In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
Durante muchos años, la investigación sobre enfermedades neurodegenerativas como el accidente cerebrovascular isquémico o lesión cerebral traumática se ha centrado en el desarrollo de terapias neuroprotectoras que tienen como objetivo promover la supervivencia neuronal en la fase de accidente cerebrovascular agudo. La gran mayoría de las terapias de drogas que se han encontrado para ser eficaz en modelos de roedores fallidas cuando se traduce a la clínica. Las razones para este fracaso terapéutico incluyen, pero no se limitan a la falta de efectos sostenida de fármaco que resulta en la persistencia de la recuperación neurológica funcional. Por tanto, es importante desarrollar estrategias que promueven la remodelación del cerebro en el largo plazo. Debido a que la promoción de la supervivencia neuronal por sí sola no es suficiente para permitir la recuperación de accidente cerebrovascular con éxito, según lo sugerido por el gran número de ensayos de neuroprotección fallidos, la estimulación de la plasticidad neuronal ha obtenido recientemente un gran interés en el campo.
Medios para la administración de fármacos son la inyección intraperitoneal, cola i intravascularnjection, inyección femoral, inyección estereotáctica simple de los vectores en el cerebro y continuado de suministro constante mediante bombas miniosmóticas. Este último puede incluir la administración sistémica, si la bomba no tiene una cánula, o que se puede-dirigió órgano, como hemos demostrado para la entrega en el cerebro. Con la excepción de las bombas miniosmóticas y el uso de vectores virales, todas las otras estrategias inducirán concentraciones de fármaco fluctuantes. Para los experimentos a largo plazo que se convierte así en necesario someter al animal a la tensión de recibir inyecciones frecuentes. La BBB impone un impedimento importante para la captación cerebral de las proteínas o fármacos de la sangre, resultando en la necesidad de proteínas o de drogas enormes dosis con el fin de conseguir concentraciones terapéuticas en el cerebro. Por ejemplo Pellegrini et al. (2013) 5 rhEpo entregado por inyección intraperitoneal a una dosis equivalente a 75 UI / día para un animal de 30 g (750 UI / día para un 300 g de rata). En comparación, la entrega de RHEP dirigidao al cerebro nos permitió utilizar una dosis mucho más baja de sólo el 10 UI / día en nuestro estudio para la recuperación del accidente cerebrovascular con éxito, lo que nos permitió lograr la recuperación en una gran escala de tiempo a una tasa fija de 0,25 l / h.
En este trabajo hemos demostrado el método de implantación de minibombas con una cánula conectada al cráneo con el fin de entregar la proteína de la plasticidad de promoción rhEpo directamente en el ventrículo, eludiendo así el BBB. Mediante este método, rhEpo promueve la recuperación neurológica en un número de maneras, incluyendo la reducción del tamaño del infarto, reducción de la formación de la cicatriz glial y la inducción de la angiogénesis. rhEpo también promovió la supervivencia neuronal y el aumento de las proyecciones de la corteza motora contralesional hacia el núcleo rojo denervado y núcleos faciales. El surgimiento de las fibras fue revelado por inyección del trazador anterógrado del tracto BDA en el cortex motor (Figuras 4A y 5A). Un correlato funcional para el surgimiento de las fibras es provided por la mejora de las habilidades motoras (Figura 5B). Además, hemos demostrado que el mismo enfoque para la inyección del trazador tracto se puede aplicar para dar a conocer las conexiones tálamo-cortical por inyección del trazador FG retrógrada del tracto (Figura 6B).
