Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل وتوصيف العدلات مع خصائص مضادة للورم

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

Abstract

العدلات، والأكثر وفرة من كل خلايا الدم البيضاء في الدورة الدموية البشري، ولعب دورا هاما في الدفاع المضيف ضد الميكروبات الغازية. بالإضافة إلى ذلك، العدلات تلعب دورا مركزيا في المراقبة المناعية للخلايا السرطانية. لديهم القدرة على التعرف على الخلايا السرطانية واستحثاث موت الخلايا السرطانية إما من خلال آلية تعتمد على الاتصال الخلية التي تنطوي على بيروكسيد الهيدروجين أو من خلال بوساطة الخلايا السمية الخلوية التي تعتمد على الأجسام المضادة (ADCC). العدلات مع النشاط المضادة للورم يمكن عزلها من الدم المحيطي من مرضى السرطان والفئران الحاملة للورم. وتسمى هذه العدلات العدلات-مجرور الورم (TEN) لتمييزها عن العدلات من الأصحاء أو الفئران السذاجة التي لا تظهر أي نشاط كبير الورم السامة للخلايا. مقارنة مع خلايا الدم البيضاء الأخرى، تظهر العدلات الطفو مختلفة مما يجعل من الممكن الحصول على> 98٪ سكان العدلة نقية عندما تتعرض لزيادة الكثافة. ومع ذلك، بالإضافةإلى عالية الكثافة الطبيعي سكان العدلة (HDN)، في المرضى الذين يعانون من السرطان في الفئران الحاملة للورم، وكذلك في ظل ظروف التهابات مزمنة، تظهر السكان منخفض الكثافة العدلات متميز (LDN) في الدورة الدموية. LDN شارك في تنقية مع الكسر وحيدات النوى ويمكن فصلها عن الخلايا وحيدة النواة باستخدام استراتيجيات إيجابية أو سلبية الاختيار. مرة واحدة يتم تحديد نقاء العدلات معزولة عن طريق التدفق الخلوي، ويمكن استخدامها لفي المختبر وفي الجسم الحي المقايسات الفنية. وصفنا التقنيات لرصد النشاط المضادة للورم من العدلات، وقدرتهم على الهجرة، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية، فضلا عن رصد قدرتها أكلة خارج الحي. نحن أيضا وصف أساليب لتسمية العدلات في الجسم الحي تتبع، وتحديد قدراتها المضادة للالمنتشر في الجسم الحي. كل هذه التقنيات ضرورية لفهم كيفية الحصول على وتميز العدلات مع المضادة للورموظيفة.

Introduction

تميزت في البداية العدلات كما الخلايا المناعية الفطرية التي تكون بمثابة خط الدفاع الأول ضد الميكروبات الغازية. اليوم أنه من المعروف أن العدلات وظائف بعيدة المدى أكثر من ذلك، بالتورط في تصاعد الاستجابات المناعية التكيفية ضد المستضدات الأجنبية 1،2، تنظم تكون الدم 3، 4 الأوعية الدموية والتئام الجروح 5. بالإضافة إلى ذلك، قد العدلات يؤثر على نمو الورم النقيلي والتقدم بحكم المؤيدة والمضادة للورم أنشطتها 6،7. وتتميز العدلات من قبل نواة مجزأة متعددة الأشكال (ومن هنا وصف النوى (PMN) الكريات البيض)، وتحتوي على الأقل ثلاثة أقسام فرعية متميزة من حبيبات فضلا عن حويصلات إفرازية 8 (الشكل 1A-C).

العدلات تمتلك القدرة أكلة عالية وNADPH عالية النشاط أوكسيديز حاسم للقضاء على الجراثيم، وتفرز مجموعة واسعة من كيموكينات هامة لفيالجر العدلات إضافية والخلايا المناعية الأخرى إلى موقع الالتهاب 8،9. وتتميز العدلات عن طريق التعبير عن كمية كبيرة من المستقبلات السطحية بما في ذلك تول مثل مستقبلات (TLRs)، C-نوع كتين المستقبلات (CLRs)، تكمل مستقبلات 3 (CD11b / CD18) وجزيئات الالتصاق الأخرى (على سبيل المثال، L-selectin، LFA-1، VLA-4 و سرطاني مضغي المتعلقة مستضد التصاق الخلايا جزيء 3 (CEACAM3 / CD66b))، مستقبلات chemokine (على سبيل المثال، CXCR1، CXCR2، CCR1، CCR2)، مستقبلات جاذب كيميائي (على سبيل المثال، PAFR، LTB 4 R وC5aR) ، مستقبلات خلوى (على سبيل المثال، G-CSFR، IL-1R، IL-4R، IL-12R، IL-18R، TNFR)، فورميل الببتيد مستقبلات (على سبيل المثال، FPR1-3)، ومستقبلات التيسير (على سبيل المثال، CD16 (FcγRIII )، CD32 (FcγRII)، وCD64 (FcγRI) (10). وفي الفئران، وعادة ما حددت العدلات كما CD11b + + Ly6G، في حين يتم تحديد العدلات الإنسان باستخدام CD11b، CD15، CD16 و CD66b علامات الكريات البيض. ومن المتفق عليه إلى وصمة عار لالميلوبيروكسيداز البروتينات الحبيبية (MPO) والإيلاستاز العدلات (NE) للكشف عن العدلات في الأنسجة.

فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت تتوسط وظائف متنوعة من العدلات من قبل الخلية نفسها أو عن طريق متميز خلية الفرعية من السكان. وتشير البيانات المتراكمة عن وجود سكان العدلة غيروي المنشأ الذي يظهر درجة عالية من المرونة المتضررين من المحفزات الموالية للالتهابات والمكروية 11،12. Fridlender وآخرون 13 قسمت بشكل صارخ العدلات في السرطان إلى اثنين من السكان الفرعي رئيسي يسمى N1 مع خصائص مضادة للورم وN2 مع خصائص الموالية للورم. في السرطان، وكذلك في الالتهابات المزمنة، هناك إضافي السكان الفرعية يتألف من خلايا المحببات المستمدة النخاعي القامع (G-MDSCs) التي تقمع T استجابات الخلايا 14. تعتبر G-MDSCs أن تكون خلايا الدم النخاعي غير ناضجة تتميز CD11b + Ly6Cانخفاض Ly6G النمط الظاهري مرحبا في الفئران 15، في حين وجود CD15 + / CD16 النمط الظاهري انخفاض في الإنسان 16. G-MDSCs تعبير عن مستويات أعلى من أرجيناز والميلوبيروكسيداز، في حين انخفضت مستويات السيتوكينات وكيموكينات من العدلات تعميم العادية. فهي أقل أكلة والمهاجرة، ولكن إنتاج مستويات أعلى من ROS 15،17،18. في هذه الورقة سنقوم بشرح بعض المنهجيات الأساسية لعزل وتوصيف العدلات مع خصائص مضادة للورم.

في حين تشكل العدلات أكبر عدد من السكان من جميع خلايا الدم البيضاء في الدورة الدموية البشري (45-70٪، 1800 - 6000 / ميكرولتر)، في الفئران، في ظل ظروف طبيعية، فهي قليلة نسبيا (10-15٪؛ 300-500 / ميكرولتر ). يزيد عدد العدلات باطراد على الالتهاب وأحيانا في مرض السرطان، وهو ما يمثل حالة من التهاب مزمن 7. العدلات من تطوير متعددة القدرات السلائف النخاعي المشترك (CMP) مLLS في نخاع العظم، من خلال عملية التمايز اجتياز مراحل myeloblasts (MB)، promyelocytes (PM)، myelocytes (MC)، metamyelocytes (MM) والخلايا الفرقة (BC) 8. قد تبقى ناضجة، العدلات بعد الإنقسامية داخل نخاع العظام ل4-7 أيام قبل أن يتم الإفراج عنهم لتداول 8. دوران العدلات في الدم عادة ما يكون سريعا بمعدل نصف عمر 6-12 ساعة، والتي قد تطول في ظل ظروف التهابات. العدلات Unstimulated محدودة النشاط المضادة للمكون للأورام، وهي الميزة التي يمكن الحصول عليها من خلال تعريض العدلات ساذجة إلى كيموكينات IL-8 (CXCL2)، CCL2، CCL5 وCXCL5 6،19 أو مصطنع، من خلال تعريضهم لphorbol phorbol استر 12 -myristate 13-خلات (PMA) 6.

وقصيرة العمر النصفي للالعدلات الدم جنبا إلى جنب مع انخفاض عدد العدلات (~ 3-5 × 10 5) تحققت من 1 ملليتر دم من السذاجة 6-8 الاسبوع الماوس القديم، جعلت منصعوبة في استكشاف وظيفة تعميم الماوس العدلات في المختبر. للتغلب على هذه الصعوبة، وقد تم استخدام مصادر أخرى. على سبيل المثال، يمكن الحصول على أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظم 20 أو الصفاق بعد تحريض التهاب عقيم (على سبيل المثال، بعد الحقن داخل الصفاق من thioglycollate مرق أو زيموزان A). تجدر الإشارة إلى أن العدلات تم الحصول عليها من التجويف البريتوني لا تمارس أي نشاط مضاد للمكون للأورام (المراقبة غير منشورة).

. غرانوت آخرون 6 وحظ أن الفئران BALB / ج تلقيح orthotopically مع الماوس 4T1 الثدي خط خلية سرطان تطوير العدلات الذي تفاقم مع ورم تقدم 6 (الشكل 2A)، بحيث 20-40000000 العدلات الدم يمكن عزلها من 1 ملليتر دم 3-4 أسابيع بعد ورم التلقيح. وقد اكتسبت هذه العدلات الأنشطة المضادة للورم، وكانت وفقا لذلك لجنة المحيط الهنديالعدلات NED-مجرور الورم (TEN)، وذلك لتمييزها عن العدلات ساذجة 6 (الشكل 2B). في حين العدلات عالية الكثافة (HDN، الشكل 1A) هي غاية المضادة للمكون للأورام، العدلات منخفض الكثافة (LDN، الشكل 1B) ولدت في سياق السرطان ليست 21. أيضا، العدلات عالية الكثافة من نخاع العظم والطحال من الفئران الحاملة للورم لديها النشاط المضاد للورم (بيانات غير منشورة). وتجدر الإشارة إلى أنه مع تطور الورم يصبح الطحال تدريجيا (تضخم الطحال)، مع كميات متزايدة من العدلات.

تجدر الإشارة إلى أن TEN يتم إنشاؤها أيضا في نماذج أخرى من السرطان بما في ذلك كل من العفوية (MMTV-PyMT وMMTV-Wnt1 الأورام الثديية وك رأس أورام الرئة مدفوعة) وحقن (AT-3 (MMTV-PyMT) وسرطان الثدي E0771 الخلايا، LLC ويس خلايا سرطان الرئة وخلايا سرطان الجلد B16-F10). ومع ذلك، فإن مدى تعبئة العدلات في هذه تومأو نماذج أقل بكثير من الفئران 4T1 تلقيح، تصل إلى 5-10 × 10 6 العدلات في 1 ملليتر دم بعد 3 أسابيع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ويتم شراء 5-7 أسابيع من العمر BALB / ج الفئران من هارلان (إسرائيل): الحيوانات. وتمت الموافقة على جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات من قبل لجنة الجامعة العبرية المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC). العينات البشرية: جمع الدم من مرضى السرطان والمتطوعين الأصحاء وافق عليها هداسا المركز الطبي جنة المراجعة المؤسساتية (IRB).

1. تحريض العدلات مع خصائص مضادة للورم في الجسم الحي باستخدام سرطان الثدي نموذج الفأر.

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام الحلول العقيمة في تدفق الهواء الصفحي مجلس الوزراء (الجيش اللبناني) بيو السلامة.

  1. البذور 5 × 10 5 4T1 الخلايا في 100 ملم لوحة زراعة الأنسجة في 10 مل من Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تحتوي على 4.5 غرام / L D-الجلوكوز تستكمل مع 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم D- الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل G و 100 ميكروغرام / مل سلفات الستربتومايسين. احتضان عشرخلايا البريد عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 لمدة 3 إلى 4 أيام. تأكد من أن الخلايا هي 50-100٪ متكدسة في يوم من التجربة.
  2. لفصل الخلايا السرطانية من لوحة زراعة الأنسجة، ونضح مستنبت، وغسل الخلايا مع 5 مل PBS، نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل من محلول التربسين 2.5 غرام / L. احتضان الخلايا 2-3 دقيقة مع التربسين في 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 10 مل تحتوي على مصل المتوسطة لتحييد التربسين وماصة صعودا ونزولا حتى كل من الخلايا تم فصل. نقل تعليق الخلايا إلى 15 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح المتوسطة مغادرة 200 ميكرولتر المتوسطة فوق بيليه الخلية. resuspend الخلايا في حجم المتبقية وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني. عكس أنبوب 2-3 مرات للحصول على تعليق خلية متجانسة وإخراج 10 ميكرولتر لحساب الخلايا في عدادة الكريات. استخدام الأزرق التريبان للتمييز بين الخلايا الحية والميتة. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 200 x ج في RT. نضح في برنامج تلفزيوني و resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني بتركيز نهائي من 2 × 10 6 خلية / مل. تأكد من أن تعليق خلية واحدة لا يوجد لديه تكتل.
  5. حقن 1 × 10 6 4T1 الخلايا أو 4T1 الخلايا في 50 ميكرولتر PBS orthotopically في اليسرى الأربية الثديية وحة الدهون من الإناث BALB / ج الفئران باستخدام حقنة 0.3 مل مع 8MM إبرة 30G س، معربا عن luciferase المراسل.
    1. قبل الحقن، وتخدير الفئران في غرفة الاستقراء حصوله على معدل التدفق البطيء للالأيزوفلورين (3-5٪) في 100٪ من الأكسجين.
    2. وضع الماوس على وسادة الجراحية المعقمة وتأكد من وضع الرأس بشكل صحيح داخل مخروط الأنف الأيزوفلورين. تأكيد التخدير المناسبة عن طريق معسر مخلب. استخدام مرهم التعليم والتدريب المهني في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير. حلق الشعر حول مكان الحقن وتطهير 70٪ ETOH.
    3. استخدام مجموعة من الأدوات الجراحية المعقمة إلى إجراء شق أفقي صغير (5 ملم) تقريبافي منتصف الطريق imately بين الاربية والحلمات البطن، وفضح لوحة الدهون وحقن 1 × 10 6 4T1 الخلايا في 50 ميكرولتر. إغلاق الشقوق مع لقطات 9 ملم التي ينبغي إزالتها بعد أسبوع واحد. حقن الخلايا، معربا عن luciferase المراسل يسمح رصد حجم الورم والانبثاث بواسطة التصوير تلألؤ بيولوجي.
      ملاحظة: لا يتطلب هذا الإجراء مينيملي أي علاج بعد الجراحة وحقن الفئران على التعافي غضون 2 - 3 دقائق.
    4. مراقبة الفئران حتى يستعيد وعيه، وتأكد من أنها يستعيد وعيه الكامل قبل أن ينضم إلى شركة من الفئران الأخرى.
  6. بعد 3-4 أسابيع، عندما وصلت الورم الرئيسي وبلغ حجم التداول 2 سم 3، التضحية الفئران عن طريق بطيئة CO 2 تيار، وعلى الفور بعد آخر رمق، الحصول على الدم عن طريق ثقب في القلب باستخدام 25G X 5/8 "إبرة متصلة السلين حقنة 1 مل سابقة التجهيز مع الهيبارين. إبقاء الفم من الإبرة إلى أعلى عند إدراجحقنة في وضع أفقي من خلال الحجاب الحاجز باتجاه القلب، وببطء وتدريجيا رسم الدم تجنب الضغط الزائد (الشكل 3).

2. العدلات عزل

  1. العزلة من العدلات السامة للخلايا من الدم من الفئران الحاملة للورم.
    1. تمييع 1 مل الدم المسحوبة من ماوس الورم الحاملة (انظر بروتوكول 1.11) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (BSA) إلى الحجم النهائي من 6 مل.
    2. تجزئة الدم المخفف على التدرج السكروز متقطع الطازجة:
      1. إضافة 3 مل من العقيمة التي تمت تصفيتها السكروز 1،119 ز / مل في الجزء السفلي من 15 مل البولي بروبلين المخروطية أنبوب الطرد المركزي.
      2. ببطء وبعناية، طبقة 3 مل من العقيمة التي تمت تصفيتها السكروز 1،077 ز / ​​مل على رأس ز / مل طبقة 1.119. بعد ذلك، إضافة ببطء وبعناية 6 مل من الدم المخفف (بروتوكول 2.1.1) على أعلى من 1.077 جم / مل طبقة (الشكل 4A). فمن المستحسن أن عقد أنبوب مائل وdding المكونات المختلفة من خلال التدفق البطيء، ولكن المتواصل، والحفاظ على فم ماصة نحو الجدار السفلي من الأنبوب، بحيث يتم تشكيل أي اضطرابات.
    3. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على الدم المخفف على التدرج السكروز في 700 x ج لمدة 30 دقيقة في RT دون فرامل.
    4. إزالة بعناية أنبوب من أجهزة الطرد المركزي دون أن تسبب أي اضطراب. فإن معظم الكريات الحمراء تكون على الجزء السفلي من الأنبوب. تم العثور على العدلات عالية الكثافة (HDN) باعتباره حلقة بيضاء إلى أحمر في واجهة بين 1.119 جم / مل و1.077 جم / مل طبقات (حول علامة 3 مل)، في حين تم العثور على الكريات البيض منخفض الكثافة في حلقة بيضاء في واجهة بين 1.077g / طبقة مل وPBS BSA التي تحتوي على (حول علامة 6 مل، انظر الشكل 4B).
    5. نضح BSA PBS + 0.5٪ حتى وصلت 5 مم فوق طبقة الخلايا منخفض الكثافة. ماصة على خلايا منخفض الكثافة عن طريق الشفط البطيء في تلميح 1 مل من خلال يحوم ببطء حول الخلايا.نقل الخلايا إلى 30 مل من برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ BSA.
    6. نضح الطبقة العليا في نفس أنبوب التدرج حتى تصل إلى 5 ملم فوق الفرقة خلية ذات الكثافة السكانية العالية. ماصة على خلايا عالية الكثافة، التي هي في معظمها العدلات عالية الكثافة، ونقل الخلايا إلى 30 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ BSA.
    7. الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    8. نضح طاف وليز كريات الدم الحمراء عن طريق إعادة التعليق الخلايا في 36 مل العقيمة المياه HPLC الصف لمدة 30 ثانية. تساوي التوتر يجب أن تعاد بإضافة 9 مل من 5X تتركز تستكمل برنامج تلفزيوني مع 2.5٪ (ث / ت) BSA.
    9. الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    10. نضح طاف، و resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني BSA. حساب عدد العدلات في عدادة الكريات واستخدام اللون الأزرق التريبان للتمييز بين الخلايا الحية والميتة.
    11. الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في RT و resuspend العدلات في المرجوة المتوسطة الحضانة إلى كثافة الخلية النهائية. استعمالالعدلات على الفور.
    12. ثم، بعد الطرد المركزي أخرى، resuspend والعدلات في الحضانة المتوسطة لكثافة الخلية النهائية. استخدام العدلات على الفور.
  2. عزل تعميم العدلات من مرضى السرطان.
    1. مزيج 10 مل من heparinized (20 U / مل) الدم البشري مع حجم مساو من 3٪ ديكستران T500 في المياه المالحة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. خلال هذه الحضانة كريات الدم الحمراء والرواسب.
    2. إعداد 50 مل المخروطية أنبوب البولي بروبلين مع 10 مل السكروز 1،077 ز / مل وطبقة ببطء طاف الكريات البيض الغنية على الجزء العلوي من 1.077 جم / مل السكروز طبقة (الشكل 4C).
    3. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في RT دون فرامل. والعدلات عالية الكثافة (HDN) تظهر في بيليه. العدلات منخفض الكثافة (LDN) شارك في تنقية مع وحيدات الخلايا اللمفية في واجهة بين 1.077 جم / مل طبقة السكروز والبلازما (الشكل 4D).
    4. Resuspend والعدلات في 10 مل 0.2٪ كلوريد الصوديوم لمدة 30 ثانية إلى ليز كريات الدم الحمراء تلويث، واستعادة تساوي التوتر بإضافة 10 مل من 1.6٪ كلوريد الصوديوم وعكس مرة واحدة.
    5. الطرد المركزي 5 دقائق في 160 x ج في RT، ويغسل ثلاث مرات في 20 مل هانكس "حل متوازن الملح. أجهزة الطرد المركزي بعد كل غسيل ونضح طاف.
    6. عد العدلات وresuspend الخلايا في RPMI-1640 تستكمل مع 2٪ FBS في 2 × 10 6 العدلات / مل أو كما تريد.

3. إثراء الدم العدلات باستخدام الخرز المغناطيسي

  1. اختيار إيجابية
    1. تأخذ 1 مل من الدم من الماوس كما هو موضح في بروتوكول 1.8، مع حقنة heparinized.
    2. أجهزة الطرد المركزي الدم في أنبوب مخروطي 15 مل بسعر 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    3. نضح طاف أو الاحتفاظ بلازما الدم لمزيد من الدراسات.
    4. ليز كريات الدم الحمراء عن طريق إعادة التعليق الخلايا في 8 مل من الماء HPLC الصف. بعد 30 ثانية استعادة تساوي التوتر بإضافة 2 مل من 5X بغية دراسته واقرارهntrated PBS تحتوي على 2.5٪ BSA. عد الخلايا.
    5. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    6. resuspend الكرية الخلية في 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA لكل 10 8 خلايا.
    7. إضافة 50 ميكرولتر من المعقدة البيروكسيديز المضادة للLy6G الأجسام المضادة. تخلط جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة في الثلاجة (وليس على الجليد).
    8. إضافة 150 ميكرولتر PBS الباردة التي تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA.
    9. دوامة المغلفة microbead المغناطيسي محلول المخزون مكافحة البيوتين. نقل 100 ميكرولتر لتعليق الخلية. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة (ليس على الجليد).
    10. غسل الخلايا بإضافة 10 مل PBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA، وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    11. نضح طاف تماما، وresuspend في 500 ميكرولتر PBS الباردة التي تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA.
    12. إدراج عمود الفصل المغناطيسي إلى حامل المغناطيس الذي يتم تركيبها على الوقوف المغناطيسي، وشطفه مع 500 ميكرولتر PBS الباردة التي تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA.
    13. تطبيق تعليق خلية على العمود. لمن خلال تدفق يحتوي على خلايا LyG6 سلبية غير المسماة.
    14. غسل العمود مع 500 ميكرولتر PBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA. غير المسماة الخلايا الإضافية سوف تكون في التدفق من خلال.
    15. كرر الخطوة غسل 500 ميكرولتر PBS آخر يحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA.
    16. إزالة عمود من المغناطيس ووضعه على أنبوب جمع 15 مل. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA، وطرد الخلايا المسمى مغناطيسيا عن طريق دفع بقوة المكبس في العمود. تدفق يحتوي من خلال العدلات Ly6G +.
  2. اختيار السلبية
    1. إعداد الكريات البيض في الدم وفقا لخطوات 3.1.1 إلى 3.1.5.
    2. و resuspend 1 × 10 8 الخلايا في 1 مل PBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA في البوليسترين 5 مل أنبوب الجولة القاع.
    3. إضافة 50 ميكرولتر مصل الفئران العادية.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من تخصيب العدلات جocktail (التي تحتوي على الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز محددة لخلايا الدم البيضاء غير المتعادلة)، تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة.
    5. غسل الخلايا عن طريق إضافة 4 مل PBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA، وأجهزة الطرد المركزي 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
    6. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في 1 مل PBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA.
    7. إضافة 50 ميكرولتر من المجمعات الأجسام المضادة رباعي القسيمات الموجهة ضد البيوتين وديكستران. تخلط جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة في الثلاجة.
    8. دوامة جيدا الأنبوب الذي يحتوي حبات المغلفة ديكستران المغناطيسي قبل إضافة 150 ميكرولتر لتعليق الخلية. تخلط جيدا واحتضان 10 دقيقة في الثلاجة.
    9. جلب تعليق خلية إلى إجمالي حجم 2.5 مل عن طريق إضافة PBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA. المزيج بلطف للحصول على تعليق خلية متجانسة.
    10. إدراج أنبوب (بدون غطاء) في المغناطيس، واسمحوا الوقوف لمدة 3 دقائق.
    11. عكس المغناطيس مع أنبوب في واحد مستمرالحركة ان هذه الخلايا غير منضم في السائل سيتم نقلها إلى أنبوب جديد. ترك المغناطيس وأنبوب مقلوب ل2-3 ثانية، ثم العودة إلى وضع مستقيم. ستبقى الخلايا غير المرغوب فيها وصفت مغناطيسيا ملزمة لجدار الأنبوب الأصلي، في حين أن العدلات غير منضم سيكون في السوائل المنقولة.

4. النسيجية تلطيخ من العدلات

  1. و resuspend 1X10 5 العدلات في 50 ميكرولتر PBS ونقل تعليق خلية إلى طبقة رقيقة محول إعداد الخلية مثل Cytospin. أجهزة الطرد المركزي محول في 150 x ج لمدة 5 دقائق. فصل شريحة زجاجية وصفت قبل من المحول.
  2. إصلاح الخلايا عن طريق غمس شرائح زجاجية في 70٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة. السماح للالاستعدادات من محول (راجع الخطوة 4.1) لتجف في RT قبل تلطيخ. تراجع الشرائح 5-6 مرات في الماء المقطر.
  3. وصمة عار 1-2 دقيقة في الهيماتوكسيلين حل ماير. شطف 1 دقيقة فى ماء الصنبور. وصمة عار 10 ثانية في حل يوزين Y . تغسل في ماء الحنفية. يذوى من قبل الشطف الشرائح في زيادة تركيزات الإيثانول (70٪، 96٪ و 100٪). السماح للشرائح زجاجية الهواء الجاف قريبا وتفتيش الشرائح تحت المجهر الضوئي.
    ملاحظة: الهيماتوكسيلين لها لون وبقع زرقاء اللون الأرجواني العميق الأحماض النووية، في حين يوزين وردي والبقع البروتينات nonspecifically. حبيبات هيولية العدلات تظل غير ملوثين بواسطة الأصباغ الحمضية أو القاعدية، التي هي أصل اسم "المحبة أن يكون محايدا. في حين مستقعد المحببة وصمة عار الأزرق الداكن مع الهيماتوكسيلين ويوزين وeosinophilc المحببة أحمر، ويبدو أن العدلات الوردي محايد (انظر الشكل 1A). وتتميز العدلات الناضجة التي كتبها نواة النوى، والتي هي بشكل عام كبيرة مع 2-5 فصوص "العدلات مجزأة" (1A الشكل و1C). وتتميز العدلات غير ناضجة من قبل الفصوص واحد النواة المقوسة أو على شكل حلقة (الشكل 1B).
ve_title "> 5. تحديد الطهارة من العدلات بواسطة التدفق الخلوي.

  1. و resuspend الخلايا 1x10 6 في 100 ميكرولتر من العازلة FACS (PBS تحتوي على 0.5٪ BSA، 2 مم EDTA و 0.02٪ نان 3). للحصول على عينات دم كاملة، مطلوب انحلال الدم قبل تلطيخ (الخطوات 3.1.1 إلى 3.1.5). إضافة 10 ميكرولتر من FCR حجب الكاشف لمدة 5 دقائق.
  2. إضافة 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة الفلورسنت المسمى مع خصوصية للي-6G لالعدلات الماوس أو لCD11b وCD66b لالعدلات الإنسان، وتخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  3. ضبط مستوى الصوت إلى 500 ميكرولتر مع PBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA وتحليل تلطيخ التدفق الخلوي.

6. متابعة العدلات بوابة في الجسم الحي

  1. في وضع العلامات BrdU فيفو العدلات
    1. ضخ 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل bromodeoxyuridine (BrdU) حل في برنامج تلفزيوني العقيمة البريتونى على الفئران الحاملة للورم.
    2. عزل العدلات الدم 48 ساعة بعد الحقن لccording لبروتوكول 2.1. وصمة عار العدلات باستخدام طقم تدفق BrdU BrdU المسمى.
  2. وضع العلامات CFSE العدلات
    1. و resuspend 10 7 العدلات في 1 مل من برنامج تلفزيوني قبل تحسنت.
    2. إضافة 2 ميكرولتر من 5 ملم CFSE حل الأسهم إلى العدلات مع وقف التنفيذ إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C. تم إعداد 5 ملي CFSE عن طريق إذابة 2.8 ملغ من CFSE (5- (و 6 -) - Carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات، succinimidyl استر) في 1 مل DMSO. تقسم إلى 10 مكل في العقيمة 200 أنابيب ميكرولتر وتخزينها في الظلام عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    3. تحييد الزائد CFSE بإضافة حجم مساو من RPMI-1640 تحتوي على 10٪ FBS. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C. أجهزة الطرد المركزي العدلات في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. غسل العدلات مرتين في 10 مل من RPMI-1640 تحتوي على 10٪ FBS.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة و resuspend في حجم مناسب من برنامج تلفزيوني. العدلات (على سبيل المثال، 1 × 10 7

7. في المختبر luciferase المراسل الفحص لمراقبة النشاط المضاد للاورام المعزولة العدلات.

  1. زراعة الخلايا السرطانية المسمى luciferase المراسل كما هو موضح 4T1 الخلايا في بروتوكول 1،1-1،5، ولكن resuspend الخلايا-فصل التربسين في الأمثل تخفيض المتوسطة المصل تستكمل مع 2٪ FBS. ضبط كثافة الخلية إلى 5 × 10 4 خلايا لكل مل.
  2. البذور 5000 الخلايا السرطانية المسمى luciferase المراسل في 100 ميكرولتر الأمثل تخفيض المتوسطة مصل يحتوي على 0.5٪ FBS في كل بئر من البيض 96-شقة-أسفل لوحة جيدا الأنسجة الثقافة.
  3. 4 ساعات بعد البذر الخلايا السرطانية، إضافة 1 × 10 5 العدلات في 50 ميكرولتر الأمثل تخفيض المتوسطة مصل يحتوي على 0.5٪ FBS، واحتضان O / N. إعداد تعليق الخلية العدلة مع كثافة 2 × 10 6 خلية / مل. يجب آبار المراقبة الحصول على 50 ميكرولتر المتوسطة دون العدلات. فعليكرر متعددة من كل إعداد التجريبية.
  4. في صباح اليوم التالي، ونضح بلطف طاف وغسل كل بئر مع 200 ميكرولتر PBS. نضح PBS وإضافة 50 ميكرولتر من تحلل العازلة السلبي. لخلايا فصل بسهولة (مثل AT-3 خلايا)، لا يغسل في برنامج تلفزيوني وإضافة العازلة تحلل ثقافة الخلية مباشرة بعد الشفط المتوسطة النمو.
  5. تغطية لوحة بورق الألمنيوم واحتضان على شاكر المداري في 150 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في RT.
  6. وضع لوحة في قارئ لوحة التلألؤ. حقن جيدا الحكمة 50 ميكرولتر حل luciferase المراسل الفحص، وقراءة معان كيميائي لمدة 10 ثانية لكل بئر.
  7. حساب تحلل٪ الورم عن طريق المعادلة التالية:٪ الورم تحلل = (1- [التألق من العينات مع العدلات] / [التألق من العينات في المتوسط]) × 100٪.

ملاحظة: لتقييم مساهمة العدلات لبذر المنتشر، قد استنفدت العدلات كما هو موضح في بروتوكول 8.1. لdepl فعالةetion إدارة الأجسام المضادة المستنفدة للالعدلات بدءا من اليوم 7 وظيفة للورم engraftment.

آخر 8. المضادة للالنقيلي من العدلات في سرطان الثدي نموذج الفأر.

  1. في استنزاف الجسم الحي من العدلات.
    1. طازجة إعداد 12.5 ميكروغرام من الفئران مكافحة Ly6G الأجسام المضادة (العدلات المستنفدة الضد) أو من الفئران isotype السيطرة الأجسام المضادة (مفتش 2A، Κ) في المياه المالحة في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر في الماوس.
    2. بدءا من اليوم 3 بعد ورم engraftment حقن يوميا جرعة داخل الصفاق من 12.5 ميكروغرام الفئران مكافحة Ly6G الأجسام المضادة (100 ميكرولتر). حقن الفئران التحكم مع أو 12.5 ميكروغرام (100 ميكرولتر) isotype السيطرة الفئران الأجسام المضادة (مفتش 2A، Κ).
    3. بدءا من اليوم 14 وإدارة الأجسام المضادة مرتين يوميا، حيث أن معدل إنتاج العدلات يزيد بشكل كبير عندما ينمو الورم 4T1.
    4. كل يوم، الحصول على عينة الدم (2-3 قطرات) من خلال الخدش الجانبي الذيل الوريد. جمع الدم إلى مضاد-coagulant تحتوي على أنبوب (الهيبارين، السيترات أو EDTA).
    5. تحقق من استنزاف العدلات باستخدام التدفق الخلوي كما هو موضح في بروتوكول 5.
  2. ورم تحييد اختبار (التعديل وين الفحص)
    1. عزل العدلات من الفئران الحاملة للورم. مزيج 1 × 10 6 خلايا الورم و3 × 10 6 العدلات في 50 ميكرولتر المالحة (في الماوس).
    2. حقن الخلايا تحت الجلد إلى الجناح من 6-8 أسابيع ساذجة الفئران BALB / ج القديمة. حلق الجناح قبل الورم engraftment للسماح قياسات دقيقة لحجم الورم. قياس حجم الورم انطلاق اليومي في يوم 5 بعد engraftment.
  3. العدلات نقل بالتبني
    1. حقن 2 × 10 4 الخلايا السرطانية، معربا عن luciferase المراسل في 200 ميكرولتر PBS إلى الوريد الذيل.
    2. يجب أن يتم تنفيذ نقل العدلات 4 ساعات بعد حقن الخلايا السرطانية. ومن هنا، تبدأ تنقية HDN من الفئران الورم الحاملة (بروتوكول 2.1) حوالي 2 ساعة قبل المخطط لها فينقل الجسم الحي. و resuspend العدلات في برنامج تلفزيوني في تركيز النهائي من 2.5 × 10 7 خلية / مل.
    3. 4 ساعات بعد إدخال الخلايا السرطانية تضع الفئران تحت مصباح الحرارة لمدة 5 دقائق. وضع الفئران في رادع وحقن 5 × 10 6 HDN (200 ميكرولتر) عن طريق الوريد الذيل. يتم حقن الفئران التحكم مع السيارة (PBS).
    4. رصد تشكيل الانبثاث الرئة عند نقاط زمنية مختلفة باستخدام تلألؤ بيولوجي في نظام التصوير الحي أو عن طريق المناعية.
  4. الرئة المنتشر البذر فحص
    1. حقن 0،5-1 × 10 6 خلايا 4T1 الوالدين orthotopically في اليسرى الأربية الثديية وحة الدهون كما هو موضح في البروتوكول 1.
    2. في يوم 10، و resuspend، معربا عن GFP 4T1 الخلايا في برنامج تلفزيوني بتركيز نهائي من 5 × 10 5 خلية / مل. وضع الفئران تحت مصباح الحرارة لمدة 5 دقائق.
    3. وضع الفئران في رادع وحقن 1X10 5، معربا عن GFP 4T1 الخلايا (200 ميكرولتر) عن طريق الوريد ل4T1 الفئران الحاملة للورم أو الفئران ساذجة.
    4. في اليوم التالي، الموت ببطء الفئران ويروي الرئتين مع 20 مل PBS لإزالة كرات الدم الحمراء المتبقية.
    5. استئصال الرئتين لتحليل الخلايا GFP إيجابية من المناعية.
      ملاحظة: لتقييم مساهمة العدلات لبذر المنتشر، قد استنفدت العدلات كما هو موضح في بروتوكول 8.1. لنضوب الفعال إدارة الأجسام المضادة المستنفدة للالعدلات بدءا من اليوم 7 وظيفة للورم engraftment.

9. قمع T خلية انتشار من قبل العدلات من الفئران الحاملة للورم.

  1. إزالة الطحال من السذاجة BALB / ج الماوس ومكان الموت الرحيم في 10 مل PBS.
  2. وضع الطحال على مصفاة الخلية 40 ميكرومتر أن يصلح على طبق بتري مليئة RPMI-1640. باستخدام نهاية المكبس من المحاقن، والهريس والطحال من خلال الخلايا مصفاة في طبق بتري. شطف مصفاة الخلية مع 5 مل RPMI. تجاهل مصفاة.
  3. نقل الخلايا معلق إلى 50 مل أنبوب مخروطي وأجهزة الطرد المركزي 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  4. تجاهل طاف، وليز كريات الدم الحمراء من خلال تعليق الخلايا في 36 مل من الماء النقي لمدة 20 ثانية، والتكيف مع تساوي التوتر عن طريق إضافة 4 مل من PBS تتركز س 10. بدلا من ذلك، ليز كريات الدم الحمراء من خلال تعليق الخلايا في 5 مل من الكريات الحمراء الناشر العازلة (ACK)، واحتضان 5 دقائق على RT. تحييد ACK بإضافة 10 مل من المتوسط ​​RPMI-1640. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. resuspend الخلايا في 5 مل PBS وعدد الخلايا.
  5. Resuspend وsplenocytes في برنامج تلفزيوني لكثافة النهائية من 4 × 10 7 خلايا / 2 مل في أنبوب 15 مل. إضافة 2 مل من محلول CFSE 2.5 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني. عكس بسرعة الأنبوب واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الخلط أحيانا (كل 2 دقيقة)، محمية من الضوء.
  6. إخماد الزائد CFSE بإضافة 4 مل من قبل تحسنت FBS (100٪)، واحتضان لمدة 1 دقيقة في RT. إضافة 3 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10دقيقة.
  7. غسل الخلايا مع 30 مل PBS، وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  8. تصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر، ويغسل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني.
  9. resuspend الخلايا في المتوسط ​​RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FBS إلى الكثافة النهائية من 2 × 10 7 خلية / مل.
  10. البذور 2 × 10 6 / جيد (200 ميكرولتر) في 24-جيدا لوحة نسيج الثقافة.
  11. تحفيز الخلايا عن طريق إضافة 1 ميكروغرام من المنقى الهامستر الأرمني مكافحة فأر CD3ε الأجسام المضادة في 500 ميكرولتر RPMI-1640 مع 10٪ FBS.
  12. إضافة 2 × 10 6 HDN أو LDN في 300 ميكرولتر RPMI-1640 مع 10٪ FBS إلى splenocytes CFSE المسمى، واحتضان لمدة 3 أيام في 37 ° C. يجب الآبار دون العدلات على 300 ميكرولتر المتوسطة. يجب أن يكون الحجم الإجمالي في كل بئر 1 مل.
  13. جمع الخلايا وإعدادهم للالتدفق الخلوي. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر FACS العازلة (بروتوكول 5)، وإضافة 10 ميكرولتر من FCR حجب الكاشف. احتضان لمدة 5 دقائق على RT.
  14. إضافة 1 &# 956؛ ل من APC مترافق مكافحة CD8α الأجسام المضادة واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  15. تحديد كثافة مضان CFSE على خلايا CD8 + T التدفق الخلوي (الشكل 5). والنصف كثافة CFSE على كل انقسام الخلايا. وبالتالي، يمكن تحديد عدد من الانقسامات الخلوية التي كتبها كثافة CFSE تلوين.

10. العدلات الهجرة الفحص

  1. البذور 5X10 5 4T1 الخلايا في 7 مل الأمثل تخفيض المتوسطة المصل تستكمل مع 0.5٪ FBS في 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة واحتضان 24 ساعة عند 37 ° C.
  2. نقل 800 ميكرولتر من طاف للغرفة السفلى من لوحة الهجرة مع حجم المسام من 5 ميكرون.
  3. و resuspend 2 × 10 5 العدلات في 400 ميكرولتر من الأمثل تخفيض المتوسطة المصل تستكمل مع 0.5٪ FBS. تطبيق تعليق خلية إلى غرفة العليا واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  4. في نهاية الحضانة، وإزالة الغرفة العلوية وحساب عدد العدلات التي هاجرت إلى غرفة أسفل.

11. رصد العدلات إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS).

  1. إعداد 1.1 × 10 6 العدلات / مل في محلول ملحي متوازن هانك دون أحمر الفينول. لوحة 180 ميكرولتر يحتوي على 2 × 10 5 العدلات في كل بئر من البيض لوحة جيدا 96-شقة القاع.
  2. وضع لوحة في قارئ لوحة التلألؤ. إضافة 20 ميكرولتر من حل Luminol 500 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني على كل جانب للحصول على التركيز النهائي من 50 ميكرومتر. قراءة التوهج القاعدية لل1sec وفي دورة زمنية من 5 دقائق مع 10 فترات ثانية.
  3. إضافة منبه (على سبيل المثال، سلطة النقد الفلسطينية في تركيز 10 نانومتر أو 100 نانومتر أو fMLP بتركيز 10 ميكرومتر). إعداد 10X محلول مركز من كل وكيل في محلول ملحي متوازن هانك دون الفينول الأحمر وإضافة 22 ميكرولتر من الآبار منها. للسيطرة على آبار إضافة 22 سيارة ميكرولتر.
  4. Measuإعادة لمعان كيميائي في قارئ لوحة. هل كل من القصير (كل 10 ثانية لمدة 5 دقائق) وطويلة (كل دقيقة لمدة 1 ساعة) دورة زمنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في دراسة حديثة حددنا وظيفة مضادة للالمتنقل للالعدلات 6. العدلات من الفئران الحاملة للورم تكتسب النمط الظاهري السامة للخلايا ولها القدرة على قتل الخلايا السرطانية 6. هذا هو على النقيض من العدلات من الفئران السذاجة التي ليس لها تأثير مضاد للورم كبير 6. العديد من الأساليب المذكورة في قسم البروتوكول استخدمت لدراسة المضادة للورم وظيفة العدلات في المختبر والمجراة 6.

ويمكن الحصول على العدلات الورم السامة للخلايا من الورم الحاملة الفئران 6. لتحقيق هذا الهدف، تم حقن الفئران orthotopically مع 4T1 الخلايا في الناحية اليسرى الأربية الثديية وحة الدهون (البروتوكول 1). يوم 21 بعد ورم التلقيح، وصل الورم الرئيسي لحجم 1-2 سم 3 (الشكل 3 - الورم هو واضح في البطن اليسرى السفلى). في هذا الوقت، والموت الرحيم الفئران واسترعي 1 ملليتر دم (في الماوس)من خلال ثقب في القلب (الشكل 3). في موازاة ذلك، تم سحب الدم من ماوس ساذجا، غير الورم الحاملة. تم HDN ثم تنقيته على التدرج الكثافة (بروتوكول 2.1 والشكل 4) لانتاج نقية للغاية (> 98٪) من سكان العدلات. تم تحديد الجدوى العدلات من قبل التريبان الأزرق تلطيخ (بروتوكول 2.1). ثم تم معلق العدلات في الأمثل تخفيض المتوسطة مصل يحتوي على 0.5٪ FBS في 2 × 10 6 العدلات / مل.

لاختبار مدى سمية الخلايا العدلة، واضاف نحن 10 5 العدلات (50 ميكرولتر من 2 × 10 6 العدلات / مل محلول المخزون) إلى luciferase المراسل معربا عن 4T1 الخلايا المستهدفة (5000 خلية / جيدا في 100 ميكرولتر) في شقة القاع الأبيض 96 لوحة -well (بروتوكول 7). بعد O / N الحضانة، وكانت تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني وهي lysed في العازلة السلبي تحلل الخلايا واختبار luciferase النشاط في كل عينة لتقييم مدى العدلة السمية الخلوية ( (الشكل 2B، ورم الحرة)، تنقية العدلات من الفئران الحاملة للورم تبين السمية الخلوية كبيرة (الشكل 2B، واضعة ورم).

لاختبار خصائص القمعية المناعية في LDN وHDN كنا مقايسة انتشار الخلايا التائية (بروتوكول 9). نحن تقييمعدد الخلايا CD8 + في splenocytes غير المعالجة وsplenocytes تعامل مع الأجسام المضادة αCD3، والتي كانت المثقف وحده، والخلايا التي تم زرعها في وجود LDN أو في وجود HDN (الشكل 5A-D). لاحظ زيادة كبيرة في الخلايا CD8 + CFSE + بعد التحفيز مكافحة CD3 (قارن اللوحة العليا اليمنى في A و B) تأثير كابح بشكل دراماتيكي من القمعية LDN (قارن لوحة العلوي الأيمن في B و C) وعدم وجود تأثير كابح من HDN (لوحة D). نحن أيضا تقييم مدى الاحتفاظ CFSE، كمؤشر لانتشار الأسلحة النووية. في الشكل 5E، ويعرض منحنى البرتقال CD8 + الخلايا غير المعالجة، والمنحنى الأزرق CD8 + الخلايا، وتعامل مع الأجسام المضادة αCD3، والمنحنى الأحمر CD8 + خلايا حفز مع αCD3 بحضور LDN ومنحنى الأخضر يمثل الخلايا CD8 + حفز مع α؛ CD3 بحضور HDN. ملاحظة التحول اليساري في الخلايا αCD3 المعالجة (المنحنى الأزرق) وαCD3 تعامل الخلايا المستزرعة مع HDN (منحنى الخضراء)، التي تشير إلى انتشار الخلايا CD8 +.

الشكل 1
الشكل 1. العدلات التشكل. الخفيفة صورة مجهرية عالية الكثافة (A) والعدلات منخفض الكثافة (B) ملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) بعد إعداد خلية طبقة رقيقة. (C) ونقل الإلكترون المجهري (TEM) صورة من العدلات عالية الكثافة. يمثل شريط 1000 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
زيادة الرقم عدد العدلات 2. الدم مع ورم صrogression والعدلات الحصول على النمط الظاهري السامة للخلايا. (A) وقد أحصى عدد العدلات تعميم لكل 1 مل من قبل FACS في أيام مختلفة التالية الورم تلقيح الخلية في BALB / ج الفئران. عدد تعميم CD11b + Ly6G + العدلات يزيد باستمرار مع تطور 4T1 الورم. وكانت (B) 4T1 خلايا سرطان الثدي شارك في تربيتها مع العدلات عالية الكثافة إما من الفئران السذاجة (ورم مجاني) أو 4T1 الفئران الحاملة للورم (الحاملة للورم) الفئران، أو المحتضنة في المتوسط ​​في غياب العدلات (يتبع) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة. العدلات عن الورم الحاملة للفئران، ولكن ليس من الفئران خالية الورم، وتظهر السمية الخلوية هامة نحو 4T1 الخلايا السرطانية. أشرطة الخطأ تمثل ± SEM ** p <0.01 باستخدام اختبار (ت) للطالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3. جمع الدم الفئران عن طريق ثقب في القلب. كان الموت الرحيم الماوس في غرفة الاستقراء تحت بطيئة التدفق CO 2. على الفور بعد أن أخذ نفسا الماوس محطة لها، ووضعها على ظهرها ويتم إدراج 1 مل حقنة heparinized في قاعدة القص حتى تصل إلى القلب. سحب ببطء على المكبس لنضح الدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. العدلات تنقية من الدم الكامل. (A) 3 مل من 1.077 غرام الطبقات / مل السكروز بعناية على رأس 3 مل 1.119 جم / مل السكروز لتشكيل التدرج متقطع. دم الفئران كله، مخففة في برنامج تلفزيوني BSA (0.5٪) إلى الحجم النهائي من 6 مل، ومن ثم الطبقات على رأس 1.077 غ / مل السكروز (B) بعد زيادة ونقصان مدة 30 دقيقة في 700 x ج بلا انقطاع، ويمكن ملاحظة 3 كسور متميزة؛ يتم خلط جزء الوحيدات التي تحتوي على الخلايا وحيدة النواة والعدلات منخفض الكثافة (C) تعادل طازجة الدم البشري مع حجم مساو من ديكستران 500 (- R - خلايا الدم الحمراء في بيليه، G - جزء المحببات تحتوي على العدلات عالية الكثافة، M. 3٪) وحضنت في RT لمدة 30 دقيقة. جزء كبير يحتوي على خلايا الدم البيضاء (معطف الشهباء) ثم يتم الطبقات على رأس 10 مل 1.077 جم / مل السكروز (D) بعد زيادة ونقصان مدة 30 دقيقة في 400 x ج بلا انقطاع، ويمكن ملاحظة 2 الكسور متميزة؛ R + G - بيليه تحتوي على خلايا الدم الحمراء والعدلات عالية الكثافة، M - جزء الوحيدات التي تحتوي على الخلايا وحيدة النواة والعدلات منخفض الكثافة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 5
الرقم 5. قمع T تكاثر الخلايا. التدفق الخلوي التحليلات تبين عدد CFSE المسمى CD8 + الخلايا المستزرعة في غياب التحفيز (A)، وبعد التحفيز مع αCD3 الأجسام المضادة في غياب (B) أو وجود LDN (C) أو HDN (D) (E) عرض الرسم البياني للكثافة CFSE في CD8 + الخلايا من لوحات A - D الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العدلات هي الأكثر وفرة من كل خلايا الدم البيضاء وهي أول المستجيبين في حالات العدوى والالتهابات. على هذا النحو، فهي حساسة للغاية لمنبهات خارجية ويتم تفعيلها بسهولة. بالإضافة إلى ذلك، العدلات لها قصيرة جدا نصف العمر ودوران سريع. معا، وهذه الخصائص تثير عدة صعوبات في العمل مع العدلات، مثل أن يطلب من استراتيجيات تجريبية فريدة من نوعها. على سبيل المثال، هناك العديد من الاستراتيجيات تنقية المتعادلة، ولكل منها إيجابياته وسلبياته.

A خطوة حاسمة في العمل مع العدلات هي تنقية بهم من الدم الكامل. العدلات يمكن تنقيته بكفاءة باستخدام تدرجات الكثافة أو الاستراتيجيات القائمة على الأجسام المضادة (إيجابية أو سلبية الاختيار). لدينا طريقة الاختيار هو استخدام التدرجات كثافة لأنه ينتج أعداد كبيرة من العدلات العالية النقاء مع تفعيل غير محدد الحد الأدنى. لكن، وكما تبين لنا في دراسة حديثة 21، خفة دمح الورم العدلات تقدم تتراكم بأعداد كبيرة في الوحيدات جزء منخفض الكثافة. في ظل هذه الظروف استخدام التدرج الكثافة يوفر نقية للغاية عالية الكثافة العدلات جزء، وهذا لا يمثل كامل تعميم ذخيرة العدلات، والعدلة جزء منخفض الكثافة الذي ملوثة بشدة مع الخلايا وحيدة النواة الأخرى (الخلايا الليمفاوية وحيدات). في ظل هذه الظروف الأسلوب المفضل هو تنقية القائمة على الأجسام المضادة، ويفضل اختيار السلبية. استخدام الأجسام المضادة لتنقية العدلات غلة العدلات نقية للغاية وأفضل يمثل كامل تعميم العدلات ذخيرة. ومع ذلك، لاحظنا أنه كلما العدلات يتم تحضين مع الأجسام المضادة، فإن فرص زيادة التنشيط غير محددة. لذا نقترح حصول على أفضل النتائج، يجب أن يتم تنفيذ تنقية العدلات على الأضداد في أسرع وقت ممكن. تنقية العدلات على الأضداد هي أيضا طريقة الاختيار عندما بوrifying العدلة من الأنسجة أو الأورام.

بغض النظر عن الإجراء تنقية المختار، ونقاء، والسلامة والنزاهة الوظيفية يجب أن يتم تقييم صارم. نقاء العدلات يمكن تحديده من خلال التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة التي تتفاعل مع علامات سطح العدلة. في الماوس، لي-6G غير محدد لالعدلات، والتي تتميز CD11b + أدنى لي-6C لي-6G + F4 / 80 - النمط الظاهري. العدلات الإنسان لا تعبر عن علامة مماثلة للي-6G وغالبا ما يتميز التعبير عن CD11b، CD15، CD16، وCD66b. منذ العدلات لديها مستقبلات التيسير، هذه تحتاج إلى يكون قد تم حظره من قبل المناعية. ويمكن أيضا العدلات يمكن تمييزها عن غيرها من خلايا الدم البيضاء من خلال وجود SSC العالي. وينبغي أن تحدد الجدوى في نهاية عملية التنقية (التريبان الأزرق، بروتوكول 2.1)، وينبغي أن تكون أكبر على الدوام من 98٪. وينبغي أن تحدد النزاهة الوظيفية التي كتبها بوريfication العدلات من الفئران ساذجة. لم يتم تفعيل هذه العدلات وتوفير الرقابة غير السامة للخلايا لالعدلات-مجرور ورم في إعداد شارك في الثقافة مع الخلايا السرطانية (بروتوكول 7).

وقصيرة العمر النصفي للالعدلات الدم جنبا إلى جنب مع انخفاض عدد العدلات (~ 3-5 × 10 5) تحققت من 1 ملليتر دم من السذاجة 6-8 الاسبوع الماوس القديم، جعلت من الصعب على استكشاف وظيفة العدلات الماوس الدم في المختبر. زيادة عدد العدلات بشكل مطرد في حالات الالتهاب وأحيانا في مرض السرطان، وهو ما يمثل حالة من التهاب مزمن 7. وقد حاول بعض الباحثين إلى إيجاد مصادر بديلة للالعدلات، مثل نخاع العظام 20. ويمكن الحصول على عدد كبير من العدلات الماوس ضمن 4-24 ساعة بعد الحقن داخل الصفاق من 1 مل من 3٪ حل مرق thioglycollate أو 1 مل من 1 ملغ / مل زيموزان حل في المياه المالحة. ولكن هذه العدلات أثارت لا تمارسنيويورك النشاط المضادة للمكون للأورام (المراقبة غير منشورة).

. غرانوت آخرون 6 وحظ أن الفئران BALB / ج تلقيح orthotopically مع سرطان الثدي الماوس 4T1 تطوير العدلات الذي يفاقم على الوقت (الشكل 2A)، بحيث 20-40000000 العدلات الدم يمكن عزلها من 1 ملليتر دم 3-4 أسابيع بعد الورم التلقيح. وقد اكتسبت هذه العدلات الأنشطة المضادة للورم، وبناء على ذلك فقد وصفته العدلات-مجرور الورم (TEN)، وذلك لتمييزها عن العدلات ساذجة (الشكل 2B). في حين العدلات عالية الكثافة (HDN) هي غاية المضادة للمكون للأورام، العدلات منخفض الكثافة (LDN) ولدت في سياق السرطان ليست 21. يكون العدلات عالية الكثافة من نخاع العظم والطحال من الفئران الحاملة للورم أيضا النشاط المضادة للورم (بيانات غير منشورة). وتجدر الإشارة إلى أنه مع تطور الورم يصبح الطحال تدريجيا (تضخم الطحال)، مع فيالتجعيد كميات من العدلات.

من أجل تتبع مصير العدلات التالية نقلهم بالتبني، هذه تحتاج إلى أن يكون المسمى. العدلات يمكن أن توصف في الجسم الحي عن طريق حقن bromodeoxyuridine (BrdU) إلى الورم الحاملة أو الفئران السذاجة 2 قبل أيام من العزلة. BrdU هو التناظرية من السلائف الثيميدين DNA التي يتم تضمينها في الحمض النووي توليفها حديثا في الخلايا المتكاثرة. في حالة العدلات، وسيتم دمج BrdU في الخلايا المتكاثرة السلائف التي تحتفظ BrdU تلطيخ عندما التفريق في العدلات بعد الإنقسامية ناضجة. يمكن ملطخة BrdU إدراجها باستخدام الأجسام المضادة الفلورسنت مكافحة BrdU محددة. ويمكن بعد ذلك الخلايا BrdU + يتم تحليلها من قبل التدفق الخلوي. نهج آخر هو لتسمية العدلات المعزولة مع صبغة تعقب الخلية مثل 5-carboxyfluorescein N-succinimidyl استر (CFSE). CFSE هو مركب استر التي يمكن أن تمر من خلال أغشية الخلايا قابلة للحياة. أنه يحتوي على succinimid الأمينية رد الفعلمجموعة يل الأمر الذي يؤدي إلى التساهمية ملزم من فلوريسئين للبروتينات والمجموعات الأمينية الأخرى في الخلية وسطح الخلية. الخلايا المسمى CFSE يمكن تحليلها عن طريق التدفق الخلوي باستخدام 488 نانومتر الأرجون ليزر. تقنيات وضع العلامات اثنين تختلف في حقيقة أن وضع العلامات BrdU يعتمد على الخلايا المتكاثرة السلائف، وليس كل العدلات تعميم سيتم المسمى، في حين سوف CFSE وصمة عار كل العدلات. الكشف عن CFSE هو أكثر وضوحا من BrdU تلطيخ، ولكن وضع العلامات BrdU هو وسيلة جيدة لمتابعة غير ناضجة لتنضج تحويل العدلة.

وصفناها أيضا عدة طرق لتحديد المضادة للورم ومكافحة المنتشر وظيفة من العدلات. وتشمل هذه نضوب العدلة، العدلات نقل بالتبني، ورم اختبار تحييد والانبثاث الرئة بذر الفحص. كل من هذه المقايسات يحقق جانبا محددا من الوظائف العدلات المضادة للورم. على سبيل المثال، لاحظ غرانوت آخرون 6 أنه عند إقلاعletion العدلات، وارتفع عدد الانبثاث الرئة في 4T1 الفئران الحاملة للورم، مما يشير لدور مكافحة المنتشر العدلات. على العدلات نقل بالتبني، يتم حقن الخلايا السرطانية عن طريق الوريد 4 ساعة قبل حقن المنقى HDN. يتم اتباع قدرة الخلايا السرطانية على تشكيل الرئة والكبد الانبثاث في دراسة وقتا بالطبع تستخدم في الجسم الحي نظام التصوير الضوئي. وأظهرت الفئران تلقي HDN عدد أقل من بؤر النقيلي من فعل السيطرة على الفئران 6. في اختبار تحييد الورم، يتم حقن الخلايا السرطانية تحت الجلد مع أو بدون HDN، وجود HDN يقلل من نمو الورم 21. في بذر فحص النقيلي، يتم حقن الخلايا السرطانية المسمى GFP عن طريق الوريد إلى سيطرة أو قبل المتنقل الفئران الحاملة للورم المنضب العدلة، ويتم تحديد قدرة الخلايا المسمى GFP البذور في الرئة. وتتميز رئات الفئران الحاملة للورم قبل المتنقل تسلل العدلة مرتفع يمنع الورمبذر خلية في جهاز معين 6. هذا يترجم إلى المزيد من البؤر المنتشر في الفئران المنضب العدلات مقارنة مع السيطرة الفئران الحاملة للورم.

البروتوكولات وصفت التركيز على دراسة وظيفة العدلات في سياق السرطان وتقديم استراتيجيات لتقييم المرتبطة بالسرطان خصائص العدلات على حد سواء في التجارب المختبرية والحية. ومع ذلك، فإن استراتيجيات تنقية العدلة وكذلك بعض الإجراءات التجريبية وصفه يمكن استخدامها لدراسة وظيفة العدلات في مجموعة واسعة من إعدادات التجريبية حيث العدلات تلعب دورا حاسما (أي التهاب وعدوى).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ويدعم ZG من المنح المقدمة من برنامج I-CORE من مؤسسة العلوم إسرائيل (منحة رقم 41/11)، ومؤسسة Abisch-فرنكل، والثقة Rosetrees، ومؤسسة أبحاث السرطان إسرائيل (ICRF - جائزة التطوير المهني للبحوث) و قلق المؤسسة. ويدعم ZGF من المنح المقدمة من مؤسسة إسرائيل لأبحاث السرطان (ICRF - جائزة التطوير المهني للبحوث)، كبير العلماء في وزارة الصحة الإسرائيلية وجمعية الرئة إسرائيل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).

Tags

علم المناعة، العدد 100، العدلات العزلة، العدلات-مجرور الورم، العدلات عالية الكثافة، والعدلات منخفض الكثافة، سمية الخلايا المضادة للورم، ووضع العلامات BrdU، ووضع العلامات CFSE، luciferase المراسل فحص، واستنزاف العدلات، والنشاط المضادة للالنقيلي، النقيلي الرئة بذر الفحص، العدلات نقل بالتبني.
عزل وتوصيف العدلات مع خصائص مضادة للورم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sionov, R. V., Assi, S.,… More

Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., Fridlender, Z. G., Granot, Z. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter