning). FL3 / propidium jod histogrammer (figur 2B og 2E) bekræfter normal cellecyklus distribution. Mean γH2AX signal beregnet under anvendelse af FL1-kanalen bekræfter en> 2-fold stigning i DNA DSB i 2-Gy bestrålede celler (figur 2F) sammenlignet med den ubehandlede kontrol (figur 2C). Dernæst undersøgte vi følsomheden af den beskrevne fremgangsmåde til måling immunofluorescently mærket γH2AX ved flowcytometri i musesplenocytter Figur 3A viser γH2AX niveauer, der indikerer DNA DSB, i musesplenocytter. 1 time efter ex vivo eksponering for enten lav (0,1Gy) eller høje (2 Gy) doser af γ-stråling i forhold til den ubehandlede kontrol. Det kan ses, at 0,1 Gy inducerede en svag stigning i DSB niveau, og at stigningen var statistisk signifikant. Den stærke 3-fold induktion var forventet og opdaget efter 2 Gy eksponering. For at validere specificitet γH2AX immunofluorescent mærkning som beskrevet i protokollen, blev mærkede celler undersøgt med et fluorescens mikroskop. Den markante foci-lignende observerede mønster indikerer, at fluorescens-signalet stammer fra den enkelte DNA DSB i kromatin (figur 3B).
Repræsentative resultater af vurderingen af DNA DSB-sats og reparation i splenocytter fra mus eksponeret for en måned til meget lave koncentrationer af tritieret vand (10 kBq / L) er vist i figur 4. Det kan ses (figur 4A), at selv om behandling resulterede i en stigning på 10% af det basale γH2AX niveau, ændringen var ingent statistisk signifikant (N = 5, one-sample Students t-test). Endvidere den målte dannelse og tab af γH2AX efter den udfordrende 2 Gy bestråling, svarende kinetik DNA DSB-reparation, var ikke forskellig mellem cellerne fra en kontrol- og HTO-behandlede mus (figur 4B).
Figur 1. Eksperimentel diagram for at evaluere effekten af kronisk in vivo bestråling på DNA beskadigelse og DNA-reparation. Efter in vivo-behandling af mus med kronisk bestråling i et ønsket tidsrum aflives musene og splenocytkulturer etableres og udsat for en udfordrende bestråling. Splenocyt alikvoter opsamles og fikseret på forskellige tidspunkter efter den udfordrende dosis. Niveauer af γH2AX måles derefter under anvendelse af immunofluorescens laBeling og påvisning ved hjælp af flowcytometri. Plottet i bunden af figuren viser skematisk forventede data. Gamma-H2AX niveau drastisk øger tidligt efter den udfordrende bestråling efterfulgt af et fald tilbage til kontrolværdien, hvis DNA-reparation er færdig. DNA-skader Δ repræsenterer de skader som skyldes de eksperimentelle behandling af mus og DNA-reparation Δ repræsenterer effekten af behandling af mus på DNA DSB-reparation kapacitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentativ flowcytometri rådata. (A, D) Scatter plots og gating regioner for splenocytter og cellerester og erythrocytter. (B, E) DNA histogrammer repræsenterer cellecyklus distributioner.
Figur 3. Påvisning af γ H2AX ved flowcytometri er følsom og specifik. (A) Splenocytter frisk isolerede fra mandlige CBA-mus blev bestrålet med enten 0,1 eller 2 Gy af γ-stråling eller sham-behandlede og lov til at udvikle γH2AX respons i 1 time. Celler blev derefter fikseret, immunofluorescentlymærket med anti-γH2AX antistof og analyseret ved flowcytometri. Normaliserede middelværdier ± SD er vist (N = 12). * Og *** betyde statistisk forskel med p <0,05 og p <0,001, respektfuldt (en prøve Students t-test). (B) Repræsentative mikrofotografier af ubehandlet kontrol (UT) eller 2 Gy bestrålede splenocytter immunofluorescently mærket med anti-γH2AX antistof. Den foci-lignende mønster af grøn fluorescens bekræfter specificitet immunofluorescerende mærkning af γH2AX. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative resultater viser manglende effekt produceret af 1-måneds eksponering af mus for tritieret water (HTO) på DNA DSB-niveau og reparation. (A) Splenocytter blev isoleret fra mus behandlet med 10 kBq / L af HTO i drikkevandsforsyninger og kontroldyr. Niveauet af γH2AX blev målt under anvendelse immunfluorescent mærkning og flowcytometri som beskrevet i protokollen. Mean γH2AX fluorescens niveauer i forhold til dem i kontrol ± SD er vist (N = 5). Disse data blev frembragt fra t = 0 time-punkt, som blev anvendt i figur 3B til evaluering af DNA DSB-reparation. (B) isoleret splenocytter blev udsat for en udfordrende 2 Gy dosis af γ-stråling, og portioner af celler blev fastsat til tidspunkt t = 0, 1 og 24 timer efter den udfordrende bestråling. Mean fluorescens af γH2AX forhold til sin egen t = 0 kontrol er vist ± SD (N = 5). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres i dette papir er nyttig til at gennemføre stor skala mus in vivo studier undersøger de genotoksiske virkninger af lave niveauer af forskellige kemiske og fysiske midler, herunder ioniserende stråling. Vores unikke SPF-dyr facilitet udstyret med en GammaBeam 150 strålerøret og en 30 meter lang bestråling hal tillader udførelse livslange undersøgelser med lav eller meget lav dosis sats bestrålinger på hundredvis eller endda tusindvis af mus. Mindre bestrålingsanlæg til kronisk lav dosis bestråling kan sættes op i et universitet eller hospital miljø, hvor radiobiologiske undersøgelser udføres rutinemæssigt og retningslinjer strålingsbeskyttelse / regler gennemføres. Men strengere regler normalt gælder for anlæg beregnet til intern dyr bestråling, hvor håndtering af radionuklider, såsom tritium, udføres. Selvom det er sjældent, laboratorier certificeret til sådanne undersøgelser interne stråling eksponering findes i forskellige resøgning institutioner verdensomspændende og deres unikke evner kan bruges til undersøgelser, der er beskrevet i denne protokol.
Inden protokollen, bruger vi immunofluorescent mærkningen af γH2AX præcist at vurdere DNA DSB satser produceret af eksperimentelle engagementer. Endnu vigtigere er, at der indføres en udfordrende bestråling leveret ex vivo til ekstraherede splenocytter gør det muligt at vurdere intakte DNA DSB respons (γH2AX niveau efter 1 time efter challenge), og af DNA DSB-reparation (γH2AX niveau ved 24 timer sammenlignet med 0 timer). Det skal bemærkes, at kvantificeringen af γH2AX foci per celle ved fluorescensmikroskopi kan tilvejebringe højere følsomhed sammenlignet med flowcytometri. For eksempel doser så lavt som 0,001 Gy blev rapporteret til at producere betydelige stigninger i antallet af γH2AX foci per celle. Men brugen af flowcytometri-baseret detektion af γH2AX tilbyder fordele i forhold til fluorescensmikroskopi analyse becabruge det kræver mindre tid til målinger, kræver det ikke højt specialiserede / uddannet personale, og den undgår subjektive beslutningstagning relateret til γH2AX foci anerkendelse og optælling. Disse fordele er kritiske for stor målestok dyrestudier. Et typisk dyreforsøg ved 10 behandlingsgrupperne og 10 mus per gruppe vil resultere i 100 x 3 = 300 milt prøver, hvis metoden foreslået (figur 1) følges. Til at generere data fra dette antal prøver, vil ca. 100 timer være nødvendig ved anvendelse af flowcytometri. Alternativt, hvis udført af manuelle mikroskopiske analyser, ville den samme opgave tage mindst 300 timer, ved hjælp af et konservativt skøn over 40 min af meget krævende mikroskop tid per prøve. Selv om forsøg på at automatisere analysen og scoring af γH2AX foci er blevet gjort 17-19, de alle har en række begrænsninger. Især den runde form og lille størrelse af musesplenocytter og lymfocytter gør det upraktisk at løse alle individual γH2AX foci mikroskopisk. Mens adhærente celler er med succes blevet scoret af automatiserede systemer til mikroskopi γH2AX foci har ingen succes blevet demonstreret for enten muse splenocytter eller lymfocytter.
Den bedste måde at fjerne dag-til-dag-variation i de målte værdier for γH2AX signal ved flowcytometri er at inkludere forsøgsgruppe og kontrolprøver i samme kørsel og til at beregne relative γH2AX ændringer inden hver kørsel. Yderligere anbefalinger kan nævnes: a) en historisk kontrol, der består af ubehandlet og 2 Gy bestrålede prøve bruges i alle løb; b) én person udfører alle procedurerne antistof mærkning; c) en enkelt bestand af buffere og en enkelt batch af antistof, både primære og sekundære, bruges til hele sættet af prøver inden et eksperiment. Det er også vigtigt at udføre en flowcytometer kvalitetskontrol test anbefales af instrumentets fabrikant rutinemæssigt og før hver kørsel af prøver. Dette er reqgendannes for at kontrollere instrumentets optiske tilpasning og fluidics systemet og hjælper også minimere dag-til-dag variation i målt γH2AX fluorescens mellem prøver, der skal sammenlignes, eller samlet i en gruppe.
Det skal bemærkes, at anvendelsen af et større antal tidspunkter (f.eks, 1, 2, 4, 6 timer) efter udfordrende bestråling kan hjælpe med at analysere og måle kortsigtede DNA DSB-reparation kinetik mere detaljeret 16. Imidlertid ville hellakering potentiale og sandsynligheden for forsinkede sundhedsvirkninger være repræsenteret ved den resterende skade først måles ved 24 timer og sammenlignet med den observeret ved den indledende tidspunkt (t = 0) 13-15 (figur 4).
Siden er kendt basale γH2AX niveauer at stige i gamle dyr eller senescentceller 20, for mere præcis fortolkning af de opnåede resultater i de lange eksponering mus undersøgelser (> 6 måneder) ved hjælp af den beskrevne metode, the brug af en ung ubehandlede gruppe, der ud over en alder-matchet kontrol, ville være tilrådeligt. Selv om nogle rapporter angiver, at γH2AX kan stige i prolifererende celler, som ikke ville være relateret til DNA DSB Dette kan let kontrolleres ved at måle S-fase og G2 / M-fase-cellefraktioner anvendelse af DNA-histogrammer (figur 2A, D). Hvis visse eksperimentelle betingelser stadig undgå en forsker fra at bruge γH2AX som en markør for DNA-skader (på grund af ovennævnte grunde eller deres kombination), et andet protein danner DNA-skader foci, såsom 53BP1, kan bruges 21.
Selvom vi ikke har forsøgt at bruge denne metode til ikke-lymfoide væv, såsom muskler, hjerte, hjerne og andre, forekommer det vanskeligt at forarbejde dem til flowcytometri. Vævssektioner og mikroskopi af γH2AX foci optælling ville være den foretrukne metode, hvis analyse af sådanne væv er påkrævet. Imidlertid er andre lymfoide celler, såsom perifert blod lymphocytes, knoglemarv lymfocytter eller thymocyter, kan anvendes til måling γH2AX niveauer ved den beskrevne fremgangsmåde. Fordelen ved at anvende milt-lymfocytter er den relative enkelhed af cellesuspension forberedelse og det store antal celler, som kan isoleres fra en milt. Dette bliver endnu mere fordelagtigt, hvis yderligere endepunkter er inkluderet i undersøgelsen. Det er vores erfaring, et typisk udbytte på splenocytter per mus muliggør indsamling af mindst 10 portioner, hver egnet til enhver af de følgende assays: flowcytometri, RT-qPCR for genet eller miRNA ekspression, Western blot, genomisk DNA for CpG-methylering assay. Således kan yderligere splenocyt portioner indsamlet parallelt med dem for γH2AX endepunkt anvendes til at måle ekspressionen af gener involveret i DNA damage signal- og reparation responser. Sådanne gener som GADD45A og CDKN1A, der normalt er transkriptionelt opreguleret som reaktion på cytotoksiske behandlinger 22, kan give et fingerpeg om, hvæssehendes celler er korrekt reagerer på den udfordrende stress indflydelse. Tilsvarende kan proteinniveauer og post-translationelle modifikationer, der er involveret i stressreaktioner vurderes. Endelig forventes det ikke, at nogen af trinene i udvinding procedure, hvis den udføres som beskrevet her, kan fremkalde γH2AX i splenocytter.
Det ville være gavnligt og stærkt anbefales at prøve yderligere organer og væv under ofre for at supplere DNA skader og reparation af data opnået for splenocytter som pr præsenteret protokol med andre endepunkter. For eksempel har vi rutinemæssigt indsamler knoglemarvsceller til in vivo knoglemarv mikronukleusanalysen, forskellige væv til senescens-associerede β-galactosidase og DNA reparation genekspression målinger. Evnen til at samle andre væv vil afhænge af den tilgængelige teknisk support i ofre; men det kan betydeligt hjælpe med den rette fortolkning af resultater, og opførelsen af en much mere biologisk relevant systemisk billede af svaret på det lave niveau behandling undersøges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
