Introduction
Herbiciden zijn de meest intensief gebruikt onkruidbestrijding maatregel, goed voor maximaal 50% van de wereldwijde markt van gewasbeschermingsmiddelen 1. Ze zijn relatief goedkoop gereedschap, voorkomen arbeidsintensief en tijdrovend grondbewerking praktijken, en uiteindelijk resulteren in een kosten-effectieve, veilige en winstgevende productie van levensmiddelen 2. Echter, de grote fenologische en genetische variabiliteit aanwezig in veel onkruidsoorten, samen met een over-afhankelijkheid van herbiciden gebruik, vaak resulteert in de selectie van de herbicide-resistente onkruid populaties. De introductie van selectieve herbiciden met een zeer specifieke metabole doelgroep 3-5 is dramatisch toegenomen het aantal gevallen verzet door de jaren heen. Tot op heden zijn 240 onkruidsoorten (140 tweezaadlobbigen en eenzaadlobbigen 100) wereldwijd resistentie tegen verschillende herbicide werkingsplaatsen (SOA) 4 ontstaan. Dit is een grote zorg voor het beheer van onkruid en meer in het algemeen voor de duurzame productie van gewassen.
e_content "> Vroege opsporing van resistentie, op basis van betrouwbare tests vaak uitgevoerd in een kas, is een belangrijke stap om herbicide resistente onkruiden te beheren. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld op basis van de doelstellingen, de gewenste mate van nauwkeurigheid, tijd en middelen beschikbaar zijn, zoals Naast de onkruidsoorten als 6-12. Wanneer echter de bevestiging van het resistentieprofiel van nieuwe onkruid biotype is vereist (dat wil zeggen een groep individuen die verschillende fysiologische kenmerken hebben, waaronder het vermogen om één of meer herbiciden behoren tot een overleven bepaalde groep toegepast in een dosis die ze normaal zouden regelen), een robuuste hele plant bioassay heeft in een gecontroleerde omgeving 4, 11 worden uitgevoerd.Een biotype is zelden bestand tegen slechts één herbicide. Elke biotype wordt dus gekenmerkt door een zekere resistentiepatroon, dwz, aantal en type van SoA van herbiciden is het bestand tegen en door een bepaalde weerstandniveau om elke herbicide 13. De vroege en betrouwbare bepaling van het patroon van kruis of meervoudige resistentie 5, 14 is belangrijk voor veldresistentie management.
Vermeldenswaardig is dat herbicideresistentie heeft niets te maken met de natuurlijke tolerantie waard dat sommige onkruidsoorten vertonen richting sommige herbiciden, bijvoorbeeld, tweezaadlobbige soorten vs. ACCase-remmende herbiciden, eenzaadlobbige soorten vs. 2,4-D, heermoes vs. glyfosaat.
Dit document presenteert een robuuste aanpak voor het testen van vermeende herbicide resistente biotypen bemonsterd op gebieden waar de slechte controle van herbicide (s) had gemeld. Relevant varianten de standaardprotocollen met betrekking tot de onkruidsoorten betrokken worden. De voordelen ten opzichte van alternatieve technieken / protocols gebaseerd op ofwel hele plant bioassays met één herbicide dosis 15 of behandelen zaden in Petrischalen 8 zijn aan de hogere reliabiliteit en kan worden afgeleid van de weerstand door de toevoeging van twee herbicide doses in de experimenten. Voor routine resistentietest, dezelfde werkwijzen kunnen worden toegepast op slechts één herbicide dosis, zodat de kosten verlagen.
Evenals waardoor bevestiging van de status van de weerstand, kan de verkregen informatie worden gebruikt voor zowel het optimaliseren van de volgende stappen in het onderzoek en / of het bedenken van geluid weerstand management strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zaad Sampling en opslag
- Monitor akkers voor ongerechtvaardigde slechte herbicide, dwz niet te wijten aan ongunstige klimatologische omstandigheden of lage kwaliteit herbicide behandelingen.
- Verzamel een zaadmonster van één soort in een tijd en wijs een unieke code. Rijpe zaden worden meestal verzameld voordat gewassen oogsten van planten die het herbicide behandeling (s) had overleefd. Tijdige-monitor om te zien of de zaden worden vergoten door de moederplant wanneer rijp.
- Vul een formulier voor elk monster met vermelding van de toegekende unieke code, naam van de soort, de collectie datum, GPS-coördinaten, de gemeente, de naam van de landbouwer, veldgrootte, besmetting niveau, gewas, herbicide (s) gebruikt tijdens het seizoen en historische verslagen van het veld .
- Verzamel zaden van ten minste 30 willekeurig geselecteerde planten die representatief zijn voor het veld besmetting zijn. Zorg ervoor dat het zaad sample bevat ten minste 5000 rijpe zaden. Voor een obligaat uitkruising onkruidsoorten(Bijvoorbeeld Lolium spp. En Amaranthus spp.), Vermindering van het aantal planten 10-15, waarbij het totale aantal zaden ongeveer 5000 11.
- Sub-proeven van het veld als flarden van onkruid zijn verspreid over grote gebieden (meer dan een hectare) als verschillende herbicide resistente biotypen worden geselecteerd.
- Store zaden in niet-gesloten papieren zakken gelabeld met de unieke code toegewezen.
- Laat vocht verdampen maar zaden niet bloot aan hoge temperaturen (dat wil zeggen, voorkomen dat ze in een auto in de zon) of voor extreme temperatuurschommelingen de inductie van secundaire slaaptoestand te voorkomen.
- Clean (verwijderen kaf, de romp seeds, etc.) en opgeslagen bij omgevingstemperatuur in een droge ruimte. Na het uitvoeren van de eerste resistentietoetsen, slaan de zaden gedurende langere tijd in een donkere kamer bij 4 ° C, bij voorkeur in vacuum afgesloten plastic zakken. Op deze manier zaden hun levensvatbaarheid te behouden voor een aanzienlijk langere tijd.
OPMERKING: kiemrust biedt een flexibele en efficiënte mechanisme dat onkruid staat stelt zich aan te passen en volharden in agro-ecosystemen. Om kiemrust verbreken en laten ontkiemen van zaden, verschillende protocollen moeten worden gebruikt afhankelijk van onkruidsoorten, bijvoorbeeld, het type kiemrust 16.
Er zijn drie belangrijke manieren om slaaptoestand te verwijderen:
- Vernalisatie
OPMERKING: Om gelijktijdige kieming en zaailing opkomst, een periode van zaad vernalisatie variërend van een paar dagen tot een week te verkrijgen is vereist om fysiologische slaaptoestand van vele soorten te verwijderen:. Bv papegaaienkruid, Chenopodium album, Lolium spp, Avena fatua, Polygonum Persicaria , Phalaris paradoxa 17-19. Een langere periode van maximaal 15 dagen is vereist Papaver rhoeas, Cyperus difformis en Ammania coccinea en tot 30 dagen Schoenoplectus mucronatus- Doe wat gedemineraliseerd water in plastic schaaltjes. Snij twee lagen filterpapier en genieten ze in het water, verwijder overtollige hoeveelheden. Plaats de zaden luchtgedroogd op het papier. Breng de plastic schaaltjes een koelkast bij 4 ° C gedurende de vereiste tijdsperiode.
OPMERKING: sommige onkruidsoorten zijn recalcitrant kieming dan anderen door mechanische slaaptoestand, namelijk zaadhuid kenmerken en de aanwending van een chemische scarification gebruiken zwavelzuur ontkiemen 21.
- Bereid een bekerglas met geconcentreerd zwavelzuur (95-98%). Bereid een beker vol water. De zaden in een omhulsel van niet-geweven stof.
- Geniet bijvoorbeeld Echinochloa spp. Of Sorghum halepense zaad voor 20 min of 5 min, respectievelijk in geconcentreerd zwavelzuur.
- Neem de envelop uit de beker met behulp van een pincet en zet het in de beker vol met water. Open deenvelop, zet de zaden in een klein vergiet en spoel ze grondig onder stromend water.
- Week de zaden gedurende 2 minuten in chloroform. Spoel de zaden met gedemineraliseerd water en droog ze met absorberend papier. Dompel de zaden in 80% zwavelzuur gedurende 5 min.
- Doe de zaadjes in een klein vergiet en spoel ze grondig onder stromend water.
OPMERKING: Zaden van andere onkruidsoorten helemaal niet ontkiemen voor een paar maanden na de vervaldag, ongeacht de gebruikte methode om kiemrust te breken.
- Bewaar de zaden voor een periode van ten minste 3-4 maanden bij RT en een lage luchtvochtigheid en volg de bovenstaande protocollen voor kiemrust verbreken (bijvoorbeeld, Oryza sativa var. Sylvatica of P. rhoeas).
3. zaadontkieming
- Place zaden worden ontkiemd in plastic platen met 0,6% (m / v) agar met 0,1% kaliumnitraat (KNO 3) toegevoegd:
- Bereid een oplossing van agar bij 0,6% + 0,1% KNO 3 via gedeïoniseerd water. Los de agar in een magnetronoven.
- Giet de agar oplossing in plastic schaaltjes. Koel de substraat en vervolgens in de zaden.
- Plaats plastic schotels in een kiemkast voor ongeveer een week met licht en temperatuur afhankelijk van de optimale omstandigheden voor elk onkruidsoorten. Voor de meeste soorten winter, is het temperatuurbereik 15/25 ° C nacht / dag en 12 uur fotoperiode met neonbuizen die een fotosynthetische Photon Flux Density (PPFD) van 15-30 umol m -2 sec -1. Voor veel soorten zomer, is het temperatuurbereik 15/30 ° C nacht / dag.
Variant: Some species, zoals S. halepense, moet een warmtebehandeling. Dus na de scarification, zaden van S. halepense worden onderworpen aan de volgende voorwaarden: cycli van 4 uur bij 45 ° C en 20 uur bij 24 ° C gedurende drie dagen in de kiemkast en vervolgens drie dagen onder normale omstandigheden.
4. Seedling transplanteren en groei
- Transplant vijftien tot twintig zaailingen in plastic bakjes (325 x 265 x 95 mm) gevuld met een standaard potgrond (60% slibrijke leemgrond, 15% zand, 15% en 10% agriperlite veen - in volume).
OPMERKING: Verplanten plaats van direct inzaaien, kan een uniforme stand van planten in hetzelfde groeistadium te verkrijgen, hetgeen een belangrijke voorwaarde voor de uitvoering van de herbicide behandeling optimaliseren. - Identificeer elke lade met een barcode met alle informatie voor de unieke identificatie: bevolking code, herbicide wordt getest, repliceren nummer en progressieve lade nummer <./ Li>
- Plaats trays in een verwarmde kas en waterplanten als nodig is om het substraat op of nabij veld te handhaven.
OPMERKING: De groei varieert, afhankelijk van de onkruidsoorten. Vaak tests worden uitgevoerd in de herfst / winter / voorjaar, zo licht wordt aangevuld met 400 W metaalhalogeenlampen, die een PPFD voorzien van ongeveer 150 umol m -2 s -1 en een 12 uur fotoperiode 24, 19. Zomer wiet soorten met C 4 fotosynthetische cyclus vereisen doorgaans een hogere lichtsterkte en dus tests worden gedaan in de late lente-zomer of de aangevuld lichtintensiteit is ongeveer 400 umol m -2 sec -1 met een 14 uur fotoperiode. - Gebruik een ander protocol voor sommige onkruidsoorten geïnfecteerd padie, bijvoorbeeld, A. plantago-aquatica, S. mucronatus en C. difformis zoals beschreven in 22.
- Transplantatie de zaailingen in polystyreen trays met 24 round-cellen (55 mm, 64 mm diep) filled met 60% siltig leemgrond, 30% zand en 10% turf (volumeprocent).
- Zet de trays in 12 cm diep plastic containers gevuld met water en battened door geschroefd roestvrij stalen staven om te voorkomen dat ze te drijven (figuur 1).
- Behoud waterniveau in de containers op 1-2 cm onder het niveau van het bodemoppervlak en voeg 1,5 g kopersulfaat om elke container de algengroei te voorkomen (die 10-12 liter water bevat).
5. Herbicide Behandelingen
- Behandelingen met pre-herbiciden:
- Na ongeveer drie dagen in de kiemkast zoals beschreven in paragraaf 3, verplanten de kiemende zaden in plastic bakjes met de hierboven beschreven substraat en bedekken met een laag van de bodem (ongeveer 1 cm). Dit is een kritieke stap in zodat zaailingen niet zal ontstaan vanwege het herbicide effect dan een buitensporig ingraafdiepte.
- Neem het substraat veld Capaplaats door het plaatsen van de bakken, die enkele gaten aan de onderzijde, op schotels gevuld met water.
- Eén dag na het uitplanten, behandel het laden met de pre-totstandkomingsherbicide 25.
- Houd het substraat bij of nabij veldcapaciteit door toevoeging van water indien nodig zowel boven als onder door capillariteit van de schotel. Deze werkwijze bevordert de duurzaamheid van het herbicide op de juiste diepte (waarbij de kiemende zaden) van een behandelingseffectiviteit.
- Behandelingen met post-opkomst herbiciden:
- Spray planten toen ze de 2-3 bladstadium te bereiken (dat wil zeggen, groeistadium 12-13 van de Extended BBCH groei schaal 26).
- Vanaf de dag na de behandeling, stel het irrigatiesysteem volgens de waterbehoefte van de onkruidsoorten en het seizoen (bijvoorbeeld voor Echinochloa spp. Het levert water voor 3 min 4 keer per dag, met regelmatige tussenpozen van 9 uur tot 9 pm). Water is disbijgedragen door middel van een automatische beregening systeem.
Variant: glyfosaat wordt toegepast in de fabriek fase BBCH 14-21.
- Herbicide bereiding en distributie.
Opmerking: Alle herbiciden (voor en na opkomst) toegepast als commerciële bereidingen met aanbevolen oppervlakte op twee doses aanbevolen dosis veld (1x) en drievoudige (3x).- Indien nodig, de voorbereiding van de oppervlakte-actieve oplossing in bulk volgens de instructies op het etiket; de eindconcentratie wordt gewoonlijk uitgedrukt als een percentage van het uiteindelijke volume (bijvoorbeeld 0,3%) of volume te verdelen per oppervlakte-eenheid (bijvoorbeeld 1 L ha -1).
- Gebruik surfactansoplossing als oplosmiddel voor het herbicide (opgeloste) oplossing om de juiste concentratie van het werkzame bestanddeel houden. Bereid de meest geconcentreerde herbicide oplossing eerst (3x). Bereken de hoeveelheid handelsproduct te worden opgelost in de oplossing van oppervlakteactieve stof (of gedeïoniseerd water als eensurfactant is niet nodig) met behulp van de volgende vergelijking:
Dosis kruid = [(Dosis veld x Dosis max) x V fin] / V del
Waar: Dosis herb = herbicide dosis (ml), dosis field = herbicide veld dosis (ml ha -1), max = maximum dosis toegediende, fin V = eindvolume van de oplossing (L), V = volume del van het geleverde bench spuit (L ha -1). - Verdun (2: 1, v / v) van de herbicide oplossing 3x de minder geconcentreerde ene (1x) bereiden. Deze procedure reduceert de kans op fouten bij het afwegen of pipetteren herbiciden. Herbicide Concentratie wordt uitgedrukt als volume te verdelen per oppervlakte-eenheid (L ha -1).
- Start de sequentie van behandeling met het herbicide lagere dosis (1x). Op deze wijze behoeft de sproei kast wassen tussen twee behandelingen met dezelfde herbicide.
- Verdeel de herbicide solution met een precisie bench spuit levert 300 L ha -1 (± 1%), bij een druk van 215 kPa en een snelheid van 0,75 m sec -1, een arm voorzien van drie platte ventilator (extended range) hydraulische nozzles .
- Was het spuiten kabinet twee keer wanneer het herbicide wordt gewijzigd met bleekwater 1% (v / v) en spoel.
Variant: glyfosaat wordt met een sproeivolume van 200 l ha -1 27.
OPMERKING: Bijzondere aandacht moet worden besteed bij zeer biologische bestrijdingsmiddelen, zoals de sulfonylureas sulfometuron of flazasulfuron, worden gebruikt. In het laatste geval doet een wassing met een bleekmiddeloplossing en andere met ammonia (2,5% v / v), gevolgd door zorgvuldig spoelen met water.
6. Verzameling en analyse van de gegevens
- Door middel van een barcode-lezer, die automatisch herkent elke lade, nemen het aantal planten dat de behandeling als de Visual Geschatte Biomassa (VEB) heeft overleefd. Planten zijn kontgineel zo dood als ze tonen geen actieve groei ongeacht kleur of ander uiterlijk.
- Maak de beoordeling drie of vier weken na behandeling (WAT) afhankelijk van de geteste herbiciden (bijvoorbeeld drie WAT voor ACCase remmers en vier WAT voor ALS-remmers of glyfosaat).
- Evalueer de algemene werkzaamheid van de behandeling door het opnemen van een vatbare populatie (check S) in alle experimenten, dat wil zeggen, een populatie in een site die nooit of zelden behandeld met herbiciden was verzameld.
- Express planten overleven als percentage van het aantal behandelde planten, telde net voor het herbicide behandeling, en het berekenen van de standaardfout (SE) per gemiddelde waarde (gemiddelde waarde van de twee herhalingen).
- De VEB wordt verkregen door een visuele vergelijking van plantenbiomassa tussen behandelde en niet-behandelde controle van dezelfde populatie 25, 28. Een score, van 10 naar planten niet beïnvloed door het herbicide (vergeleken met de onbehandelde controle) tot 0 wanneerde planten duidelijk dood, wordt aan elke behandelde bak.
- Geeft populaties vier categorieën op basis van de resultaten van behandeling met twee doses herbicide resultaten: S wanneer minder dan 5% van planten overleefden de herbicide dosis 1x, SR bij overlevenden varieerden van 5% tot 20% bij herbicide dosis 1x, R wanneer meer dan 20% van de planten overleefden de herbicide dosering 1x en RR als overlevenden meer dan 20% bij herbicide dosis 1x en meer dan 10% bij herbicide dosering 3x 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de weerstand status van een vermeende resistente bevolking te beoordelen, is het van fundamenteel belang voor een vatbare controle in de test omvatten om de herbicide effectiviteit te controleren. De resultaten van een screeningtest uitgevoerd op blz rhoeas populaties, onkruid geïnfecteerd tarwe velden, worden in figuur 2, waarbij de effectiviteit van vier-herbiciden op een gevoelige controle (09-36) en de vermoedelijke resistente één (10-91) worden gepresenteerd. Populatie 09-36 werd volledig gecontroleerd door de ALS-remmer iodosulfuron terwijl slechts één installatie overleefde dosis 1x van de andere twee geteste ALS herbiciden, florasulam en tribenuron-methyl (Figuur 2). In plaats daarvan, ongeveer 60% van de planten van de bevolking van 10-91 overleefde zowel herbicide doseringen van iodosulfuron en tribenuron-methyl en ongeveer 50% overleefde de 1x dosis florasulam. Deze resultaten bevestigen dat bevolking 10-91 een hoge weerstand (RR) naar iodosulfuron en tribenuron-methyl en bestand(R) tot florasulam. Een andere reactie werd waargenomen met 2,4-D, een herbicide met een andere SoA (dwz bootst endogene auxine), wijd gebruikt om dicotyle onkruiden in tarwe controleren. Slechts 33% van de planten van de cheque S werden gedood dit herbicide bij doseringen 1x en VEB prijs was> 20% (figuur 2). Het gebrek aan werkzaamheid op de cheque bevolking niet bevestigen of populatie 10-91 is tegen dit herbicide of niet. In dit geval wordt aanbevolen om het experiment opnieuw uit te voeren en als de resultaten worden bevestigd, aan de S populatie veranderen. Een voorbeeld van een goede beheersing van de gevoelige controle wordt in figuur 3. De Echinochloa spp. populatie 07-16L werd volledig gecontroleerd door alle herbiciden bij de aanbevolen dosis veld (1x). In dit geval, kan men stellen dat bevolking 08-42 zeer kruisresistent tegen alle ALS-remmers getest, dat wil zeggen, azimsulfuron, bispyribac-Na, imazamox en penoxsulam. De niet-behandelde check van beide populaties is gemeld aan de linkerkant. Deze planten worden gebruikt om de VEB berekenen; de hoeveelheid biomassa wordt visueel geschat lade tray die een score van 10 bij de niet-behandelde controle en het toekennen van een score van 0 voor het repliceren zonder groene plantenweefsel, tot 10 wanneer de biomassa vergelijkbaar met de onbehandelde check (figuur 3).
Een ander voorbeeld van de output wordt in figuur 4, waarbij plantenoverleving van Lolium spp. glyfosaat weergegeven. De geteste populaties werden verzameld op basis van tarwe teeltsystemen waarbij glyfosaat uitoefent verschillende selectiedruk (dat wil zeggen, af en toe of 1-2 behandelingen per jaar of 3 keer per jaar). Planten werden gesproeid met vroeg stadium uitstoeling (BBCH 14-21) met twee doses van glyfosaat: 480 en 1440 g ae ha -1, waarbij de minimum en maximum aanbevolen dosis gebied vormen voor jaarlijkse onkruid (dwz therophytes) en die groei stleeftijd. Gegevens werden verzameld vier weken na de behandeling. Op basis van beide experimenten, zeven van de geteste populatie had een overlevingspercentage van 80% of meer (populaties 343, 383, 384, 403, 509, 512 en 537) en het laagste dosis toegepast, maar slechts 50% van de planten van populaties en 403 509 overleefde de hoogste dosis glyfosaat. Een bevolking had een overlevingskans van ongeveer 40% bij 1x dosis, terwijl slechts een paar planten van de bevolking 509 overleefde de laagste dosis en de bevolking 508 werd volledig gecontroleerd bij een bepaalde dosis. Samengevat toonden deze experimenten verschillende niveaus van resistentie tegen glyfosaat die vaak weerspiegeld het gebied geschiedenis van herbicide gebruik. Het niveau van glyfosaatresistentie was hoger voor de populatie die waren intensiever behandeld: dat wil zeggen, het aantal van het veld toepassingen per jaar en het aantal jaren van de selectie druk was hoger.
De beschreven voor een herbicide (figuur 4) protocol kan worden toegepast op vele anderen met diffehuren SoA; aldus het resistentiepatroon van één of meer populaties kunnen worden bepaald. Een voorbeeld van verzet patroon variabiliteit van Echinochloa spp. populatie wordt weergegeven in tabel 1. Historische verslagen van herbicide gebruik en teelt verkregen van de boer aangegeven dat ALS-remmende herbiciden waren de selectie middel (dwz penoxsulam of imazamox). De weerstand test werd ook uitgevoerd met drie ALS-remmende herbiciden (azimsulfuron, penoxsulam en imazamox) behoren tot verschillende chemische families, en één herbicide hebben van een andere SOA de ACCase-remmende herbicide profoxydim. De gevoelig cheque (07-16L) werd volledig gecontroleerd door alle herbiciden getest (tabel 1). Drie resistentiepatronen gedetecteerd dertien populaties geleid als zijnde resistent enkel ALS-remmers, vier populaties resultaat als bestand alleen de ACCase remmer profoxydim, en drie populaties vertoonden een veelvoud resistentiepatroon voor zowel de ACCase remmer profoxydim en ALS-remmers. Binnen iedere resistentiepatroon het mogelijk om verschillende biotypen, bijvoorbeeld vier populaties bestand tegen ALS-remmers overleefden enige behandeling met sulfonylurea azimsulfuron terwijl twee van de multiresistente populaties overleefden alleen behandeling met de ALS-remmer azimsulfuron maar waren heel gecontroleerd door penoxsulam en onderscheiden imazamox.
Figuur 1. Voorbeeld van C. difformis, een onkruidsoorten geïnfecteerd padie, experiment set-up. polystyreen trays worden in plastic containers gezet en geblokkeerd door geschroefd roestvrij stalen staven om te voorkomen dat ze zweven. Water wordt op 1-2 cm onder het niveau van het grondoppervlak paddy rijst omstandigheden nabootsen. De foto werd genomen vier weken na de behandeling.p_upload / 52.923 / 52923fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Reactie van twee P. rhoeas populatie post-opkomst herbiciden. Effect van iodosulfuron, tribenuron, florasulam en 2,4-D getest bij de aanbevolen dosis veld (1x) en op drie keer dat (3x) op plantaardige overleving (blauwe balken) en visuele schatting biomassa ( VEB, rode balken) van de gevoelige cheque (09-36) en van een resistente populatie (10-91). De beoordeling werd gedaan vier weken na de herbicide behandeling. Plantenoverleving en VEB zijn uitgedrukt als percentage van het aantal behandelde planten en VEB van de onbehandelde controles (%). De horizontale lijn op 20% van plantenoverleving vertegenwoordigt de onderscheidende drempel tussen resistente en vatbare populaties wanneer planten worden behandeld dosis 1x. Verticale balkenvertegenwoordigen standaard fouten berekend op basis van de gemiddelde waarde van de twee replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Resultaten van een visuele screening op twee Echinochloa spp. populaties. De gevoelige controle, 07-16L (S), en de resistente populatie, 08-42, werden getest met vier ALS-remmers (gerapporteerd rechts) bij twee doses, 1x en 3x, (gerapporteerd aan de onderkant). Voor de S check alleen de resultaten van de dosis 1x worden gemeld, omdat alle planten waren al geregeld bij die dosis. Drie voorbeelden van VEB score worden gerapporteerd in rood: 0 = alle planten dood, 10 = alle planten overleefden en biomassa is vergelijkbaar met de niet-behandelde (NT) cheque (gerapporteerd aan de linkerkant), 5 = biomassa is ongeveer de helft van die in een lade van de niet-behandeldecontroleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Percentage van plantaardige overleving voor tien Lolium spp. populatie getest met glyfosaat. Plant survival opgenomen in twee experimenten (blauwe balken en oranje staven voor exp. I en II, respectievelijk). De gegevens worden uitgedrukt als een percentage (%) van het aantal behandelde planten. Twee gevoelige controles werden volledig gecontroleerd op dosis 1x en worden derhalve niet weergegeven in de grafiek. Twee doses werden getest, het minimum (1x = 480 g ae ha -1) en de maximale (3x = 1440 g ae ha -1) doses gemeld op het etiket van het product. De horizontale lijn op 20% van de planten overleven vertegenwoordigt de discriminerende drempel tussen resistente en gevoelige bevolkingsgroepen als de planten waren traktatieed op dosis 1x. Verticale balken geven standaard fouten berekend op basis van de gemiddelde waarde van de twee replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Weerstand status van eenentwintig populaties van Echinochloa spp. Vatbaar cheque (07-16L) wordt gerapporteerd in het vet. Resistancelevels gegeven voor elk van de vier geteste herbiciden (één ACCase remmer, profoxydim, en drie ALS-remmers, azimsulfuron, penoxsulam en imazamox) in vier categorieën: S = minder dan 5% van planten overleefden de herbicide dosis 1x, SR = plantenoverleving varieerden van 5% tot 20% bij herbicide dosis 1x, R = meer dan 20% van planten overleefden de herbicide dosis 1x, RR = plantenoverleving was meer dan 20% bij herbicide dosis1x en meer dan 10% bij de dosis 3x. Verschillende resistentiepatronen belicht: red = resistentie slechts ACCase remmer, geel = resistentie slechts ALS-remmer (s), oranje = weerstand tegen ACCase remmer en ten minste een ALS-remmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende stappen in de protocollen zijn van cruciaal belang voor een succesvolle evaluatie van herbicideresistentie in een populatie: 1) zaden moeten worden verzameld bij volwassen uit planten die het herbicide behandeling (s) had overleefd. Rijping van de zaden op de moederplant is cruciaal voor problemen bij zaadkieming later voorkomen; 2) de juiste opslag van de zaden wordt aanbevolen om de proliferatie van schimmels die kieming zou voorkomen dat te voorkomen; 3) zaailingen worden behandeld met de juiste groeistadium, zoals vermeld op het etiket van de verpakking herbicide. Wees voorzichtig dat planten te behandelen hebben ongeveer dezelfde groeifase bereikt; 4) het herbicide oplossingen moeten worden voorbereid en behandeld met een nauwkeurigheid, zodat planten worden besproeid met de juiste concentratie van de werkzame stof daardoor oncontroleerbaar fouten te vermijden; 5) na elke herbicide behandeling wordt aangeraden om de sproei behuizing grondig reinigen en glaswerk gebruikt om de oplossingen te bereiden om te voorkomenverontreinigingen in de volgende herbicide behandeling, vooral als biologisch zeer actieve herbiciden zijn betrokken.
De hierin gepresenteerde protocol kan gemakkelijk worden aangepast om een groot aantal onkruidsoorten de nodige aanpassingen naar soort en herbiciden plaats. Met name methoden om kiemrust te breken en voor kieming zijn stappen die moeten worden heroverwogen voor elke nieuwe onkruidsoorten (zie rubrieken 2 en 3). Sproeien apparatuur moet soms aanpassingen wanneer verschillende herbiciden worden gebruikt, bijvoorbeeld, glyfosaat vereist andere instellingen van de spuiten kast (zie paragraaf 5.3) en de planten worden behandeld in een later groeistadium dan bij de meeste herbiciden.
De tijd en de ruimte die nodig is om deze protocollen uit te voeren kan een beperkende factor zijn en mogelijk niet geschikt voor routine testen. Echter, de kosten te beperken, maar een herbicide dosis worden gebruikt. Op deze manier informatie nog kan worden verkregen over de vraag of tHij populatie resistent. Een mogelijke beperking van de aanpak hangt samen met het feit dat geen resistente controles in de experimenten. In feite, vanwege het grote aantal biotypen geëvalueerd (bv verschillende species en herbiciden betrokken), veel controles worden opgenomen in elk experiment dus doen stijgen.
De voordelen ten opzichte van alternatieve technieken / protocols in gehele planten bioassays met één herbicide dosis 15 zijn aan de hogere betrouwbaarheid en kan worden afgeleid van de weerstand. Snellere en minder dure diagnostische screening werden eveneens ontwikkeld, in vivo of in vitro (bijv petrischaal bioassays 8 spectrofotometrische test op herbicide doelenzym 29). Echter, bieden ze alleen kwalitatieve informatie en vereisen een aantal voorbereidende werkzaamheden, soms moeizaam, voor het herbicide dosis identificeren discrimineren tussen resistant en gevoelige planten. De in vitro assays moeten ook worden aangepast aan het actieve bestanddeel gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paper bags | Celcar SAS | ||
| Plastic dishes | ISI plast S.p.A. | SO600 | Transparent plastic |
| Sulfuric acid 95-98% | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Non-woven fabric | Carretta Tessitura | Art.TNT17 | Weight 17 g m-2 |
| Chloroform >99.5% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Potassium nitrate >99.0% | Sigma-Aldrich | P8394 | |
| Plastic containers | Giganplast | 1875/M | 600 x 400 x 110 mm |
| Plastic trays | Piber plast | G1210A | 325 x 265 x 95 mm |
| Polystyrene trays | Plastisavio | S24 | 537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4) |
| Copper sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Agriperlite | Blu Agroingross sas | AGRI100 | |
| Peat | Blu Agroingross sas | TORBA250 | |
| Germination cabinet | KW | W87R | |
| Nozzles | Teejet | XR11002-VK, TP11001-VH | The second type of nozzles are used only for glyphosate |
| Barcode generator | Toshiba TEC | SX4 | |
| Labels with barcode | Felga | TT20200 | Stick-in labels with rounded corners |
| Barcode reader | Cipherlab | 8300-L | Portable data terminal |
| Bench sprayer | Built in house | ||
| Herbicides included in the results: | |||
| Commercial product | Active ingredient | Company | Comments |
| Altorex | imazamox | BASF | |
| Azimut | florasulam | Dow AgroSciences | |
| Biopower | Bayer Crop Science | Surfact to be used with Hussar WG | |
| Dash | BASF | Surfact to be used with Altorex | |
| Granstar | tribenuron-methyl | Dupont | |
| Gulliver | azimsulfuron | Dupont | |
| Hussar WG | iodosulfuron | Bayer Crop Science | |
| Nominee | bispyribac-Na | Bayer Crop Science | |
| Roundup | glyphosate | Monsanto | |
| Trend | Dupont | Surfact to be used with Granstar and Gulliver | |
| Viper | penoxsulam | Dow AgroSciences | |
| Weedone LV4 | 2,4-D | Isagro | |
References
- Massa, D., Kaiser, Y. I., Andújar-Sánchez, D., Carmona-Alférez, R., Mehrtens, J., Gerhards, R. Development of a geo-referenced database for weed mapping and analysis of agronomic factors affecting herbicide resistance in Apera spica-venti L. Beauv. (Silky Windgrass). Agronomy. 3 (1), 13-27 (2013).
- Powles, S. B., Shaner, D. L. Herbicides Resistance and World Grains. , CRC Press LLC. Raton, FL. 308 (2001).
- Sattin, M. Herbicide resistance in Europe: an overview. Proc. BCPC International Congress. , Crop Science & Technology. UK. 131-138 (2005).
- Heap, I. M. International Survey of Herbicide Resistant Weeds. , Available from: http://www.weedscience.org (2015).
- Jasieniuk, M., Le Corre, V. Deciphering the evolution of herbicide resistance in weeds. Trends Genet. 29 (11), 649-658 (2013).
- Heap, I. M. Identification and documentation of herbicide resistance. Phytoprotection. 75 (4), 85-90 (1994).
- Beckie, H. J., Heap, I. M., Smeda, R. J., Hall, L. M. Screening for herbicide resistance in weeds. Weed Technol. 14 (2), 428-445 (2000).
- Tal, A., Kotoula-Syka, E., Rubin, B. Seed-bioassay to detect grass weeds resistant to acetyl coenzyme A carboxylase inhibiting herbicides. Crop Prot. 19, 467-472 (2000).
- Boutsalis, P. Syngenta Quick-Test: a rapid whole-plant test for herbicide resistance. Weed Technol. 15 (2), 257-263 (2001).
- Menchari, Y., et al. Weed response to herbicides: regional-scale distribution of herbicide resistance alleles in the grass weed Alopecurus myosuroides. New Phytol. 171 (4), 861-874 (2006).
- Burgos, N. R., et al. Review: confirmation of resistance to herbicides and evaluation of resistance levels. Weed Sci. 61 (1), 4-20 (2013).
- Owen, M. J., Martinez, N. J., Powles, S. B. Multiple herbicide-resistant Lolium rigidum. (annual ryegrass) now dominates across the Western Australian grain belt. Weed Res. 54 (3), 314-324 (2014).
- Herbicide Resistance Action Committee. Classification of herbicides according to site of action. , Available from: http://www.hracglobal.com/Education/ClassificationofHerbicideSiteofAction.aspx (2015).
- Beckie, H. J., Tardif, F. J.
- Moss, S. R., et al. The occurrence of herbicide-resistant grass-weeds in the United Kingdom and a new system for designating resistance in screening assays. Proc. BCPC Weeds. , Brighton. 179-184 (1999).
- Baskin, C. C., Baskin, J. M. Seeds, Ecology, Biogeography and Evolution of dormancy and Germination. , Academic Press. San Diego, USA. 27-42 (1998).
- Sattin, M., Gasparetto, M. A., Campagna, C. Situation and management of Avena sterilis. ssp. ludoviciana. and Phalaris paradoxa. resistant to ACCase inhibitors in Italy. Proc. BCPC - Weeds. , Brighton, UK. 755-762 (2001).
- Scarabel, L., Varotto, S., Sattin, M. A European biotype of Amaranthus retroflexus. cross-resistant to ALS inhibitors and response to alternative herbicides. Weed Res. 47 (6), 527-533 (2007).
- Collavo, A., Panozzo, S., Lucchesi, G., Scarabel, L., Sattin, M. Characterisation and management of Phalaris paradoxa. resistant to ACCase-inhibitors. Crop Prot. 30 (3), 293-299 (2011).
- Scarabel, L., Carraro, N., Sattin, M., Varotto, S. Molecular basis and genetic characterisation of evolved resistance to ALS-inhibitors in Papaver rhoeas. Plant Sci. 166 (3), 703-709 (2004).
- Panozzo, S., Scarabel, L., Tranel, P. J., Sattin, M. Target-site resistance to ALS inhibitors in the polyploid species Echinochloa crus-galli. Pestic. Biochem. Phys. 105 (2), 93-101 (2013).
- Sattin, M., Berto, D., Zanin, G., Tabacchi, M. Resistance to ALS inhibitors in rice in north-western Italy. Proc. BCPC. Weeds. , Brighton. 783-790 (1999).
- Scarabel, L., Berto, D., Sattin, M. Dormancy breaking and germination of Alisma plantago-aquatica. and Scirpus mucronatus. Aspects of Applied Biology. 69, Wellesbourne, UK. 285-292 (2003).
- Collavo, A., Strek, H., Beffa, R., Sattin, M. Management of an ACCase-inhibitor-resistant Lolium rigidum. population based on the use of ALS inhibitors: weed population evolution observed over a 7 years field-scale investigation. Pest Manag. Sci. 69 (2), 200-208 (2013).
- Scarabel, L., Panozzo, S., Savoia, W., Sattin, M. Target-site ACCase-resistant Johnsongrass (Sorghum halepense). selected in summer dicot crops. Weed Technol. 28 (2), 307-315 (2014).
- Hess, M., Barralis, H., Bleiholder, H., Buhur, L., Eggers, T., Hack, H., Strauss, R. Use of the extended BBCH scale - general for the description of the growth stages of mono- and dicotyledonous weed species. Weed Res. 37 (6), 433-441 (1997).
- Collavo, A., Sattin, M. First glyphosate-resistant Lolium. spp. biotypes found in a European annual arable cropping system also affected by ACCase and ALS resistance. Weed Res. 54 (4), 325-334 (2014).
- Scarabel, L., Cenghialta, C., Manuello, D., Sattin, M. Monitoring and management of imidazolinone-resistant red rice (Oryza sativa. L., var. sylvatica.) in Clearfield® Italian paddy rice. Agronomy. 2 (4), 371-383 (2012).
- Zelaya, I. A., Anderson, J. A. H., Owen, M. D. K., Landes, R. D. Evaluation of spectrophotometric and HPLC methods for shikimic acid determination in plants: Models in glyphosate-resistant and-susceptible crops. J. Agric. Food Chem. 59 (6), 2202-2212 (2011).
