Abstract
호중구 순환 모든 인간 백혈구의 가장 풍부한는 침입 미생물에 대한 숙주 방어에 중요한 역할을한다. 또한, 호중구는 종양 세포의 면역 감시에서 중심적 역할을한다. 이들은 어느 과산화수소 또는 항체 - 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 통해 관련된 세포 의존성 접촉 메커니즘을 통해 종양 세포의 사멸을 종양 세포를 인식하고 유도 할 수있는 능력을 가지고있다. 항암 활성을 갖는 호중구 암 환자의 종양 - 함유 마우스의 말초 혈액으로부터 분리 할 수있다. 이러한 호중구는 현저한 종양 세포 상해 활성을 보여 정상인 또는 나이브 마우스의 호중구 구별하는 종양 혼입 호중구 (TEN)를 지칭한다. 다른 백혈구에 비해 호중구 밀도 구배 실시 때 실현> 98 % 순수 호중구 집단을 얻을 수있다 다른 부력을 나타낸다. 그러나, 또한통상 고밀도 호중구 인구 (HDN)에, 암 환자에서 종양 - 함유 마우스에서뿐만 아니라 만성 염증성 조건 하에서 구별 저밀도 호중구 인구 (LDN)는 순환 나타난다. LDN는 단핵구 분획 공동 정제 및 양성 또는 음성 선별 전략을 사용하여 단핵 세포로부터 분리 될 수있다. 절연 호중구 순도 유동 세포 계측법에 의해 결정되면, 이들은 시험 관내 및 생체 기능 분석에 사용될 수있다. 우리는 호중구의 항 종양 활성을 모니터링하는 능력 마이그레이션 및 반응성 산소 종을 생성 할뿐만 아니라 생체 탐식 능력을 모니터링하는 방법을 설명한다. 우리는 또한 생체 내 추적 호중구 레이블을 기술을 설명하고 생체 내에서 자신의 안티 전이성 용량을 확인할 수 있습니다. 이러한 모든 기술은 획득 및 항 종양 호중구를 특성화하는 방법을 이해하는데 필수적기능.
Introduction
호중구는 처음에 침입하는 미생물에 대한 첫 번째 줄에 방어 역할을 타고난 면역 세포 특징했다. 오늘은, 호중구가 더 많은 기능을 광범위한 것으로 알려져있다가, 외국 항원 1, 2에 적응 면역 반응을 장착 조혈 3, 4 혈관 신생을 조절하는 5 상처 치유에 관여된다. 또한, 호중구는 프로 및 항 종양 활동 -6,7-의 덕에 의해 종양의 성장 및 전이성 진행에 영향을 미칠 수있다. 호중구는 다형성 분할 핵을 특징으로한다 (따라서 다형 (PMN) 백혈구라고합니다) 적어도 세 과립의 별개의 서브 클래스뿐만 아니라 분비 소포 8 (그림 1A-C)를 포함한다.
호중구는 식균 높은 용량 및 미생물 제거를위한 임계 높은 NADPH 옥시 다제 활성을 갖는 한에 중요한 케모카인의 다양한 분비추가 호중구 염증 8,9의 사이트에 다른 면역 세포의 견인. 호중구는 수신자와 같은 수용체 (TLR들)을 포함한 표면 수용체의 대량 발현을 특징으로, C 형 렉틴 수용기 (CLRS)는, 수용체 3 (하여 CD11b / CD18)과 다른 부착 분자 (예를 들어, L 셀렉틴을 보완 LFA-1, VLA-4 및 carcinoembryonic 항원 관련 세포 부착 분자 (3) (CEACAM3 / CD66b)), 케모카인 수용체 (예, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), 화학 유인 물질 수용체 (예, PAFR, LTB 4 R 및 C5aR) 사이토 카인 수용체 (예, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR)은 수용체 (예 FPR1-3) 펩타이드를 포르 밀, 및의 Fc 수용체 (예를 들어, CD16 (FcγRIII 인간의 호중구는 CD11b를, CD15, CD16와 CD66b 백혈구 마커를 사용하여 식별되는 반면), CD32 (FcγRII) 및 CD64 (FcγRI) 10. 마우스에서 호중구는 일반적으로는 CD11b + Ly6G +로 식별됩니다. 또한 일반적으로 조직에서 호중구의 검출을위한 과립 단백질 된 myeloperoxidase (MPO) 및 호중구 엘라 스타 제 (NE)에 대한 얼룩 허용됩니다.
그것은 호중구의 다양한 기능이 동일하거나 별개의 셀에 의해 세포의 서브 모집단에 의해 매개되는지 아직 불분명하다. 축적 된 데이터는 염증성 자극과 미세 환경의 영향 11,12 가소성의 높은 정도를 나타내는 이종의 인구 호중구의 존재를 시사한다. Fridlender 등. (13)는 크게 프로 종양 특성을 가진 항 종양 특성 및 N2로 N1 불리는 두 개의 주요 하위 집단으로 암의 호중구를 분할했다. 암뿐만 아니라 만성 염증, T 세포 반응을 억제 과립 14 골수 유래 세포 억제제 (G-MDSCs)로 구성된 부가적인 서브 집단이있다. G-MDSCs이는 CD11b + Ly6C 특징으로 미성숙 골수 세포로 간주됩니다쥐 15 낮은 Ly6G 안녕하세요 표현형, 인간의 16 CD15 + / CD16 낮은 표현형을하면서. G-MDSCs 정상 순환 호중구보다 사이토 카인과 케모카인의 동안 낮은 수준을 아르 기나과 마이 엘 로퍼 옥시 다제의 높은 수준을 표현한다. 그들은 이하 식세포 및 이동성을하지만 ROS 15,17,18 높은 수준의 생산. 본 논문에서는 항 종양 특성을 가진 호중구의 분리 및 특성에 대한 몇 가지 기본적인 방법을 설명합니다.
호중구는 인간의 순환에서 모든 백혈구의 가장 큰 인구를 구성하는 동안 (45~70%; 1,800 - 6,000 / μL) -; 300-500 / μL 15 %, 생쥐에서 정상 조건 하에서, 그들은 10 (오히려 드문 드문 ). 염증에 따라 때때로 만성 염증 (7)의 상태를 나타내는 암에 지속적으로 호중구 수가 증가한다. 호중구는 다 능성 일반적인 골수 전구체 (CMP) CE에서 개발골수성의 단계 (메가 바이트), promyelocytes (오후), myelocytes (MC), metamyelocytes (MM) 및 밴드 세포 (BC)를 통과하는 분화 과정을 통해 골수의 재편, 8. 그들은 순환 (8)에 공개되기 전에 7 일 - 성숙, 후 유사 분열 호중구는 4 골수 내에 남아있을 수 있습니다. 염증 상태에 따라 연장 될 수있다 12 시간 - 혈중 호중구 매출 6의 평균 반감기 일반적으로 빠르다. 비자극 호중구는 포르 볼 에스테르 포르 볼 (12)에 노출시킴으로써 항 - 종양 활성, 케모카인 IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 및 CXCL5 6,19 또는 인위적으로 나이브 호중구를 노출시킴으로써 얻어 질 수있는 기능을 제한적 -myristate 13 아세테이트 (PMA) 6.
호중구의 낮은 번호와 함께 혈액 호중구의 짧은 반감기 (~ 3-5 10 5 ×) 순진한 (6) 1 ml의 혈액에서 달성 - 8 주 이전 마우스, 그것을 만든어려운 시험 관내에서 마우스 호중구 순환의 기능을 탐구한다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 다른 소스가 이용되고있다. 예를 들면, 호중구의 다수는 (티오 글리콜 레이트 브로 쓰 또는 자이 모산의 복강 내 주사 한 후, 예) 골수 20 무균 염증 유도 다음 복막로부터 획득 될 수있다. 이는 복강 호중구로부터 얻어지는 모든 항 종양 활성 (미공개 관찰)을 발휘하는 것은 아니다.