En la preparación de la bomba miniosmótica, es fundamental tener en cuenta el punto de destino y el uso de espaciadores. Utilizamos un espaciador para reducir la longitud de la aguja de 0,5 mm como de esta manera la punta de la aguja está en contacto con el ventrículo en las coordenadas dadas (-0,2 mm caudal, 0,9 mm lateral, 2.5 mm dorso ventral, con respecto a bregma). Sin embargo, si las estructuras más profundas son el objetivo de la investigación, entonces no se necesitarán espaciadores. Del mismo modo, si se desea un punto de entrega más externa (es decir., La corteza), será necesario entonces más discos espaciadores. El catéter debe ser lo suficientemente largo para que la bomba no está demasiado cerca de la cabeza, ya que impedirá movimientos del mouse, sino también la longitud excesiva no demasiado largo ya que una vez implantado puede hacer que el catéter se doble, lo que aumenta el riesgo de eliminación de la cánula por el movimiento natural del ratón. Una sección de 2 cm de catéter da muy buenos resultados en términos de movilidad y estabilidad del implante (Figuras 1 y 2). La incubación de la bomba a 37 ° CO / N permite que la bomba para iniciar de inmediato el bombeo de la droga en el cerebro en el momento de la implantación.
En la implantación de la bomba miniosmótica es crítico para asegurar que el cráneo se seca adecuadamente antes de la implantación de la cánula. Por lo general, la limpieza con 70% de etanol inducirá el hueso para secar, pero si se encuentra sangrado continuo, tocando el cráneo suavemente con un cauterizador se seque completamente. Es crítico para asegurar que la introducción de la aguja es tan vertical y lenta como sea posible. Una vez en posición, y mientras el pegamento se está secando, colocando el dedo en la parte superior de la cánula impide que se mueva hacia los lados over el cráneo. Especial cuidado se debe dar a la herida y la colocación de la cánula. Es importante que la incisión no se realiza exactamente sobre la línea media del cráneo, pero ligeramente hacia el lado derecho. Al cerrar la herida, si la incisión fue hecha en la línea media, la piel estará sobrecargado, lo que aumenta el riesgo de la apertura de la herida. Hacer la incisión ligeramente hacia un lado permitirá que los puntos de sutura para estar lejos de la parte más alta de la cánula. Como consecuencia habrá menos tensión en los puntos de sutura y la herida se cure adecuadamente. Los animales deben ser enjaulados solo y comprobar todos los días, especialmente durante los primeros 10-15 días después de la implantación. En caso de dehiscencia de la herida, heridas tienen que cerrarse tan pronto como sea posible. Si la cánula es retirado o el animal presenta una infección, el experimento tiene que ser terminada. No se recomienda la reimplantación de la cánula. Es muy importante para la implantación exitosa de usar cantidades adecuadas de tejido adadhesivo (no demasiado!) ya que se degrada el hueso y aumenta el riesgo de eliminación de cánula. Sin embargo, utilizando muy poco adhesivo también no sostendrá la cánula unida al hueso. Las bombas miniosmóticas pueden transportar medicamentos disueltos en una amplia variedad de sustancias, siendo la única limitación a esto que el disolvente es biocompatible. Además, dado que el volumen es pequeño (200 l), uno debe determinar si la concentración requerida para el experimento es adecuado y no provocar la precipitación dentro de la bomba.
Tracto rastreo, ya sea con anterógrada o retrógrada trazadores es una técnica muy bien establecida para estudiar la conectividad cerebral y la plasticidad. Se debe tener en cuenta los marcos de uso estereotáxica al inyectar para asegurar la precisión en la orientación de la zona del cerebro que se desea estudiar (es decir, para evitar la inyección en el cuerpo calloso cuando se inyecta la corteza).
Para todas las intervenciones quirúrgicas y con el fin de reducir el dolor yinflamación, los animales deben ser tratados con 0,1 mg / kg de buprenorfina antes de la intervención y Caprofen a 4 mg / kg una vez al día durante tres días después de la intervención.
En conclusión, este enfoque proporciona una herramienta adecuada para el estudio de efecto de las proteínas o compuestos farmacológicos en el cerebro lesionado, lo que representa un método que es muy adecuado para estudios sobre la plasticidad del cerebro.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |