Använda aktivitetsbaserade Anorexia Gnagare modell för att studera den neurobiologiska Grund för anorexia nervosa

Abstract

Anorexia nervosa (AN) är en psykiatrisk sjukdom som kännetecknas av alltför begränsat kaloriintag och onormalt höga nivåer av fysisk aktivitet. En utmanande sjukdom att behandla, på grund av bristande förståelse för den underliggande neurobiologi, AN har den högsta dödligheten bland psykiska sjukdomar. För att tillgodose detta behov, neuroforskare använder en djurmodell för att studera hur neurala kretsar kan bidra mot sårbarhet för AN och kan påverkas av ammoniumnitrat. Aktivitetsbaserad anorexi (ABA) är ett biologiskt beteende fenomen som beskrivs i gnagare som modeller nyckel symptom på anorexia nervosa. När gnagare med fri tillgång till frivillig träning på ett löphjul begränsning erfarenhet mat, blir de hyperaktiva - kör mer än djur med fri tillgång till mat. Här beskriver vi de rutiner som ABA induceras i unga kvinnliga C57BL / 6-möss. På postnatal dag 36 (P36), djuret inrymt med tillgång till frivillig träning på ett löpandehjul. Efter 4 dagars acklimatisering till löphjul, på P40, är ​​all mat ur buren. För de kommande 3 dagar, mat tillbaka till buren (tillåter djur gratis mat access) under 2 h dagligen. Efter den fjärde dagen av mat begränsning, är fri tillgång till mat tillbaka och löphjul tas bort från buren för att tillåta djuren att återhämta sig. Kontinuerlig flera dagar analys av löphjul aktivitet visar att möss blir hyperaktiva inom 24 timmar efter starten av mat begränsning. Mössen kör även under den begränsade tid under vilken de har tillgång till mat. Dessutom dygnsrytm mönster hjul kör blir störd av erfarenheterna av mat begränsning. Vi har kunnat korrelera neurobiologiska förändringar med olika aspekter av djurens hjul kör beteende implicerade vissa hjärnregioner och neurokemiska förändringar med motståndskraft och sårbarhet för mat-begränsning inducerad hyperaktivitet.

Introduction

Anorexia nervosa (AN) är en psykiatrisk sjukdom som kännetecknas av överdriven begränsning av födointag, över motion och irrationella rädsla för gå upp i vikt. En av de mest dödliga psykiska sjukdomar ^1, har AN någon accepterad farmakologisk behandling hittills, och de neurobiologiska mekanismer och effekterna av sjukdomen är dåligt förstådd. Vi studerar en djurmodell av ammoniumnitrat för att utforska de neurobiologiska och neurokemiska förändringar i samband med hallmark symptom på sjukdomen.

Aktivitetsbaserad anorexi (ABA) är ett biologiskt beteende fenomen som beskrivs i gnagare som modeller några av de egenskaper hos AN ^2,3. När gnagare med fri tillgång till frivillig träning på en löphjul upplevelse livsmedels begränsning, många, men inte alla, bli hyperaktiva - kör mer än de sprang före uppkomsten av livsmedels begränsning ^3,4. Det har funnits många förslag på förklaringar till över motion uppvisas avABA djur och AN patienter: att det är en form av födosöksbeteende ^5, en mekanism för att hantera stress av mat-begränsning ^6, ett försök att höja kroppstemperaturen under svält-inducerad droppe i metabolism ^7, eller ett resultat av hypoleptinemia ⁸ . Denna gnagarmodell återger AN symptom kroppsvikt förlust, hyperaktivitet, frivillig begränsning mat genom att välja att köra under begränsad mattillgång, korrelationer med ångest drag ^9,10 och sårbarhet påverkas av tidiga livserfarenhet ^11. Medan gnagarmodell ABA anses vara en stressmodell, detta kanske inte korrekt återspeglar AN i humana patienter som uppvisar ökad immunförsvar ^12. Bland både gnagare och humanpatienter, vissa individer visa mer sårbarhet än andra. Samtidigt som epidemiologiska studier strävar efter att belysa riskfaktorer för AN, har relativt få studier försökt förstå den neurobiologiska basen för individuella skillnader i vulnerabbilitet till ABA induktion hos gnagare.

Det är viktigt att notera att ABA paradigmet används allmänt, och dess användning som en djurmodell av ammoniumnitrat har genomgått omfattande omdömet ^6,13-15. Bidraget från denna pågående arbetet är att beskriva de specifika metoder som används för att framkalla ABA hos ungdomar honmöss och redogöra för de ändringar som var nödvändiga för att göra de befintliga gnagarmodeller för att förbättra överlevnaden hos unga möss. Dessutom diskuterar vi olika tekniker som kan kopplas med ABA beteende paradigmet för att studera andra aspekter av djurmodell.

Musen ABA modellen kan utforskning strikt i neurobiologi av sjukdomen AN. Detta kan skiljas från de sociokulturella influenser, som utan tvekan bidrar mot en persons sårbarhet. ABA-modellen kan också användas för att undersöka effekten av återkommande restriktions livsmedel eller andra former av stress i kombination med hjul åtkomst, så somatt fånga vissa aspekter av ammoniumnitrat återfall ^16. Inhibitoriska neurotransmittorn systemets funktion i hjärnans ångest centra har studerats med hjälp av elektronmikroskopiska tekniker ^4,16,17. Dendritiska arborization har studerats med användning Neurolucida assisterade spårning och analys av pyramidala celler i CA1 fältet av hippocampus ^18,19 och amygdala ^17.   Effekter av mat begränsning och tillgång hjulet vid ångest har studerats med hjälp av beteendetester som den förhöjda plus labyrint ^10. Den genetiska grunden för sårbarhet har studerats med hjälp av olika inavlade stammar av möss ^9. Farmakologiska manipulationer kan testas i en djurmodell före mänskliga prov ^20-24. Genetiskt modifierade djur och övergående knockdown av gener kan användas för att studera hur manipulation av särskilda molekylära vägar kan påverka beteendet i ABA paradigm. Effekterna av stress under tidiga liv vid differentiell sårbarhet för ABA wOuld vara ett annat ämne som kan behandlas genom denna metod.

Protocol

Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll är förenliga med Institutional Animal Care och användning kommittén i New York University (Animal Welfare Assurance # A3317-01).
OBS: Detta protokoll har optimerats för ungdomar C57BL / 6-möss. Djuren inhystes i en anläggning som håller RT vid 72 ° ± 2 ° och rummets luftfuktighet på 50% ± 10%. Rums lampor slås på 7:00 till 19:00 dagligen.

1. Beredning av Burar med löphjul

1. Ställ in datorn och USB-gränssnitt Hub i ett säkert område av djuret anläggningen rummet, bort från rinnande vatten och gångtrafik, men nära nog till buren rack för att ligga inom den trådlösa räckvidden för sändarna. Se till att datorn och USB-gränssnitt Hub båda får ström från ett vägguttag och USB-gränssnittet Hub ansluts till datorn via en USB-kabel. Använd en reservström anordning för att driva både datorn och USB-hubb.
2. Anslut datorn to USB-gränssnittet Hub med USB-kabeln som medföljer löphjul utrustning.
3. Starta datorn och starta löphjul programvara genom att dubbelklicka på ikonen.
4. Installera tre AAA-batterier i botten av vart och ett av de löpande hjulen och kontrollera att hjul Manager har erkänt sändaren. Lista varje hjul i programfönstret under rubriken "Wheel sensorer."
5. Ställ in konfigurationen av datainsamling i enlighet med de särskilda specifikationer av experimentet.
6. Förbered en bur för varje mus ämne med sängkläder, nestlets, fri tillgång till vatten och löphjul. Typiskt 8 möss används per experiment för neuroanatomi studier. Fler möss kan krävas för beteendestudier för att säkerställa tillräcklig statistisk styrka.
7. Kontrollera att löphjul kan röra sig fritt utan att röra vid någon av burväggarna, matkorg eller buröverdelen. Snurra varje hjul några gånger och kontrollera att tHan programvara uppdaterar hjul räknas för varje hjul.

2. Acklimatisering Fas

1. Placera varje mus ämne (C57BL / 6 mus, ålder P36) individuellt i en bur med en löphjul.
2. Lägg en i förväg vägd mängd torrfoder (ca 100 g) till livsmedelsbehållare, och placera en förvägd full behållare (ca 50 g) av våtfoder i buren.
3. I programfönstret börjar hjulet aktivitets datainsamling och datalagring genom att välja "Start Acquisition" i Arkiv-menyn. Välj den katalog som uppgifterna ska sparas. Mjukvaran kommer att registrera varv hos hjulet kontinuerligt tills experimentet stoppas manuellt.
4. Väg djuret, våt mat, och torrfoder varje dag vid den tidpunkt då lamporna är avstängda i rummet. Fyll torrfoder om vikten understiger 50 g, och ersätta den våta matbehållaren om maten torkar ut eller blir nedsmutsade med strö. Registrera whee manuelltl räkna varje dag vid denna tid också, i händelse av förlust av digitala data.

3. Början Food begränsning

1. Ta bort alla våt och torrfoder från buren vid middagstid (eller 7 timmar innan rummet ljus är planerade att stänga) den första dagen av mat begränsning.
2. Samma dag, vid början av den mörka cykeln, registrera vikten av djuret och räknevärdet hjulet. Placera en förvägd mängd torrfoder (approximativt 50 g) i livsmedelstratten och en i förväg vägd mängd av våt mat (ca 5 g) i buren i en vägningsskål.
3. Bered en färsk bur med strö och nestlets för varje djur.
4. Efter 2 timmar, överföra löphjul till beredda färska buren. Denna bur förändring säkerställer att djuret förblir mat begränsad till nästa matdags, om vissa livsmedel smulor har fallit eller blivit hamstrade i sängkläder. För att minska påfrestningen av buren ändra, lägga fylla sina händer (cirka 500 ml) av den nedsmutsadesängkläder från den gamla bur, och flytta djuret in i den nya buren.
5. Notera vikten av den återstående våta och torra livsmedel för att bestämma den mängd mat som åts. Spela räkna hjul vid slutet av mattillgång perioden.

4. Övervakning djurhälsa under mat begränsning

1. Varje dag, vid början av den mörka cykeln, registrera vikten av djuret och räknevärdet hjulet. Placera en förvägd mängd torr och våt mat till buren.
2. Om ett djurs kroppsvikt understiger 75% av sin ursprungliga kroppsvikt före mat begränsning, ta bort dem från experimentet.
   OBS: Andra indikationer på överdriven svält inkluderar en krökt kroppshållning och oförmåga att flytta runt i buren. Djuret kan vara kallt vid beröring och misslyckas med att äta under två timmar av mattillgång.
3. Bered en färsk bur med strö och nestlets för varje djur.
4. Efter 2 timmar, överföra löphjul till beredda färska buren. Lägg two nävar (cirka 500 ml) av nedsmutsade sängkläder från den gamla bur och flytta djuret i den nya buren.
5. Notera vikten av den återstående våta och torra livsmedel för att bestämma den mängd mat som åts. Spela räkna hjul vid slutet av mattillgång perioden.

5. Avsluta Experiment

1. Efter tre dagar av mat begränsning, avslutar ABA experimentet. Avliva djuret för uppsamling av hjärnvävnad, eller att djuren att återhämta sig innan de genomgick ytterligare beteendetestning.
2. Klicka på "End Acquisition" alternativet under Arkiv-menyn i programfönstret.
3. Ta bort de löpande hjulen burarna, och ta ut batterierna ur hjulbasen.
4. Om tillåta djuren att återhämta sig, åter en i förväg vägd mängd torrfoder till livsmedelstratten och låt djur ad libitum tillgång till föda under återhämtning.

6. Dataanalys

1. Spara enll hjul data för experiment i en .wls filen i katalogen väljs vid början av experimentet.
2. Exportera data till ett kalkylblad genom att välja "Export" i Arkiv-menyn. Välj önskade .wls filerna i "källdatafilen" alternativet. Välj start- och slutdatum och tid, och väljer varje hjulsensor för export i listan hjulsensorer.

Representative Results

För att studera effekten av ABA på liknande befolkningen att humant anorexia nervösa, har dessa experiment utförts hos kvinnliga adolescent möss. Således börjar hjul acklimatisering strax efter början av puberteten hos möss, dag P36. Acklimatiseringen Fasen leds från P36-P40, och begränsning livsmedel sker från P40-P43.

Tonårs möss fortsätter att växa, och deras kroppsvikt fortsätter att öka när de närmar hela vuxenlivet. Under hjul acklimatisering, mössen förlorar i allmänhet en liten mängd vikt eller platå i vikt. Efter inledningen av mat begränsning, kroppsvikt ABA djur kraftigt minskar (Figur 1). Kroppsvikten hos djur i ABA-gruppen kan jämföras med kontroll (CON) djur som inte har tillgång till en löphjul och inte upplever begränsning mat.

Hjulet aktiviteten för varje djur kan analyseras på olika sätt: (1) Det dagliga (24-tim) hjulaktiviteten hos ABA djuren kan ritas som visar att djuren löpa alltför efter starten av mat begränsning (Figur 2). (2) Varje djur hjul aktivitet kan undersökas vid en finare skala med hjälp av analysmjukvara, visar dygnsrytm mönster hjul aktivitet (Figur 3). (3) Hjulaktivitet under 2 h av mattillgång indikerar frivillig mat begränsning, eftersom djuren väljer att köra i stället för äta. (4) Efter mat begränsning börjar vissa djur visar en ökning i aktivitet i tid strax före tidpunkten för utfodring. Denna dagliga ökning av rörelseaktiviteten före presentation av livsmedel kallas "mat gripande aktivitet" (Figur 4). (5) Den hastighet med vilken djuren kör kan jämföras, eftersom både avstånd och uppehållstiden på hjulet övervakas kontinuerligt. Förändring av dessa parametrar kan avspegla inlärningsfas drivas med hjulet.

16. I samma studie var det också visat att GABAergic innervation av hippocampus CA1 pyramidala celler ökade i de djur som visade minskad hyperaktivitet hos en andra erfarenhet av ABA. I en studie med ABA råttor konstaterades att uttrycket av GABA-receptorer innehåller α4 subenheten korrelerar med minskad hyperaktivitet, eller förmåga att stå emot ABA ^25.

Figur 1. kroppsvikt förändringar under kroppsvikt uppgifter ABA. Visas från en kohort av fem unga honmöss. Mössen hade löphjul åtkomst för hela 7 dagarna av experimentet. De första fyra dagarna var acklimatisering fasen, varefter mat begränsning infördes i ytterligare tre dagar. Dag 0 indikerar början av mat begränsning. Felstaplar visar standardfelet av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Daglig hjul aktivitet före och efter uppkomsten av mat begränsning. Daily (24 timmar) hjul aktivitet visas för en mus. Dag 0 indikerar början av mat begränsning. Totalt daglig hjul aktivitet ökar med nästan två gånger efteruppkomsten av mat begränsning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. övervakas kontinuerligt löphjul aktiviteten under åtta dagars experiment. En skärmbild visas från Analysis Wheel programvaran. Detta visar hjul aktivitet (hjul räknar på den vertikala axeln) av en enda mus under åtta dagar (tid på den horisontella axeln) att få tillgång till ett löphjul. Nedanför aktivitet tomten är ett överlägg anger de tider då lamporna är på och av i rummet. Innan restriktions mat börjar visar djuret minimal aktivitet under den ljusa cykeln. Den första vertikala streckade linjen indikerar uppkomsten av mat begränsning, de tre följande linjerna anger 2 tim utfodring börja varje dag, och röda pilarna indikerar the uppkomsten av livsmedel föregripande aktivitet under den lätta fasen. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Hjul aktivitet ökar inom alla timmar på dagen, men de flesta dramatiskt under perioden före mat tillgång. Hjul kör visas för fyra 6 tim sektorer av dagen. Bars märkta "Innan FR" indikerar det genomsnittliga antalet hjul räknas under de två sista dagarna av acklimatisering fasen. Barer märkta "Under FR" indikerar de två första dagarna av mat begränsning phase. "Recovery" anger nivåerna av aktivitet efter djur fick återhämta sig utan ett löphjul i minst 6 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

De kritiska aspekterna av ABA modellen är (1) fri tillgång till frivillig träning på ett löphjul och (2) begränsning mat med mattillgång begränsad till en begränsad tidsperiod. Tillgång till en löphjul tillåter djuret att välja att använda hjulet och ger en indikation på effekten av mat begränsning på motivationen av djuret att utöva. Omvänt kan tidsbegränsad mat tillgång (snarare än kalori-restriktion) försöksledaren att mäta frivilliga mat begränsning genom att övervaka i vilken utsträckning djuren väljer att köra under begränsade tider av mattillgång. På detta sätt är ABA en utmärkt modell av den självsvält som sker i AN.

För att minimera brus i data mus beteende, är det viktigt att minimera mängden oförutsägbara stress som djuren erfarenhet. Till exempel bör hantering av djur hållas till ett minimum, med djuren endast störs vid vägningen, en gångdag. Försöks hanterar djuren bör utbildas och bekväma med hantering av djuren. Om möjligt bör en person som hanterar djuren under hela experimentet för att undvika ytterligare stress. Dofter och parfymer bör undvikas. Tiden för vägning och matleverans bör göras för att vara så regelbundet som möjligt, för att minimera eventuella oförutsägbarhet. Som en försiktighetsåtgärd mot dataförlust, är det bäst att driva datorn via en funktion för reservkraft i händelse av ett strömavbrott; även ett kort strömavbrott kommer få datorn att starta och datainsamling kommer att upphöra. Dessutom är det viktigt att övervaka batteriets livslängd hjul sändare dagligen. Om batterinivån blir svag, kan sändaren intermittent inte skicka data till hubben, vilket underskattar aktiviteten hos djuret.

Musen Protokollet som beskrivs här modifierades från standardprotokollet som har använts för råttor ^4. Adolescent honmössär mycket mer sårbara för överdriven viktminskning och död på grund av svält. Därför gjordes följande ändringar gjorts i syfte att öka överlevnaden för minst tre dagar av ABA. Först framställdes den första dagen av mat begränsning förkortas genom att avlägsna mat vid middagstid snarare än vid 8:00 av den föregående dagen. Vidare var tidsperioden för mattillgång ökat från 1 timme till 2 timmar och tillgången på våt mat tillsattes också för att minimera effekterna av uttorkning. Vi fann att administrera våtfoder till mössen förbättrats avsevärt deras tillstånd genom tre dagars mat begränsning. Utan våtfoder var kroppsvikt faller mycket snabbare och djur måste avlägsnas från maten begränsad miljö. Dessa förändringar var tillräckliga för att göra det möjligt för mössen att överleva genom tre hela dagar av mat begränsning och lätt återhämta sig från ABA.

Detta protokoll för ABA har några viktiga begränsningar att tänka på. För det första är det nödvändigt att inrymma mössen individuellt iburar med en löphjul för att övervaka hjul aktiviteten hos varje mus för sig. Detta resulterar i social isolering av djuren, en känd stressfaktor som kan påverka beteendet hos djuren under ABA liksom några av de nervbanor som studeras ^26. Hittills finns det ingen utrustning tillgänglig som kan övervaka en separat verksamhet i co-inrymt möss, men det verkar vara ett lösbart problem med hjälp av RFID-teknik och spårning taggar bundna till varje djur. En annan potentiellt oundviklig konsekvens av co-bostäder djur under restriktions mat är risken att djuren kan bli aggressiva mot sin bur-kompisar. Ändra djurens bur efter varje utfodring session är en annan stressfaktor att vi var tvungna att införa på grund av ett djur hamstring mat under sängkläder. Vi strävar efter att minimera påfrestningen av en ny bur genom att införa en avsevärd mängd av nedsmutsade sängkläder från föregående buren i friska buren.

13,27 ljus-på. Detta kan vara för enkelhetens skull av försöksledaren, och det är viktigt att notera att tidsperioden för matpengar under den ljusa fasen bör ökas för att förbättra överlevnaden. Det har också föreslagit att blockera tillgången till löphjul under utfodring kan förbättra överlevnaden, men vi anser att det tar bort mycket intressant aspekt av beteende som är beslut som fattas av vissa djur att köra i stället äta, vilket ytterligare förvärrar självsvält aspekt av ABA-modellen, men fånga ett kännetecken förmänskligt beteende i samband med ammoniumnitrat.

Det är viktigt att notera att detta protokoll har optimerats speciellt för ungdomar kvinnliga C57BL / 6-möss. Om en annan mus stammar, kön eller åldersgrupp ska användas, kan vissa parametrar i protokollet behöver ändras. Det har också visats att RT ger svårare ABA hos gnagare ^28. Även om vi inte försöker att variera RT för våra studier, vilket ökar RT kommer sannolikt att förbättra överlevnaden bland ABA djur.

Fördelen med att använda en djurmodell av en human sjukdom, såsom ammoniumnitrat, är det är möjligt att studera hjärnan anatomi och fysiologi och förändringar som induceras av tillgång till frivilliga motion och mat begränsning i en kontrollerad miljö. Användningen av möss i ABA-modellen tillåter användning av kraftfulla genetiska metoder som använder transgena djur och virusinfektion för genmanipulation. Framtida studier syftar till att studera effekten av vissa gener i motståndskrafteller sårbarhet för begränsning av närings-inducerad hyperaktivitet och självsvält.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wireless running wheel for mouse	Med Associates	ENV-044
USB Interface Hub	Med Associates	DIG-804
Wheel Manager Software	Med Associates	SOF-860
Wheel Manager Data Analysis	Med Associates	SOF-861
Diet Gel 76A	Clear H2O	72-07-5022
Mouse Diet 5001	PMI