. 40,000,000 혈액 호중구 용이 1 mL의 혈액으로부터 분리 할 수있다 - Granot 외 6은 BALB / c 마우스 (20)가되도록 종양 진행 (6) (도 2A)으로 악화 호중구를 개발 마우스 4T1 유방 암종 세포주 동소 접종 관찰 3-4주 후 종양 접종. 이러한 호중구 항암 활동을 획득하고 이에 따라 COI왔다순서 네드 종양 동반 된 호중구 (TEN)는 순진한 호중구 (6) (그림 2B)와 구별한다. 고밀도 호중구 (HDN,도 1a)가 높은 항 종양이지만, 암의 문맥에서 생성 저밀도 호중구 (LDN,도 1b) (21)는 그렇지 않다. 또한, 종양 - 함유 마우스의 골수 및 비장으로부터 고밀도 호중구는 항 종양 활성 (미공개 데이터)를 갖는다. 그것은 호중구의 양의 증가와 함께, 종양 진행과 비장 서서히 확대 (비장)을가되도록 유의해야한다.
그것은 10도 자연 (MMTV-PyMT 및 MMTV-Wnt1 유방 종양과 K-RAS 중심의 폐 종양) 모두를 포함하는 암의 다른 모델에서 생성 및 AT-3 (MMTV-PyMT)과 E0771의 유방암 (주입 주목해야한다 세포, LLC 루이스 폐 암종 세포 및 B16-F10 흑색 종 세포). 이 다치거나에서 호중구 동원하지만, 범위삼주 후 1 ml의 혈액에서 10 × 10 6 호중구 - 또는 모델 5에 도달, 4T1-접종 생쥐보다 훨씬 적습니다.
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Protocol
동물 5-7 주령 BALB / c 마우스는 할란 (이스라엘)에서 구입. 동물과 관련된 모든 실험은 히브리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 인간의 샘플 : 암 환자와 건강한 자원자에서 혈액의 컬렉션을하다 사 병원 임상 시험 심사위원회 (IRB) 승인을 받았다.
유방암 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 항암 특성을 가진 호중구 1. 유도.
주 : 모든 단계 층류 (LAF) 바이오 안전 캐비넷 멸균 용액을 사용하여 수행되어야한다.
- 10 둘 베코 변성 이글 배지 ㎖ (DMEM), 10 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 4.5 g / L D- 글루코스를 함유하는, 2 mM의 D-에서 100mm 조직 배양 플레이트에 시드 5 × 5 4T1 세포 글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 100 U / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 설페이트. 일을 품어3-4일 대해 5 % CO 2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 E 세포. 실험의 날에 100 % 합류 - 세포가 50 있는지 확인합니다.
- 조직 배양 플레이트에서 종양 세포를 분리하기 위해, 5 ㎖ PBS로 세포를 세척 배지 대기음 PBS를 흡인 및 2.5 g / L 트립신 용액 3 ㎖를 추가한다. 37 ºC에서 트립신과 3 분 - 셀 2를 품어.
- 모든 세포가 분리 될 때까지 상하 피펫 트립신 중화 10 ㎖ 혈청 함유 배지를 추가한다. 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
- RT에서 5 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. 상기 세포 펠렛을 200 ㎕의 매질 떠나는 매체 기음. 잔류 용적에 재현 탁하고 세포를 PBS 10 ㎖를 추가한다. 균일 한 세포 현탁액을 얻을 혈구의 세포를 계산하는 10 μl를 꺼내 3 회 - 튜브 2 전환. 라이브와 죽은 세포를 구분하는 트리 판 블루를 사용합니다. RT 200 XG에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. PBS를 대기음 2 × 106 세포 / ml의 최종 농도로 PBS에 세포를 재현 탁. 단일 세포 현탁액이 더 응집이 없음을 확인합니다.
- 주사 1 × 6 4T1 세포 또는 루시 페라 제 발현 동소 30G의 X 8mm의 바늘 0.3 ML의 주사기를 사용하여 여성 BALB / c 마우스의 왼쪽 사타구니 유방 지방 패드에 50 μl의 PBS에서 4T1 세포를.
- 100 % 산소 - (5 % 3) 주입 전에 이소 플루 란의 느린 유속을 수신 유도 챔버에서 쥐를 마취.
- 멸균 수술 패드에 마우스를 놓고 머리가 제대로 이소 플루 란 코 콘 내부에 배치되어 있는지 확인합니다. 발을 곤란하게하여 적절한 마취를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. 주사 부위 주위의 머리를 면도하고 70 % EtOH로 소독.
- 작은 수평 절개를하는 수술 도구 살균 세트를 사용 (5mm) 약사타구니와 복부 젖꼭지 사이를 펼쳐줍니다 절반 방법, 지방 패드를 노출 50 μL에 1 × 10 6 4T1 세포를 주입. 일주일 후 제거해야 9mm 클립과 절개를 닫습니다. 루시 페라 제 발현 세포의 주입은 생물 발광 영상으로 종양의 크기와 전이의 모니터링을 할 수 있습니다.
참고 :이 최소 침습 절차는 사후 수술 적 치료를 필요로하지 않으며, 주입 된 쥐 (2) 내에 복구 - 3 분. - 그들은 의식을 되 찾을 때까지 마우스를 모니터링하고 다른 생쥐의 회사에 입사하기 전에 완전한 의식을 회복해야합니다.
- 3 후 - 4 주, 원발 종양이 2cm 3의 부피에 도달 할 때, 느린 CO 2 스트림에 의해 생쥐 희생 즉시 마지막 숨 후, 25G X 5/8 "니들을 사용하여 심장 천자에 의해 혈액을 수득 헤파린으로 전처리 1 ML의 투베르쿨린 주사기에 연결. 삽입시 상향 바늘의 입 유지초과 압력 (도 3)를 피 채혈 천천히 서서히 심장을 향해 진동판을 통해 수평 주사기, 및.
2. 호중구 격리
- 종양 베어링 마우스의 혈액에서 세포 독성 호중구의 분리.
- 담암 마우스에서 도출 1 mL의 혈액을 희석 PBS 6 ml의 최종 부피로 소 혈청 알부민 (BSA) (/ V W) 0.5 %를 함유하는 (프로토콜 1.11 참조).
- 갓 준비 불연속 자당 기울기에 희석 된 혈액 분획 :
- 15 ML 원뿔 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브의 바닥에 멸균 여과 자당 1.119 ㎍ / ㎖의 3 ML을 추가합니다.
- 천천히, 조심스럽게 1.119 ㎍ / ㎖ 층의 상단에 멸균 여과 자당 1.077 ㎍ / ㎖의 레이어 3 ㎖. 그 후, 1.077 ㎍ / ㎖ 층 (그림 4A)의 상부에 천천히 조심스럽게 희석 된 혈액 (프로토콜 2.1.1)의 6 ml를 추가합니다. 그것은 기울어 진 튜브를 유지하는 것이 좋습니다된다튜브의 하부 벽쪽으로 피펫의 입 유지 천천히, 그러나 연속적인 흐름으로 다른 성분을 설정된 뒤, 어떠한 난류가 형성되지 않도록.
- 브레이크없이 RT에서 30 분 동안 700 XG에 자당 구배에 희석 된 혈액을 함유하는 튜브를 원심 분리기.
- 조심스럽게 모든 난류를 발생시키지 않고 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. 적혈구의 대부분은 관의 바닥에있을 것이다. 저밀도 백혈구에서 발견되는 동안 고밀도 호중구 (HDN)는 1.119 g / ㎖의 (3 ㎖ 마크 전후) 1.077 g / ㎖의 층들 사이의 계면에서의 흰색 대 적색 링으로 발견 1.077g / ml의 층과 BSA 함유 PBS의 계면 화이트 링 (6 ml의 마크 주위에,도 4b 참조).
- 저밀도 세포층 위에 5mm 도달 할 때까지 PBS + 0.5 % BSA를 대기음. 서서히 세포 주위에 소용돌이를 통해 1 mL의 팁에 흡인 느린 저밀도 세포를 피펫.0.5 % BSA와 PBS의 30 ㎖로 세포를 전송합니다.
- 고밀도 셀 밴드 위 5mm 도달 할 때까지 동일한 구배 튜브 상층 대기음. 주로 고밀도 호중구이다 고밀도 세포 밖으로 피펫 및 0.5 % BSA를 함유하는 PBS 30 ㎖ 중에 세포를 옮긴다.
- RT에서 10 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리기.
- 30 초 동안 36 mL의 멸균 된 HPLC 등급의 물에 재현 탁하여 세포 상등액 및 적혈구가 용해 대기음. 등장 성이 5 배 9 ml에 첨가하여 복원해야 PBS 2.5 % (w / v)의 BSA로 보충 농축시켰다.
- RT에서 10 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리기.
- 뜨는을 대기음, 그리고 PBS-BSA의 세포를 재현 탁. 혈구에서 호중구의 수를 계산 라이브와 죽은 세포를 구분하는 트리 판 블루를 사용합니다.
- RT에서 10 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리기 및 최종 세포 밀도로 원하는 배양 배지에서 재현 탁 호중구. 용도바로 호중구.
- 그리고, 다른 원심 분리 후, 최종 세포 밀도로 배양 배지에 재현 탁 호중구. 즉시 호중구를 사용합니다.
- 암 환자로부터 호중구 순환의 분리.
- 염수 3 % 덱스 트란 T500의 동량 헤파린 (20 U / ㎖) 인간 혈액 10 ㎖를 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 이 부화하는 동안 적혈구 침강한다.
- 자당 10 ㎖ 1.077 g / ㎖로 50 ml의 원추형 폴리 프로필렌 튜브를 준비하고 천천히 1.077 g / ㎖의 크로스 레이어 (도 4C)의 상부에 백혈구 풍부한 뜨는 층을 포함한다.
- 브레이크없이 실온에서 30 분 동안 400 XG에 원심 분리기. 고밀도 호중구 (HDN)의 펠렛에 나타납니다. 저밀도 호중구 (LDN) 1.077 g / mL의 슈 크로즈 및 플라즈마 층 (도 4d) 사이의 계면에서 단구 및 림프구와 함께 동시 - 정제.
- 10 ml의 0에서 호중구을 재현 탁.30 초 동안 2 %의 NaCl이 오염 적혈구를 용해시키기, 및 1.6 %의 NaCl 10 ㎖를 첨가하여 등장 성을 복원하고 한번 반전한다.
- 원심 5 RT 160 분 XG에, 20 ml의 행크 평형 염 용액에 세 번 세척 하였다. 각 세척 후 원심 분리기와 뜨는을 대기음.
- 호중구를 계산하고 ml의 또는 필요에 따라 2 × 10 6 호중구 /에서 2 % FBS가 첨가 된 RPMI-1640의 세포를 재현 탁.
자석 구슬을 사용하여 혈액 호중구 3. 심화
- 긍정적 인 선택
- 헤파린 처리 된 주사기, 프로토콜 1.8에 기재된 바와 같이, 마우스로부터 혈액 1 mL를 취하여.
- 실온에서 5 분 동안 400 XG에 15 ML 원뿔 튜브에 혈액을 원심 분리기.
- 뜨는을 대기음 또는 추가 연구를 위해 혈장을 유지합니다.
- 를 Lyse 8 ml의 HPLC 등급 물에 세포를 재현 탁하여 적혈구는. 30 초 후, 5 배 conce 2 ㎖를 첨가하여 등장 성 복원ntrated PBS는 2.5 % BSA를 함유. 세포를 계산합니다.
- 실온에서 5 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
- 0.5 % BSA 및 10 8 세포 당 2 MM의 EDTA를 함유하는 200 ㎕의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 바이오틴 안티 Ly6G 항체의 50 μl를 추가합니다. 잘 믹스 (안 얼음) 냉장고에 10 분 동안 품어.
- 차가운 PBS가 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA를 포함하는 150 μl를 추가합니다.
- 소용돌이 안티 - 비오틴 코팅 된 자기 마이크로 비드 주식 솔루션. 세포 현탁액 100 μl를 전송합니다. 잘 믹스 (안 얼음) 냉장고에 15 분 동안 품어.
- 10 ml의 PBS가 RT에서 10 분 동안 400 XG에 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA, 및 원심 분리기를 포함하는 추가하여 셀을 씻는다.
- 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA를 포함하는 500 μL 차가운 PBS에서 대기음 완전히 뜨는 및 재현 탁.
- 자기 스탠드에 부착 된 자석 홀더에 자기 분리 컬럼을 삽입하고 500 μL 차가운 PBS는 0을 포함 그것을 씻어.5 % BSA, 2 mM의 EDTA.
- 칼럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 흐름을 통해이 레이블이없는 LyG6 음성 세포가 포함되어 있습니다.
- 500 μL PBS는 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA를 포함하여 열을 씻으십시오. 추가 레이블이없는 세포를 통해 흐름에있을 것입니다.
- 다른 500 μL PBS는 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA를 포함와 세척 단계를 반복합니다.
- 자석에서 열을 제거하고 15 ml의 포집 관에 놓습니다. PBS는 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA를 포함하는 1 mL를 넣어 단단히 열에 플런저를 밀어 자기 표지 세포를 세척하십시오. 흐름을 통해 Ly6G +의 호중구가 포함되어 있습니다.
- 음의 선택
- 단계 3.1.5에 3.1.1에 따라 혈액의 백혈구를 준비합니다.
- 재현 탁 폴리스티렌 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브에 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA를 함유하는 1 ml의 PBS에 1 × 108 세포.
- 50 μL 정상 쥐의 혈청을 추가합니다.
- 호중구 농축 C의 50 μl를 추가ocktail는 (비 호중구 백혈구 특정 비오틴 화 항체를 포함), 잘 혼합하고 냉장고에서 15 분 동안 배양한다.
- (4)를 추가 ml의 PBS를 10 분 동안 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA, 원심 분리기 400 XG를 포함하여 세포를 씻으십시오.
- 뜨는을 취소하고 1 ml의 PBS가 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA를 함유하는 세포를 재현 탁.
- 비오틴과 덱스 트란에 대항 테트라 항체 복합체의 50 μl를 추가합니다. 잘 섞어 냉장고에 10 분 동안 품어.
- 세포 현탁액 150 μl를 첨가하기 전에 덱스 트란 - 코팅 된 자성 비드를 포함하는 잘 와동 튜브. 잘 섞어 냉장고에 10 분을 품어.
- PBS는 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA를 함유하는 2.5 mL를 첨가하여 총 부피로 세포 현탁액을 준비한다. 균일 한 세포 현탁액을 얻기 위해 부드럽게 섞는다.
- 자석으로 (캡 제외) 튜브를 삽입하고 3 분간 방치 할 수 있습니다.
- 연속 한 튜브와 자석 전환모션 유체 언 바운드 세포 새로운 튜브로 이송되도록한다. 2 반전 자석과 튜브 남겨 - 3 초 후 수직 위치로 돌아갑니다. 언 바운드 호중구가 전송 된 유체에있을 것입니다 동안 자기 표지 원치 않는 세포는 원래 튜브의 벽에 결합 유지됩니다.
호중구 4. 세포 학적 염색법
- 50 ㎕의 PBS에 1 × 5 호중구를 재현 탁 및 Cytospin로 박층 셀 제조 어댑터에 세포 현탁액을 전송. 5 분 동안 150 XG에 어댑터를 원심 분리기. 어댑터에서 미리 라벨링 된 유리 슬라이드 별개.
- 2 분 동안 70 % 에탄올에서 유리 슬라이드를 침지하여 세포를 고정. 어댑터 (단계 4.1 참조)에서 준비를 염색하기 전에 실온에서 건조하도록 허용합니다. 증류수에 6 회 - 슬라이드 5를 찍어.
- 메이어의 헤 마톡 실린 용액 2 분 1 - 얼룩. 수돗물에 1 분을 씻어. 에오신 Y 용액에 10 초 얼룩 . 수돗물에 씻으십시오. 에탄올 농도 증가에 슬라이드 (70 %, 96 % 및 100 %)로 세척 탈수. 곧 유리 슬라이드 공기 건조를하자 가벼운 현미경 슬라이드를 검사합니다.
참고 : 에오신 분홍색이며 비특이적 단백질 얼룩 반면 헤 마톡 실린은, 깊고 푸른 보라색 색상과 얼룩 핵산을 가지고있다. 호중구 세포질 과립 '중립로 사랑'이름의 기원 산성 또는 염기성 염료에 의해 염색 상태로 유지됩니다. 헤 마톡 실린 및 에오신과 eosinophilc와 호 염기성 과립구 얼룩 진한 파란색 빨간색 밝은 과립구 반면, 호중구 중립 핑크 (그림 1A 참조)가 나타납니다. 5 로브 '분할 호중구'(그림 1A와 1C) - 성숙 호중구 2 큰 일반적이다 다형 핵을 특징으로한다. 호중구는 미성숙 한 잎 모양 곡선 또는 환상 핵 (도 1b)을 특징으로한다.
- FACS 완충액 100 ㎕ (PBS, 0.5 %의 BSA, 2 mM의 EDTA 및 0.02 % NaN3가 함유)에 1 × 106 세포를 재현 탁. 염색하는 (3.1.5에 3.1.1 단계)하기 전에 전체 혈액 샘플의 경우, 용혈이 필요합니다. 5 분 동안의 FcR 차단 시약의 10 μl를 추가합니다.
- 인간 호중구에 대한 마우스 호중구 또는 CD11b를하고 CD66b에 LY-6G에 특이 형광 표지 항체의 0.5 μg의 추가 잘 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어.
- PBS는 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA를 포함하여 500 μL에 볼륨을 조정하고 유동 세포 계측법에 의해 염색을 분석 할 수 있습니다.
생체 내에서 6. 팔로우 호중구 게이트
- 호중구의 생체 BrdU의 라벨에서
- 종양 - 함유 마우스에 복강 멸균 PBS에 10 ㎎ / ㎖ 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 용액 100 ㎕를 주입한다.
- 혈액 호중구 48 시간 후 분사를 분리프로토콜 2.1 ccording. 얼룩 BrdU의 흐름 키트를 사용하여 호중구를 BrdU의은 - 표지.
- 호중구의 CFSE 라벨
- 미리 예열 PBS 1 ㎖에 10 7 호중구를 재현 탁.
- 10 μM의 최종 농도로 현탁 호중구에 5mM의 CFSE 스톡 용액 2 μl를 추가. 잘 혼합하고 37 ℃에서 15 분 동안 품어. 1ml의 DMSO 5mm의 CFSE 2.8 mg의 CFSE (카르복시 디 아세테이트, 숙신 에스테르 - -) -5- (및 6)에 용해시켜 제조된다. -20 ℃에서 어둠 속에서 200 ㎕의 멸균 튜브와 저장소에 10 μl의 분취 량으로 나눈다.
- 10 % FBS를 함유하는 RPMI-1640의 동량을 첨가하여 과량의 CFSE 중화. 37 ℃에서 10 분 동안 품어. 실온에서 10 분 동안 400 XG에서 호중구를 원심 분리기. 10 % FBS를 포함하는 RPMI-1640 10ml에 두 번 호중구을 씻으십시오.
- PBS의 적절한 볼륨에서 10 분, 재현 탁 400 XG에 원심 분리기. 호중구 (예를 들면, 1 × 10 7
7. 시험 관내 루시 페라 제 분석은 고립 된 호중구의 항 종양 활동을 모니터링 할 수 있습니다.
- 프로토콜 1.1-1.5 4T1 세포에 대해 기재된 바와 같이 루시페라아제 표지 된 종양 세포를 배양하지만, 2 % FBS가 보충 된 최적화 환원 혈청 배지에서 트립신 해리 된 세포를 재현 탁. ml의 당 5 × 10 4 세포에 세포 밀도를 조정합니다.
- 100 μL 종자 5000 루시페라아제 표지 된 종양 세포는 흰색 96 편평 바닥 조직 배양 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 % FBS가 포함 된 혈청 감소 배지를 최적화.
- 4 시간 종양 세포를 시딩 한 후, 0.5 % FBS를 함유하는 감소 된 혈청 배지 최적화 50 μL에 1 × 105 호중구를 추가 / N을 O 배양한다. 2 × 106 세포 / ml의 밀도로 호중구 세포 현탁액을 준비한다. 제어 우물은 호중구없이 50 μL 매체를 얻어야한다. 수행각각의 실험 설정의 여러 반복.
- 다음 아침에 부드럽게 뜨는을 대기음 200 μL PBS로 각 잘 씻는다. PBS를 대기음 및 수동 용해 버퍼의 50 μl를 추가합니다. (이러한 AT-3 세포 등)을 쉽게 분리 세포, PBS로 세척하지 않고 성장 배지를 흡입 직후 세포 배양 용해 완충액을 추가한다.
- 알루미늄 호일로 커버 플레이트 및 RT에서 20 분 동안 150 rpm에서 진탕 배양 그것을.
- 발광 플레이트 리더에서 접시를 놓습니다. 잘 현명한 50 μL 루시 페라 제 분석 솔루션을 주입, 잘 당 10 초 동안 화학 발광을 참조하십시오.
- 하기 식 %의 종양 용해를 계산 % 종양 용해 = (1- [호중구와 샘플의 발광이] / [매질의 샘플은 발광]) × 100 %.
참고 : 프로토콜 8.1에 설명 된대로 전이성 시드에 호중구의 기여를 평가하기 위해, 호중구가 고갈 될 수 있습니다. 효과적인 depl 들어etion 7 일 후 종양의 생착에 시작 호중구 파괴 항체를 관리 할 수 있습니다.
유방암 마우스 모델에서 호중구의 8 항 전이성 활동.
- 호중구의 생체 고갈합니다.
- 갓 마우스 당 100 μL의 최종 부피로 식염수 쥐 안티 Ly6G 항체 12.5 μg의 (호중구 고갈 항체) 또는 쥐 이소 타입 대조군 항체로 (의 IgG 2A, Κ)을 준비한다.
- 3 일 후 종양의 생착에 시작하면 매일 12.5 μg의 쥐 방지 Ly6G 항체 (100 μL)의 복강 내 투여 량을 주입. 제어와 마우스 또는 12.5 μg의 (100 μL) 쥐 이소 제어 항체 (IgG에의 2A, Κ)를 주입한다.
- 4T1 종양이 성장하면 호중구 생산 속도가 대폭 증가로 14 일에 시작하여, 하루에 두 번 항체를 관리 할 수 있습니다.
- 측면 꼬리 정맥을 새김으로 - (3 방울 2) 매일, 혈액 샘플을 얻을 수 있습니다. 안티에 피를 수집-coagulant 포함하는 튜브 (헤파린, 구연산염 또는 EDTA).
- 프로토콜 5에 기술 된 바와 같이 유동 세포 계측법 사용 호중구 고갈을 확인합니다.
- 종양 중화 시험 (윈 분석을 수정)
- 종양 베어링 마우스에서 호중구를 분리합니다. 1 × 6 종양 세포와 3 × 10 6 호중구 (마우스 당) 50 μL 식염수에 혼합.
- 8 주 오래 된 순진한 BALB / c 마우스 - 피하 (6)의 측면에 세포를 주입한다. 종양 크기의 정확한 측정을 허용하는 종양 생착 전에 측면 면도. 5 일 후 생착에 종양의 크기 매일 시작을 측정합니다.
- 호중구 입양 전송
- 꼬리 정맥에 200 ㎕의 PBS에 2 × 104 루시 페라 제를 발현하는 종양 세포를 주입한다.
- 호중구 전달은 종양 세포 주입 다음 4 시간 수행한다. 따라서, 약 2 시간에 그들의 계획 전에 담암 마우스 (프로토콜 2.1)에서 HDN의 정화를 시작생체 내 전달. 2.5 × 10 7 세포 / ㎖의 최종 농도로 PBS에 재현 탁 호중구.
- 종양 세포를 도입 한 후에 4 시간 5 분 동안 가열 램프하에 마우스 놓는다. 제한 수단에 마우스를 놓고 꼬리 정맥을 통해 5 × 10 6 HDN (200 μL)를 주입. 대조군 마우스는 비히클 (PBS)으로 주입된다.
- 생체 내 이미징 시스템에 의해 또는 면역 생물 발광을 이용하여 다양한 시점에서의 폐 전이의 형성을 모니터한다.
- 폐 전이 시드 분석
- 프로토콜 1과 동소 좌측 서혜부 유방 지방 패드에 1 × 106 부모 4T1 세포 - 0.5을 주입한다.
- 10 일째에 5 × 105 세포 / ㎖의 최종 농도로 PBS에 GFP 발현하는 4T1 세포를 재현 탁. 5 분 동안 가열 램프 아래에 마우스를 놓습니다.
- 제한 수단에 마우스를 놓고 4T에 정맥 1 × 5 GFP 발현 4T1 세포 (200 μL)를 주입한 종양 - 함유 마우스 또는 나이브 마우스.
- 다음 날, 쥐를 안락사와 남아있는 적혈구를 제거하기 위해 20 ml의 PBS로 폐 관류.
- 면역 조직 화학 염색에 의한 GFP 양성 세포의 분석을 위해 폐를 절제.
참고 : 프로토콜 8.1에 설명 된대로 전이성 시드에 호중구의 기여를 평가하기 위해, 호중구가 고갈 될 수 있습니다. 효과적인 고갈은 7 일 후 종양의 생착에 시작 호중구 파괴 항체를 관리 할 수 있습니다.
종양 베어링 마우스에서 호중구에 의한 T 세포의 증식 9. 억제.
- 10 ml의 PBS에 안락사 순진한 BALB / C 마우스와 장소에서 비장을 제거합니다.
- RPMI-1640 가득 배양 접시에 적합 40 μm의 셀 스트레이너에 비장를 놓습니다. 세포가 배양 접시에 여과기를 통해 주사기의 플런저의 단부를 사용하여 비장을 매시. 5 ML의 RPMI와 셀 스트레이너를 씻어. 스트레이너를 폐기하십시오.
- 10 분 동안 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 400 XG에 재현 탁 세포를 전송합니다.
- 상층 액을 제거하고, 20 초 동안 순수 36 ㎖의에 세포를 현탁하여 적혈구를 용해시키기 및 첨가하여 등장 성으로 조절 4 ㎖의 PBS은 X (10)는 대안 적으로, 적혈구 5 ㎖로 세포를 현탁하여 적혈구를 용해시키기 농축 버퍼 (ACK)를 용균하고, 실온에서 5 분 품어. RPMI-1640 배지 10 ㎖를 첨가하여 중화 ACK. 실온에서 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기. 5 ml의 PBS에서 세포를 재현 탁하고 세포를 카운트.
- 15 ㎖의 튜브에 4 × 107 세포 / ml의 2의 최종 농도로 PBS에 비장 세포를 재현 탁. PBS에서 2.5 μM의 CFSE 용액 2 ㎖를 추가합니다. 신속 튜브를 반전하고 빛으로부터 보호 가끔 혼합 37 ° C (매 2 분)에서 10 분 동안 품어.
- 미리 예열 FBS (100 %) 4 mL를 첨가하여 과량의 CFSE 켄 칭하고, RT에서 1 분 동안 배양한다. (10) 400 XG에 PBS와 원심 분리기 3 ㎖ 추가분.
- 10 분 동안 400 XG에 30 ml의 PBS로 세포 및 원심 분리기를 씻으십시오.
- 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터와 PBS로 다시 씻는다.
- 2 × 107 세포 / ㎖의 최종 농도로 10 % FBS가 보충 된 RPMI-1640 배지에서 세포를 재현 탁.
- 시드 2 × 10 6 / 웰 (200 μL) 24 잘 조직 문화 판에.
- 10 % FBS 500 μl의 RPMI-1640로 정제 아르메니아어 햄스터 항 마우스 CD3ε 항체 1 μg의 첨가에 의해 세포를 자극한다.
- CFSE 표지 비장 세포를 10 % FBS 300 μl의 RPMI-1640 2 × 10 6 HDN 또는 LDN을 추가하고, 37 ℃에서 3 일간 배양한다. 호중구없이 웰스 300 μL 매체를 얻어야한다. 각 웰의 총 부피는 1 ml를해야한다.
- 세포를 수집하고 유동 세포 계측법 위해 준비. 100 μL FACS 버퍼 (프로토콜 5)에서 세포를 재현 탁,하고의 FcR 차단 시약의 10 μl를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 인큐베이션.
- 추가 1# 956; APC - 공액 안티 CD8α 항체 L 및 RT에서 15 분 동안 배양한다.
- 유동 세포 계측법 (그림 5)에 의해 CD8 + T 세포의 CFSE 형광 강도를 결정합니다. CFSE의 강도는 각각의 세포 분열에 반감된다. 따라서, 세포 분열의 수는 CFSE 염색의 강도에 의해 결정될 수있다.
10. 호중구 마이그레이션 분석
- 감소 된 혈청 배지 25cm 2 조직 배양 플라스크에 0.5 % FBS로 보충하고, 37 ℃에서 24 시간 배양을 최적화 7 mL의 종자 5 × 5 4T1 세포.
- 5 ㎛의 공극 크기와 이동 플레이트의 하부 챔버로의 상등액 800 μL를 옮긴다.
- 재현 탁 0.5 % FBS가 보충 된 최적화 환원 혈청 배지 400 ㎕를 2 × 105 호중구. 위쪽 챔버에 세포 현탁액을 적용하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한다.
- 인큐베이션의 끝에, 상부 챔버를 제거하고하단 챔버로 마이그레이션 한 호중구의 수를 계산합니다.
활성 산소 종의 11 모니터링 호중구 생산 (ROS).
- 페놀 레드없이 행크의 균형 염 용액에 1.1 × 10 6 호중구 / ㎖를 준비합니다. 접시 백색 96 웰 편평 바닥 플레이트의 각 웰에 2 × 105 호중구를 함유하는 180 μL.
- 발광 플레이트 리더에서 접시를 놓습니다. 50 μM의 최종 농도를 얻기 위해 각 웰에 PBS에서 500 μM의 루미놀 용액 20 μL를 추가한다. 10 초 간격으로 5 분의 시간 과정에서 1 초에 대한 기초 화학 발광을 읽어보십시오.
- (10 μM의 농도로 10 nm의 100 nm의 또는 fMLP의 농도로 예를 들어, PMA) 자극제를 추가합니다. 페놀 레드없이 행크의 균형 염 용액에서 각 에이전트의 10 배 농축 된 용액을 준비하고 각각의 웰에 22 μl를 추가합니다. 제어하려면 우물 22 μL 차량을 추가 할 수 있습니다.
- Measu플레이트 리더의 화학 발광 재. 짧은 (5 분마다 10 초)과 오랜 시간 코스 (1 시간마다 분) 모두를 수행합니다.
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Representative Results
최근의 연구에서 우리는 호중구 6 항 전이 기능을 확인 하였다. 종양 베어링 마우스에서 호중구는 세포 독성 표현형을 획득하고 종양 세포 (6)를 죽일 수있는 능력을 가지고있다. 이는 현저한 항 종양 효과가없는 6 나이브 마우스의 호중구는 대조적이다. 프로토콜 절에 설명 된 여러 기술은 시험 관내 및 생체 내 6 항 종양 호중구 기능 연구를 위해 사용되어왔다.
종양 세포 독성은 호중구 종양 - 함유 마우스 (6)로부터 획득 될 수있다. 이 목적을 달성하기 위하여, 생쥐는 동소 좌측 서혜부 유방 지방 패드로 4T1 세포 (1 프로토콜)로 주입 하였다. 2 CM 3 (도 3 - - 종양 좌하 복부 분명) 21 일 후 종양 접종하여 1 차 종양의 크기에 도달 하였다. 이때, 마우스를 안락사시키고, 1 mL의 혈액 (마우스 당) 그려진심장 천자 (그림 3)에 의해. 이와 병행하여, 나이브 비 담암 마우스로부터 혈액을 그려졌다. HDN 후 호중구의 고순도 (> 98 %)을 수득 인구 밀도 구배에 (2.1 프로토콜 및도 4)로 정제 하였다. 호중구 생존력은 트립 판 블루 염색법 (프로토콜 2.1)에 의해 결정 하였다. 호중구이어서 2 × 106 호중구 / ㎖에서 0.5 % FBS를 포함하는 최적화 된 혈청 감소 배지에 재현 탁 하였다.
호중구 세포 독성의 정도를 테스트하기 위해, 우리는 96 평면 바닥 흰색 4T1 표적 세포를 (5,000 세포 / 웰 100 μL)에 표현 루시 페라하기 (2 × 10 6 호중구 / ㎖ 원액에서 50 μL) (10) (5) 호중구 추가 - 글쎄 플레이트 (프로토콜 7). O / N 항온 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고, 수동적 세포 용해 완충액에 용해하고, 각 샘플에서의 루시퍼 라제 활성은 호중구의 세포 독성 정도 (평가하기 위해 시험 하였다
LDN 및 HDN에 면역 억제 특성을 시험하기 위해, 우리는 (프로토콜 9) T 세포 증식 분석을 사용 하였다. 우리는 평가LDN의 존재 또는 HDN의 존재 (도 5A-D)에서 배양 하였다 CD8 + 배양 혼자 미처리 비장 세포와 αCD3 항체로 처리 된 비장 세포와 세포의 수. 항 CD3 자극 다음 CD8 + CFSE + 세포의 극적인 증가를 참고 억제의 극적인 억제 효과 (오른쪽 상단의 패널와 B를 비교) LDN (B와 C의 오른쪽 패널을 비교) 및 HDN의 억제 효과의 부족 (패널 D). 우리는 또한 핵 확산에 대한 표시로서, CFSE 보유의 정도를 평가 하였다. 도 5E에서, 오렌지 곡선 α로 자극 미처리 CD8 + 세포, αCD3 항체로 처리 파란색 곡선 CD8 + 세포, CD8가 + 세포 LDN 및 녹색 곡선의 존재 αCD3 자극 적색 곡선 나타내는 CD8 + 세포를 제시; HDN의 존재 CD3. αCD3 처리 된 세포에서 왼쪽으로 이동 (파란색 곡선)과 αCD3는 CD8 + 세포의 증식을 표시 HDN (녹색 곡선) 배양 세포를 처리합니다.
도 1 호중구 형태. 박층 셀 제조 다음 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)으로 염색 고밀도 (A) 및 저밀도 호중구 (B)의 광학 현미경 이미지. (C) 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지 고밀도의 호중구. 바 1,000 nm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 혈액 호중구 수는 종양 P 증가rogression 및 호중구는 세포 독성 표현형을 획득. (A) 1 mL의 순환 호중구 수는 BALB / c 마우스에서 종양 세포 접종 다음 다양한 일 FACS에 의해 계수 하였다. 개수 순환는 CD11b + Ly6G + 호중구 연속적 4T1 종양 진행에 따라 증가한다. (B) 4T1 유방 암종 세포가 어느 나이브 마우스의 고밀도 호중구 (종양 무료) 또는 4T1 종양 - 함유 마우스 (종양 베어링) 마우스 또는 배양으로 공 배양했다 호중구의 부재 (계속.) 37 ℃에서 20 시간 동안 중간에. 종양 베어링 마우스에 대한 호중구 수 있지만 종양 무료 쥐로부터는 4T1 종양 세포를 향해 중요한 세포 독성을 보여줍니다. 오차 막대는 학생의 T-test를 이용하여 ± SEM ** P <0.01를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
심장 구멍을 통해 쥐의 혈액 3. 컬렉션 그림. 마우스가 느린 이산화탄소 흐름에 따라 유도 챔버에서 안락사되었다. 마우스가 터미널 숨을 촬영 한 직후, 그것은 그것의 뒷면에 배치하고 1 ml의 헤파린 주사기는 심장에 도달 할 때까지 흉골의 기지에 삽입됩니다. 천천히 혈액을 흡인하는 플런저를 잡아 당깁니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전체 혈액 4. 호중구 정화 그림. (A) 3 ㎖ 1.077 g / mL의 슈 크로즈 신중 불연속 구배를 형성하기 위해 3 ㎖ 1.119 g / mL의 슈 크로즈의 상단에 적층된다. 6 ㎖의 최종 부피로 PBS-BSA (0.5 %)로 희석 항목 뮤린 혈액은, 1.07의 위에 다음 계층 인7g / mL의 슈 크로즈 (B) (700)와 절단없이 XG에서 30 분간 스핀 후, 3 별개 분획이 관찰 될 수있다.; R - 펠렛, G 적혈구 - 고밀도 호중구 M 함유 과립 분획 -. 단핵 세포 및 저밀도 호중구가 포함 된 단핵 분획물을 (C) 갓 그려진 사람의 혈액 덱스 트란 500 (동량 혼합 3 %), 30 분 동안 RT에서 배양한다. . 백혈구 (버피 코트)를 포함하는 상부 분획은 / mL의 슈 크로즈 절단없이 400 XG에 30 분간 스핀 이하의 (D)는,이 별개의 분획이 관찰 될 수있다 g 10 ml의 1.077의 상부에 적층되고; R + G - 적혈구 및 고밀도 호중구, M 함유 펠렛 -. 단핵 세포 및 저밀도 호중구가 포함 된 단핵 부분을 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
T 세포 증식의도 5 진압. 계측법 흐름이 부재 (B) 또는 LDN의 존재 αCD3 항체 자극 이후, 자극 (A)의 부재하에 배양 CFSE 표지 된 CD8 + 세포의 수를 나타내는 분석 (C) 또는 HDN (D) 패널에서 CD8 + 세포 CFSE 강도 (E) 히스토그램 프리젠 테이션 -.. D는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
호중구는 모든 백혈구 가장 풍부하며, 감염 및 염증의 경우 최초 대응한다. 이와 같이, 이들은 외부 큐에 매우 민감하고 쉽게 활성화된다. 또한, 호중구는 매우 짧은 반감기 및 빠른 회전율을 갖는다. 함께, 이러한 특성은 독특한 실험적인 전략이 필요되도록 호중구, 작업에 여러 가지 어려움을 올립니다. 예를 들어, 여러 호중구 정화 전략은 자신의 장점과 단점 각이있다.
호중구 작업에서 중요한 단계는 전체 혈액에서 자신의 정화입니다. 호중구 효율적 밀도 구배 또는 항체 기반 전략 (양 또는 음의 선택)을 사용하여 정제 할 수있다. 그것은 최소 비특이적 활성화와 고순도 호중구 높은 수치를 산출 이후 우리가 선택한 방법은 밀도 구배를 사용하는 것이다. 그러나, 우리는 최근의 연구 (21)에 표시로, 재치H 종양 진행 호중구 단핵 저밀도 분획 높은 번호에 축적된다. 밀도 구배의 사용은 고순도, 고밀도 호중구 분획을 제공하는 이러한 조건에서 그 전체를 순환하는 호중구 레퍼토리와 크게 다른 단핵 세포 (림프구 및 단핵구)로 오염되는 저밀도 호중구 분획을 대표하지 않는다. 이러한 상황에서의 선택의 방법은 항체 - 기반 정제, 음성 선별 바람직하다. 호중구를 정화하는 항체의 사용은 고순도 호중구를 산출 나은 전체 순환하는 호중구 레파토리를 나타낸다. 그러나, 우리는 중성 백혈구가 항체, 비 특정 활성화 증가에 대한 기회와 함께 배양하는 긴 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 최선의 결과를 위해, 항체 기반 호중구 정화가 가능한 한 빨리 수행되어야하는 것이 좋습니다. 항체 - 기초 호중구 정제는 또한 PU 선택 방법조직이나 종양에서 호중구를 rifying.
에 관계없이 선택한 정화 절차, 순도, 생존 및 기능의 무결성을 엄격하게 평가해야합니다. 호중구의 순도는 호중구 표면 마커와 반응하는 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 결정될 수있다. 표현형 - 마우스에서 LY-6G는 CD11b를 + LY-6C 낮은 LY-6G + F4 / 80을 특징으로 호중구, 특정입니다. 인간의 호중구는 LY-6G 유사한 마커를 표현하지 않고 자주는 CD11b, CD15, CD16, 및 CD66b의 발현을 특징으로한다. 호중구의 Fc 수용체를 갖고 있으므로, 이것들은 면역 염색 전에 차단 될 필요가있다. 호중구는 더 높은 SSC를 가짐으로써 다른 백혈구 구별 될 수있다. 생존력 정제 공정의 끝에서 결정되어야한다 (청색 프로토콜 2.1 트리 판) 98 %보다 일관되게 더 커야. 기능 무결성 푸리에 의해 결정되어야한다순진 마우스에서 호중구의 문법 없애기. 이 호중구 활성화 및 종양 세포 (프로토콜 7)와 공동 문화 설정에서 종양이 동반 된 호중구 비 세포 독성 제어를 제공하지 않습니다.
호중구의 낮은 번호와 함께 혈액 호중구의 짧은 반감기 (~ 3-5 10 5 ×) 순진한 (6) 1 ml의 혈액에서 달성 - 8 주 이전 마우스, 마우스 혈액 호중구의 기능을 탐구하기 어렵게 만들었다 체외. 호중구 번호는 만성 염증 (7)의 상태를 나타내는 암, 꾸준히 염증의 상태에 때때로 증가. 일부 연구자들은 골수 20 호중구 대체 소스를 찾기 위해 노력했다. 식염수에 1 ㎎ / ㎖ 모산 액 1 3 % 티오 글리콜 레이트 브로 쓰 용액 또는 용액 1 ml를 복강 내 주사 한 후 24 시간 - 마우스 호중구의 수가 많으면 4에서 얻을 수있다. 그러나이 유발 호중구을 발휘하지뉴욕 항 종양 활동 (게시되지 않은 관찰).
. 4 주 - 40000000 혈액 호중구 쉽게 1 ml의 혈액 3에서 고립 될 수있다 - Granot 등 6 BALB / c 마우스는 그 20 시간 (그림 2A)에 악화 호중구을 개발, 마우스 4T1 유방암과 동소 접종 관찰 후 종양 접종. 이러한 호중구 항암 활동을 획득하고 이에 따라 나이브 호중구 (도 2B)과 구별하기 위해, 종양 혼입 호중구 (TEN)을 지칭하고있다. 고밀도 호중구 (HDN)이 높은 항 종양이지만, 암의 문맥에서 생성 저밀도 호중구 (LDN)은 21이 아니다. 골수 종양 - 함유 마우스의 비장에서 고밀도 호중구는 항 종양 활성 (미공개 데이터)를 갖는다. 그것은에서 함께, 종양 진행과 비장 서서히 확대 (비장)를하게 주목해야한다호중구의 양 주름.
입양 전송 다음 호중구의 운명을 추적하기 위해, 이러한 표시하여야 할 필요가있다. 호중구 2 일간 격리하기 전에 종양 베어링 또는 순진 마우스에 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)를 주입하여 생체 내에서 표시 할 수 있습니다. BrdU의 세포 증식에 새로 합성 된 DNA 내로 통합된다 DNA 전구체 티미 딘의 아날로그이다. 호중구의 경우, BrdU의 성숙한 후 유사 분열 호중구로 분화 될 때 BrdU의 염색을 유지 전구 세포 증식에 혼입 될 것이다. BrdU의 혼입은 특정한 항 BrdU의 형광 항체를 이용하여 염색 할 수있다. BrdU의 + 세포를 유세포 분석기로 분석 할 수있다. 또 다른 방법은 5- 카복시 N 숙신 에스테르 (CFSE)로서 셀 추적기 염료 절연 호중구 라벨이다. CFSE 생존 세포는 세포막을 통과 할 수 에스테르 화합물이다. 그것은 아미노 반응 succinimid이세포 및 세포 표면 단백질 및 기타 아미노기로 형광의 공유 결합에 이르게 일 기. CFSE 표지 된 세포는 488nm의 아르곤 레이저를 이용하여 유세포 분석 될 수있다. 두 라벨링 기술의 BrdU 라벨링 CFSE 모든 호중구 얼룩하는 반면, 표지 될 모든 순환하는 호중구를 전구 세포 증식과하지에 의존한다는 사실은 다르다. CFSE의 검출은 그러나 BrdU의 라벨은 호중구 변환을 성숙 미성숙를 수행 할 수있는 좋은 수단이다, BrdU의 염색보다 더 간단합니다.
또한 호중구의 항 종양 및 항 전이 함수를 결정하는 데 여러 가지 방법을 설명 하였다. 다음은 호중구 고갈, 호중구 입양 전송, 종양 중화 테스트 및 분석을 시드 폐 전이를 포함한다. 이러한 각각의 분석 방법은 항 종양 호중구 기능의 특정 양태를 수행한다. 예를 들어, Granot 외. (6)는 그 위에 증착 관찰호중구 letion는 4T1 종양 - 함유 마우스에서의 폐 전이의 수는 호중구의 항 - 전이성 역할을 시사 증가된다. 호중구 대체 전송하면, 종양 세포는 정제 된 HDN의 정맥 내 주사하여 4 시간 전에 주입된다. 폐 및 간 전이를 형성하는 종양 세포의 능력이 생체 내 광 이미징 시스템을 사용하여 시간 과정 연구에 따른다. HDN 수용 마우스는 대조군 마우스 (6)를보다 적은 전이성 병소를 보였다. 종양 중화 시험에서, 종양 세포는 HDN의 존재는 종양 성장을 감소시킨다 (21), 또는 HDN없이 피하로 주입된다. 전이성 시드 분석에서, GFP 표지 된 종양 세포를 정맥 내로 제어 또는 호중구 고갈 사전 전이성 종양 - 함유 마우스에 주입되고, 폐 시드 GFP 표지 된 세포의 능력이 결정된다. 사전 전이성 종양 - 함유 마우스의 폐 종양 방지 높은 호중구 침윤을 특징으로특정 기관 6 셀 시딩. 이것은 제어 담암 마우스에 비해 호중구 결핍 마우스에서 더 전이성 병소로 변환한다.
프로토콜은 암의 컨텍스트에서 호중구 기능 연구 및 시험 관내 및 생체 내 암 관련 호중구 특성을 평가하기위한 전략을 제공에 초점을 설명했다. 그러나, 호중구 정제 전략뿐만 아니라 기술 된 실험 절차의 일부는 호중구가 중요한 역할 (즉, 염증 및 감염) 재생 실험 설정의 넓은 범위에서 호중구 기능 연구에 사용될 수있다.
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Acknowledgments
ZG는 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 11분의 41)의 I-CORE 프로그램에서 보조금 지원, Abisch-Frenkel 재단, Rosetrees 신뢰, 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF - 연구 경력 개발 상) 및 관심사 재단. ZGF가 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF - 연구 경력 개발 상)에서 보조금 지원, 건강의 이스라엘 정부와 이스라엘 폐 협회의 수석 과학자.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES | |||
| Mouse 4T1 breast carcinoma cells | ADCC | CRL-2539 | Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS |
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| 24-well Tissue Culture Plate | Falcon | 353047 | Sterile |
| 100 mm Tissue Culture Plate | Corning | 430167 | Sterile |
| 25 cm2 Tissue Culture Flask | Nunc | 156340 | Sterile |
| 90 mm Bacterial Grade Culture Dish | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 20090-01-017 | Sterile |
| 15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835015-40-111 | Sterile |
| 50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835050-21-111 | Sterile |
| Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube | Becton Dickinson | 352058 | Sterile |
| Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm | Merck Millipore | PSMT010R1 | Sterile |
| White 96-Flat-Bottom Well Plate | Costar | 3917 | Sterile |
| Cell Strainer (40 mm) | BD Falcon | 352340 | Sterile |
| 20G x 1.5" Needle | BD Microlance 3 | 301300 | Sterile |
| 23G x 1" Needle | BD Microlance 4 | 300800 | Sterile |
| 25G x 5/8" Needle | BD Microlance 5 | 300600 | Sterile |
| 0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle | BD Micro-Fine Plus Demi | 320829 | Sterile |
| 9 mm Clips | BD, AutoClip | 427631 | Sterile |
| EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | Sterile |
| MidiMACS Separator Magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Microscope Glass Slide | Menzel-Gläser Superfrost Plus Thermo | J1800AMNZ | |
| Orbital Shaker | Sky line, ELMI | S-3.02.10L | |
| Plate Reader | TECAN | InfiniteF200Pro | |
| POWDER | |||
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Sigma | A7906 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | BD Pharmingen | 550891 | Sterile |
| CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) | Molecular Probes | C1157 | |
| Dextran T500 | Sigma | 31392 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma | S8032 | Highly toxic, handle with care |
| Thioglycollate powder | Difco | 225650 | |
| Zymosan A | Sigma | Z4250 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Sigma | D5796 | Sterile |
| Opti-MEM® I reduced serum medium | Life Technologies | 31985062 | Sterile |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | Sterile |
| Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated | Sigma | F9665 | Sterile |
| L-Glutamine | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-020-1A | Sterile |
| Sodium pyruvate | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-042-1B | Sterile |
| Penicillin Streptomycin x 1000 solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-031-5 | Sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-1 | Sterile |
| PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-5A | Sterile |
| HPLC grade water | J.T. Baker | 4218-03 | Autoclave |
| SOLUTIONS | |||
| ACK – Ammonium-Chloride-Potassium | Life Technologies | A10492-01 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS | Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter. | ||
| CFSE, 5 mM in DMSO | Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC. | ||
| Eosin Y solution | Sigma | HT110-2-32 | |
| Hanks' balanced salt solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Heparin, 20 mg/ml in PBS | Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| Histopaque-1119 | Sigma | 11191 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
| Luciferase cell culture lysis buffer x5 | Promega | E153A | Dilute 1:5 in sterile water just before use. |
| Luciferase assay solution | Promega | E1501 | Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A) |
| Mayer's Hematoxylin solution | Sigma | MHS-32 | |
| PBS + 0.5% BSA | Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| PBS + 1% BSA | Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| 5x PBS with 2.5% BSA | Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| Saline (0.9% NaCl) | Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave | ||
| 0.2% NaCl solution | Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave | ||
| 1.6% NaCl solution | Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave | ||
| 2 % Sodium azide | Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic. | ||
| 3% Thioglycollate solution | Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw. Boil until solution becomes yellow and autoclave. | ||
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution. |
| Trypsin solution B | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-046-1 | Sterile |
| 1 mg/ml Zymosan A | Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use. | ||
| KITS | |||
| EasySep PE selection kit | STEMCELL Technologies | 18557 | |
| EasySep PE selection cocktail | STEMCELL Technologies | 18151 | |
| the EasySep magnetic nanoparticles | STEMCELL Technologies | 18150 | |
| Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-332 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19762 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19257 | |
| FITC BrdU flow kit | BD Pharmingen | 559619 | |
| MACS Neutrophil isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-097-658 | |
| Phagocytosis Assay Kit | Cayman Chemical Company | 500290 | |
| ANTIBODIES | |||
| FcR blocking antibody | Biolegend | 101302 | |
| Purified rat anti-Ly6G antibody | BD Pharmingen | 551459 | Clone 1A8 |
| PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody | Biolegend | 127608 | Clone 1A8 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G | BD Pharmingen | 551460 | Clone 1A8 |
| PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 65-1276 | Clone 1A8 |
| violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 75-1276 | Clone 1A8 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b | BD Pharmingen | 553310 | Clone M1/70 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) | BD Pharmingen | 553127 | Clone RB6-8C5 |
| PE-conjugated rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 553081 | Clone 30-F11 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80 | Abcam | ab60343 | Clone BM8 |
| FITC-conjugated mouse anti-human CD66b | Biolegend | 305103 | Clone G10F5 |
| Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k) | BD Pharmingen | 553927 | Clone R35-95 |
| LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11 |
References
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