Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering og karakterisering av nøytrofiler med anti-tumor egenskaper

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

Abstract

Nøytrofiler, den mest vanlige av alle hvite blodlegemer i den humane sirkulasjon, spiller en viktig rolle i vertens forsvar mot invaderende mikroorganismer. I tillegg nøytrofile spille en sentral rolle i immun overvåking av kreftceller. De har evnen til å gjenkjenne tumorceller, og indusere tumorcelledød enten gjennom en celle-kontakt-avhengig mekanisme som omfatter hydrogenperoksyd eller via antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC). Nøytrofile celler med anti-tumoraktivitet kan bli isolert fra perifert blod fra kreftpasienter og i tumorbærende mus. Disse nøytrofile kalles tumor innblandet nøytrofile (TEN) for å skille dem fra nøytrofile av friske personer eller naive mus som viser ingen signifikant tumor cytotoksisk aktivitet. Sammenlignet med andre hvite blodceller, nøytrofile viser forskjellig oppdrift som gjør det mulig å oppnå en> 98% ren nøytrofile populasjonen når den utsettes for en densitetsgradient. Men i tilleggtil normal høy tetthet nøytrofil populasjon (HDN), hos kreftpasienter, i tumorbærende mus, såvel som under kroniske inflammatoriske tilstander, forskjellige low-density nøytrofile populasjoner (LDN) vises i sirkulasjon. LDN co-renser med mononukleære fraksjon og kan bli separert fra mononukleære celler ved bruk av enten positiv eller negativ seleksjons strategier. Når renhet av de isolerte nøytrofiler bestemmes ved strømningscytometri, kan de brukes for in vitro og in vivo funksjonelle analyser. Vi beskriver teknikker for overvåkning av anti-tumor aktiviteten til neutrofiler, deres evne til å overføre og å produsere reaktive oksygenforbindelser, samt overvåkning av deres fagocytisk kapasitet ex vivo. Vi beskriver ytterligere teknikker for å merke de nøytrofile celler for in vivo sporing, og for å bestemme deres anti-metastatiske kapasitet in vivo. Alle disse teknikkene er avgjørende for å forstå hvordan de skal få tak i og karakterisere nøytrofile med anti-tumorfunksjon.

Introduction

Nøytrofile ble først karakterisert som det medfødte immunceller som fungerer som førstelinjeforsvar mot invaderende mikroorganismer. I dag er det kjent at nøytrofile har mer vidtrekkende funksjoner, være involvert i montering adaptive immunresponser mot fremmede antigener 1,2, regulerer hematopoiesen 3, angiogenese 4 og sårtilheling 5. I tillegg kan neutrofiler påvirke tumorvekst og metastatisk progresjon i kraft av deres pro- og anti-tumoraktiviteter 6,7. Neutrofiler er kjennetegnet ved et polymorft segmenterte kjerne (derfor betegnet polymorfonukleære (PMN) leukocytter) og inneholder minst tre distinkte undergrupper av granulater så vel som sekretoriske vesikler 8 (figur 1 A-C).

Neutrofiler ha høy fagocytisk kapasitet og høy NADPH oksidase aktivitet kritisk for mikrobiell eliminering, og utskiller en rekke kjemokiner viktige for attrekkraft ekstra nøytrofile og andre immunceller til området av betennelse 8,9. Neutrofiler er kjennetegnet ved ekspresjon av en stor mengde av overflatereseptorer inkludert Toll-lignende reseptorer (TLR), C-type lektin reseptorer (CLRs), komplement-reseptor-3 (CD11b / CD18), og andre adhesjonsmolekyler (for eksempel L-selectin, LFA-1, VLA-4 og carcinoembryonic antigen-relaterte celleadhesjonsmolekyl 3 (CEACAM3 / CD66b)), kjemokin reseptorer (f.eks, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kjemotiltrekkende reseptorer (f.eks PAFR, LTB 4 R og C5aR) , cytokinreseptorer (f.eks G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptid reseptorer (f.eks FPR1-3), og Fc reseptorer (f.eks CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII) og CD64 (FcγRI) 10. Hos mus er nøytrofile vanligvis identifisert som CD11b + Ly6G +, mens menneske nøytrofile er identifisert ved hjelp av CD11b, CD15, CD16 og CD66b leukocytter markører. Det er også generelt akseptert å farge for granule proteiner myeloperoksidase (MPO) og nøytrofil elastase (NE) for påvisning av nøytrofile celler i vev.

Det er uklart hvorvidt de forskjellige funksjoner av nøytrofiler blir mediert av den samme celle, eller fra forskjellige celleunderpopulasjoner. Akkumulerende data tyder på nærvær av en heterogen nøytrofile populasjon som oppviser en høy grad av plastisitet påvirkes av pro-inflammatoriske stimuli og mikromiljøet 11,12. Fridlender et al. 13 har grovt delt neutrofilene i kreft i to store underpopulasjoner kalt N1 med anti-tumor egenskaper og N2 med pro-tumor egenskaper. I kreft, så vel som i kronisk inflammasjon, er det en ytterligere undergruppe bestående av granulocytiske myeloide-avledede suppressor-celler (G-MDSCs) som undertrykker T-cellere 14. G-MDSCs anses å være umodne myeloide celler kjennetegnet ved en CD11b + Ly6Clav Ly6G hi fenotype hos mus 15, samtidig som de har et CD15 + / CD16 lav fenotype i menneskelig 16. G-MDSCs uttrykke høyere nivåer av arginase og myeloperoxidase, mens lavere nivåer av cytokiner og kjemokiner enn vanlige sirkulerende nøytrofile. De er mindre phagocytic og trekkfugl, men produserer høyere nivåer av ROS 15,17,18. I det foreliggende papir vil vi beskrive noen grunnleggende metoder for isolering og karakterisering av neutrofiler med anti-tumor-egenskaper.

Mens nøytrofile utgjør den største bestanden av alle hvite blodceller i menneske sirkulasjon (45 - 70%, 1800 - 6000 / mikroliter), i mus, under normale forhold, de er ganske sparsom (10 - 15%, 300-500 / ul ). Nøytrofilantallet øker jevnt ved betennelse og tidvis i kreft, noe som representerer en tilstand av kronisk betennelse 7. Nøytrofile utvikle seg fra multipotent felles myeloid forløper (CMP) cells i benmargen, gjennom en differensiering prosess passerer stadier av myeloblasts (MB), promyelocytter (PM), myelocytter (MC), metamyelocytter (MM) og band celler (BC) 8. De modne, post-mitotiske nøytrofile kan forbli i benmarg for 4-7 dager før de blir frigitt til sirkulasjon 8. Neutrofil omsetningen i blodet er vanligvis hurtig med en gjennomsnittlig halveringstid på 6-12 timer, noe som kan forlenges i henhold til inflammatoriske tilstander. Unstimulated nøytrofile har begrenset anti-tumorigent aktivitet, en funksjon som kan skaffes ved å utsette naive nøytrofile til chemokiner IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 og CXCL5 6,19 eller kunstig, ved å utsette dem til forbolester phorbol 12 -myristate 13-acetat (PMA) 6.

Den korte halveringstid for blodneutrofiler sammen med det lave antallet nøytrofiler (~ 3-5 x 10 5) oppnådd fra 1 ml blod fra et naivt 6 - 8 uker gamle mus, har gjort detvanskelig å utforske funksjonen av sirkulerende mus nøytrofile celler in vitro. For å overvinne denne vanskelighet, har andre kilder blitt brukt. For eksempel kan et stort antall neutrofiler fås fra benmargen 20 eller peritoneum etter induksjon av steril inflammasjon (for eksempel etter intraperitoneal injeksjon av thioglycollate kjøttkraft eller Zymosan A). Det bør bemerkes at neutrofiler oppnådd fra bukhulen ikke utøve noen anti-tumorigen aktivitet (upublisert observasjon).

. Granot et al 6 observert at BALB / c mus inokulert orthotopically med mus 4T1 bryst carcinoma cellelinje utvikle neutrofili som forverrer med tumorprogresjon 6 (figur 2A), slik at 20-40 millioner blodneutrofiler kan lett isoleres fra 1 ml blod 3-4 uker etter tumorinokulasjon. Disse nøytrofile har kjøpt anti-tumor aktivitet, og har derfor vært coiNed tumor innblandet nøytrofile (TEN), for å skille dem fra naive nøytrofile 6 (figur 2B). Mens høy tetthet neutrofiler (HDN, Figur 1A) er sterkt anti-tumorigen, lav tetthet neutrofiler (LDN, figur 1B) som genereres i sammenheng med kreft har ikke 21. Også høy tetthet nøytrofiler fra benmargen og milt av tumorbærende mus har anti-tumoraktivitet (upubliserte data). Det bør bemerkes at med tumorprogresjon milten blir gradvis forstørret (splenomegali), med økende mengder av nøytrofiler.

Det bør bemerkes at ti er også generert på andre modeller av kreft inkludert både spontane (MMTV-PyMT og MMTV-Wnt1 mammatumorer og K-Ras drevet lungesvulster) og injisert (AT-3 (MMTV-PyMT) og E0771 brystkreft celler, LLC Lewis lunge carcinoma celler og B16-F10 melanomceller). Imidlertid er omfanget av nøytrofil mobilisering i disse tumeller modeller er langt mindre enn for 4T1-mus inokulert, og nådde 5 - 10 x 10 6 nøytrofiler i 1 ml blod etter 3 uker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr: 5-7 uker gamle BALB / c-mus ble innkjøpt fra Harlan (Israel). Alle forsøk med dyr ble godkjent av Det hebraiske universitetet institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC). Humane prøver: Innsamling av blod fra kreftpasienter og friske frivillige ble godkjent av Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Induksjon av Nøytrofiler med Anti-svulst Properties in vivo Bruke en Breast Cancer Mouse Model.

MERK: Alle trinn skal utføres ved hjelp av sterile løsninger i en laminær luftstrøm (LAF) Bio-Sikkerhetsskap.

  1. Seed 5 x 10 5 4T1 celler i 100 mm vevskulturskål i 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) inneholdende 4,5 g / L D-glukose supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 2 mM D- glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U / ml penicillin G og 100 ug / ml streptomycin sulfat. Inkuber the celler ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO2 i 3 til 4 dager. Sørge for at cellene er 50-100% konfluent på dagen for eksperimentet.
  2. For å løsne tumorcellene fra vevskulturplate, Aspirer kulturmediet, vaskes cellene med 5 ml PBS, Aspirer PBS og tilsett 3 ml av en 2,5 g / l trypsin-løsning. Inkuber cellene 2 - 3 minutter med trypsin ved 37 ° C.
  3. Tilsett 10 ml serumholdig medium for å nøytralisere trypsin og pipetten opp og ned inntil alle cellene er blitt løsnet. Overfør cellene suspensjonen i et 15 ml konisk sentrifugerør.
  4. Sentrifuger cellene ved 200 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer medium forlater 200 ul medium over celle pellet. Suspender cellene i restvolum og tilsett 10 ml PBS. Snu røret 2 - 3 ganger for å få en homogen cellesuspensjon og ta ut 10 pl for å telle cellene i et hemocytometer. Bruk trypanblått å skille mellom levende og døde celler. Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 200 x g ved romtemperatur. Aspirer PBS og resuspender cellene i PBS til en sluttkonsentrasjon på 2 x 10 6 celler / ml. Sørg for at enkeltcellesuspensjonen har ingen klumper.
  5. Injiser 1 x 10 6 4T1 celler eller luciferase-uttrykkende 4T1-celler i 50 pl PBS orthotopically inn i venstre inguinale melkefettpute av BALB / c-mus ved bruk av en 0,3 ml sprøyte med en 30G x 8 mm nål.
    1. Før injeksjon bedøve mus i en induksjonsskammer som mottar en langsom strømningshastighet på isofluran (3 - 5%) i 100% oksygen.
    2. Lå musen på en steril kirurgisk pad og sørge for at hodet er riktig plassert på innsiden av isofluran nesen membran. Bekreft riktig anestesi ved å klemme labben. Bruk veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi. Barbere håret rundt injeksjonsstedet og desinfiser med 70% EtOH.
    3. Bruk en steril sett av kirurgiske verktøy for å gjøre en liten horisontal snitt (5 mm) ca.imately halvveis mellom lyske og mage nipples, utsett fett puten og injisere 1 x 10 6 4T1 celler i 50 pl. Lukke snittene med 9 mm klipp som bør fjernes en uke senere. Injeksjon av luciferase-uttrykke celler tillater overvåking av tumorstørrelse og metastase ved bioluminescens bildebehandling.
      MERK: Denne minimalt inngrep krever ingen post-kirurgisk behandling og de injiserte mus gjenopprette innen 2 - 3 min.
    4. Overvåke mus før de gjenvinne bevissthet, og sørge for at de gjenvinne full bevissthet før han begynte i selskap med andre mus.
  6. Etter 3-4 uker, når den primære tumoren har nådd et volum på 2 cm 3, offer musene ved en langsom CO 2-strømmen, og umiddelbart etter den siste åndedrag, få blod ved hjertepunktur ved anvendelse av en 25G x 5/8 "nål er koblet til en 1 ml tuberkulinsprøyte forbehandlet med heparin. Hold munningen av nålen oppover ved innføring avsprøyten i en horisontal stilling gjennom membranen mot hjertet, og sakte og gradvis trekke blod unngå overtrykk (figur 3).

2. Neutrofil Isolation

  1. Isolering av cytotoksiske nøytrofiler fra blod av tumorbærende mus.
    1. Fortynn 1 ml blod trekkes fra en tumorbærende mus (se Protocol 1,11) i PBS inneholdende 0,5% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) til et endelig volum på 6 ml.
    2. Fraksjonering av fortynnet blod på en nylaget usammenhengende sukrosegradient:
      1. Tilsett 3 ml med sterilfiltrert sukrose 1,119 g / ml til bunnen av en 15 ml konisk sentrifugerør av polypropylen.
      2. Langsomt og forsiktig, 3 lag ml sterilfiltrert sukrose 1,077 g / ml på toppen av 1,119 g / ml lag. Deretter legger sakte og forsiktig de 6 ml fortynnet blod (Protocol 2.1.1) på toppen av 1,077 g / ml lag (Figur 4A). Det anbefales å holde røret på skrå og endding de forskjellige komponentene ved en langsom, men kontinuerlig strøm, holde munningen av pipetten mot den nedre vegg av røret, slik at det ikke dannes turbulens.
    3. Sentrifuger røret som inneholder det fortynnede blod på sukrose-gradient ved 700 xg i 30 minutter ved romtemperatur uten brems.
    4. Fjern forsiktig røret fra sentrifugen uten å forårsake noen turbulens. Mesteparten av erytrocyttene vil være ved bunnen av røret. Høy tetthet nøytrofiler (HDN) er funnet som et hvitt-til-rød ring ved grenseflaten mellom 1,119 g / ml og 1,077 g / ml lagene (rundt 3 ml-merket), mens lav tetthet er funnet i leukocytter en hvit ring på grenseflaten mellom 1.077g / ml laget og BSA-inneholdende PBS (rundt 6 ml-merket, se figur 4B).
    5. Aspirer PBS + 0,5% BSA til n 5 mm over lav tetthet cellelaget. Pipetter ut low-density-celler ved langsom sug inn i en 1 ml spiss gjennom langsomt virvler rundt cellene.Overfør cellene i 30 ml PBS med 0,5% BSA.
    6. Aspirer øvre lag i den samme gradienten røret til n 5 mm over høy tetthet cellebånd. Pipetter ut høy tetthet celler, som er for det meste høy tetthet nøytrofiler, og overføre cellene i 30 ml PBS inneholdende 0,5% BSA.
    7. Sentrifuger cellene ved 400 xg i 10 min ved RT.
    8. Aspirere supernatanten og lyse erytrocytter ved resuspendering av cellene i 36 ml sterilt HPLC kvalitet vann i 30 sek. Isotonisitet skal gjenopprettes ved tilsetning av 9 ml av en 5 ganger konsentrert PBS supplert med 2,5% (w / v) BSA.
    9. Sentrifuger cellene ved 400 xg i 10 min ved RT.
    10. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i PBS-BSA. Telle antall nøytrofile i en hemocytometer og bruke trypanblått å skille mellom levende og døde celler.
    11. Sentrifuger cellene ved 400 xg i 10 min ved RT og resuspender neutrofiler i ønsket inkubasjonsmediet til endelig celletetthet. Brukneutrofilene umiddelbart.
    12. Deretter, etter en ny sentrifugering, resuspender neutrofiler i inkubasjonsmediet til endelig celletetthet. Bruk nøytrofile umiddelbart.
  2. Isolering av sirkulerende nøytrofile granulocytter fra kreftpasienter.
    1. Bland 10 ml heparinisert (20 U / ml) humant blod med et like stort volum av 3% Dextran T500 i saltløsning og inkuber i 30 min ved RT. Under denne inkubasjon erytrocytter vil sedimentere.
    2. Tilbered en 50 ml konisk polypropylenrør med 10 ml sukrose 1,077 g / ml og langsomt lag av leukocytt-rike supernatant på toppen av 1,077 g / ml sukrose lag (figur 4C).
    3. Sentrifuger ved 400 xg i 30 minutter ved romtemperatur uten brems. High-density nøytrofile (HDN) vises i pellet. Lav tetthet neutrofiler (LDN) ko-renser med monocytter og lymfocytter i grenseflaten mellom 1,077 g / ml sukrose lag og plasma (figur 4D).
    4. Suspender nøytrofile i 10 ml 0.2% NaCl i 30 sekunder for å lysere de kontaminerende erytrocytter, og gjenopprette isotonisitet ved tilsetning av 10 ml 1,6% NaCl og invertere gang.
    5. Sentrifuger 5 min ved 160 x g ved romtemperatur, og vaskes tre ganger i 20 ml Hanks balanserte saltløsning. Sentrifuger etter hver vask og aspirer supernatanten.
    6. Telle nøytrofile og resuspender cellene i RPMI-1640 supplert med 2% FBS på 2 x 10 6 nøytrofile / ml eller som ønsket.

3. Anriking av blodneutrofiler Bruke Magnet perler

  1. Positiv utvelgelse
    1. Ta 1 ml blod fra en mus, som beskrevet i protokoll 1,8, med en heparinisert sprøyte.
    2. Sentrifuger blodet i et 15 ml konisk rør ved 400 xg i 5 minutter ved RT.
    3. Aspirer supernatanten eller holde blodplasma for videre studier.
    4. Lyse erytrocyttene ved resuspendering av cellene i 8 ml HPLC-grad vann. Etter 30 sek gjenopprette isotonisitet ved å tilsette 2 ml 5x concentrated PBS som inneholder 2,5% BSA. Telle celler.
    5. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved RT.
    6. Resuspender cellepelleten i 200 ul PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA per 10 8 celler.
    7. Tilsett 50 ul biotinylert anti-Ly6G antistoff. Bland godt og inkuber i 10 minutter i kjøleskap (på is).
    8. Tilsett 150 ul kald PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
    9. Vortex anti-biotin belagte magnetiske mikroperle stamløsning. Overfør 100 ul av cellesuspensjonen. Bland godt og inkuber i 15 minutter i kjøleskap (på is).
    10. Vask cellene ved tilsetning av 10 ml PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA, og sentrifuger ved 400 xg i 10 min ved RT.
    11. Aspirer supernatanten fullstendig, og resuspender i 500 ul kald PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
    12. Sett en magnetisk separasjonskolonne til en magnet holder som er festet til en magnetisk stativ, og skylle den med 500 ul kald PBS inneholdende 0.5% BSA og 2 mM EDTA.
    13. Anvende cellesuspensjonen på kolonnen. Gjennomstrømnings inneholder umerkede LyG6-negative celler.
    14. Vask kolonnen med 500 ul PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA. Ytterligere umerkede celler vil være i strømmen gjennom.
    15. Gjenta vasketrinn med en annen 500 ul PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
    16. Fjerne kolonnen fra magneten og plassere den på en 15 ml samling rør. Tilsett 1 ml PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA, og spyle ut de magnetisk merkede celler med fast å skyve stempelet inn i kolonnen. Flyten inneholder gjennom Ly6G + nøytrofile.
  2. Negativ seleksjon
    1. Forbered blodleukocytter henhold til trinn 3.1.1 til 3.1.5.
    2. Resuspender 1 x 10 8 celler i 1 ml PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA i en 5 ml rundbunnet polystyren-rør.
    3. Tilsett 50 mL normal rotte serum.
    4. Tilsett 50 mL av nøytrofile berikelse cocktail (inneholdende biotinylerte antistoffer som er spesifikke for ikke-nøytrofile hvite blodceller), bland godt og inkuberes i 15 minutter i kjøleskap.
    5. Vask cellene ved tilsetning av 4 ml PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA, og sentrifuger 400 xg i 10 min.
    6. Kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
    7. Tilsett 50 pl av tetramer antistoffkomplekser rettet mot biotin og dekstran. Bland godt og inkuber i 10 minutter i kjøleskap.
    8. Vortex vel røret som inneholder dekstran-belagte magnetiske kuler før tilsetning av 150 ul av cellesuspensjonen. Bland godt og inkuber i 10 min kjøleskapet.
    9. Bringe cellesuspensjonen til et totalt volum på 2,5 ml ved tilsetning av PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA. Bland forsiktig for å få en homogen cellesuspensjon.
    10. Før røret (uten lokk) i magneten, og la det stå i 3 min.
    11. Snu magnet med røret i en kontinuerligbevegelse slik at de ikke-bundne celler i fluid vil bli overført til et nytt rør. La magneten og rør invertert for 2 - 3 sekunder, deretter tilbake til oppreist stilling. De magnetisk merkede uønskede celler vil forbli bundet til veggen av det opprinnelige rør, mens de ikke-bundne neutrofiler vil være i den overførte væske.

4. Cytologisk Farging av Neutrofiler

  1. Resuspender 1x10 5 neutrofiler i 50 ul PBS og overfør til cellesuspensjonen til en tynn-lags cellepreparat adapter så som en Cytospin. Sentrifuger adapter ved 150 xg i 5 min. Separer pre-merkede glass lysbilde fra adapteren.
  2. Fix-celler ved å dyppe objektglass i 70% etanol i 2 min. Tillat forberedelsene fra adapteren (se trinn 4.1) for å tørke ved romtemperatur før farging. Dypp lysbilder 5-6 ganger i destillert vann.
  3. Flekk 1 - 2 min i Mayers Hematoxylin løsning. Skyll 1 min i vann fra springen. Flekk 10 sek i Eosin Y løsning . Vask i Vann fra springen. Dehydrere ved å skylle skinnene i økende etanolkonsentrasjon (70%, 96% og 100%). La glass lufttørke kort tid og inspisere lysbildene under et lysmikroskop.
    MERK: Hematoxylin har en dyp blå-lilla farge og flekker nukleinsyrer, mens eosin er rosa og farger proteiner uspesifikt. De cytoplasmatiske granulater av nøytrofile forbli unstained av sure eller basiske fargestoffer, som er opphavet til navnet "kjærlig å være nøytral". Mens basophilic granulocytter flekken mørk blå med hematoxylin og eosin og eosinophilc granulocytter lyse rødt, vises nøytrofile nøytral rosa (Se figur 1A). Modne nøytrofile er preget av en polymorfonukleære kjerne, som er generelt stort med 2-5 fliker 'segmenterte nøytrofile' (Figur 1A og 1C). Umodne neutrofile er kjennetegnet ved en en fliker buet eller ringformet kjerne (figur 1B).
ve_title "> 5. Fastsettelse av Purity av Nøytrofiler ved flowcytometri.

  1. Suspender 1x10 6 celler i 100 ul FACS-buffer (PBS inneholdende 0,5% BSA, 2 mM EDTA og 0,02% NaN3). For fullblodprøver, er hemolyse nødvendig før farging (trinn 3.1.1 til 3.1.5). Tilsett 10 pl av FcR Blokkering Reagens for 5 min.
  2. Tilsett 0,5 ug av fluorescens-merket antistoff med en spesifisitet for Ly-6G for mus nøytrofiler eller til CD11b og CD66b for humane neutrofiler, bland godt og inkuber i 15 min ved RT.
  3. Juster volumet til 500 pl med PBS inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA og analysere farging ved flowcytometri.

6. Følg Neutrofil Gate in vivo

  1. In vivo BrdU merking av nøytrofile
    1. Injisere 100 ul av en 10 mg / ml bromdeoksyuridin (BrdU) oppløsning i steril PBS intraperitonealt til tumorbærende mus.
    2. Isoler blodneutrofiler 48 timer etter injeksjonen enccording til protokoll 2.1. Stain BrdU-merket nøytrofile ved hjelp av en BrdU flyt kit.
  2. CFSE merking av nøytrofile
    1. Resuspender 10 7 nøytrofiler i 1 ml forvarmet PBS.
    2. Tilsett 2 ul av en 5 mM stamløsning CFSE til de suspenderte nøytrofiler til en sluttkonsentrasjon på 10 uM. Bland godt og inkuber i 15 min ved 37 ° C. 5 mM CFSE fremstilles ved å oppløse 2,8 mg av CFSE (5- (og 6 -) - karboksyfluorescein-diacetat, succinimidylester) i 1 ml DMSO. Dele inn i 10 ul porsjoner i sterile 200 mL rør og oppbevares mørkt ved -20 ° C.
    3. Nøytralisere overskudd CFSE ved tilsetning av et likt volum av RPMI-1640 som inneholdt 10% FBS. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C. Sentrifuger neutrofiler ved 400 xg i 10 min ved RT. Vask neutrofiler to ganger i 10 ml RPMI-1640 inneholdende 10% FBS.
    4. Sentrifuger ved 400 xg i 10 min og resuspendert i et egnet volum av PBS. De nøytrofile (f.eks 1 x 10 7

7. In vitro Luciferase analysen å overvåke Anti-tumor aktivitet av Isolert Neutrofiler.

  1. Dyrke luciferase-merket tumorceller som beskrevet for 4T1 celler i protokoll 01.01 til 01.05, men resuspender trypsinlignende dissosiert celler i optimalisert redusert serum medium supplert med 2% FBS. Juster celletetthet på 5 x 10 4 celler pr ml.
  2. Seed 5000 luciferase-merkede tumorceller i 100 pl optimalisert redusert serummedium inneholdende 0,5% FBS i hver brønn av en 96 hvit-flat-bottom vev-kultur brønns plate.
  3. 4 timer etter såing tumorceller, tilsett 1 x 10 5 nøytrofile i 50 ul optimalisert redusert serum medium som inneholder 0,5% FBS, og inkuber O / N. Forbered en nøytrofile cellesuspensjon med en tetthet på 2 x 10 6 celler / ml. Kontrollbrønner bør få 50 mL medium uten nøytrofile. Gjøreflere ganger i hvert eksperimentell setting.
  4. På neste morgen, forsiktig aspirer supernatanten og vask hver brønn med 200 mL PBS. Aspirer PBS og tilsett 50 mL av passiv lysis buffer. For lett å demontere celler (som AT-3-celler), ikke vaske i PBS og tilsett cellekultur lysisbuffer umiddelbart etter aspirere vekstmediet.
  5. Dekk plate med aluminiumsfolie og inkuberes den på en orbital-rystemaskin ved 150 rpm i 20 min ved RT.
  6. Sett platen i en luminescens plateleser. Injiser godt messig 50 pl analyseoppløsning luciferase, og lese kjemiluminescens i 10 sekunder per brønn.
  7. Beregn% tumorlyse ved følgende formel:% tumorlyse = (1- [luminescens av prøver med nøytrofiler] / [luminescens av prøvene i medium]) x 100%.

MERK: For å vurdere bidraget av nøytrofile metastatisk seeding, kan nøytrofile bli tømt som beskrevet i protokollen 8.1. For effektiv depletion administrere nøytrofile nedbrytende antistoffer start på dag 7 etter svulst engraftment.

8. Anti-metastatisk aktivitet av nøytrofile i en Breast Cancer Mouse Model.

  1. In vivo uttømming av nøytrofile.
    1. Tilbereder 12.5 ug rotte-anti-Ly6G antistoff (nøytrofile reduserende antistoff) eller fra rotte-isotype kontroll-antistoff (IgG-2a, Κ) i saltvann ved et sluttvolum på 100 ul pr mus.
    2. Med start på dag 3 etter tumor innpoding injisere en daglig intraperitoneal dose på 12,5 ug rotte-anti-Ly6G antistoff (100 ul). Injiser kontrollmus med eller 12,5 pg (100 ul) rotte isotype kontroll-antistoff (IgG-2a, Κ).
    3. Med start på dag 14, administrere antistoffer to ganger daglig, som nøytrofile produksjonshastigheten øker dramatisk når den 4T1 svulsten vokser.
    4. Annenhver dag, få en blodprøve (2-3 dråper) av nicking lateral halevenen. Samle opp blodet inn i en anti-coagulant inneholder tube (Heparin, Citrate eller EDTA).
    5. Kontroller nøytrofile utarming ved hjelp av flowcytometri som beskrevet i protokoll 5.
  2. Tumor Nøytralisering Test (Modifisert Winn analyse)
    1. Isolere nøytrofile fra tumor-bærende mus. Bland 1 x 10 6 tumorceller og 3 x 10 6 nøytrofile i 50 mL saltvann (per mus).
    2. Injiser celler subkutant i flanken av 6 - 8 uker gamle naive BALB / c-mus. Barbere flanke før svulsten engraftment å tillate nøyaktige målinger av tumorstørrelse. Mål tumorstørrelse daglig start på dag 5 etter engraftment.
  3. Neutrofil adoptiv overføring
    1. Injiser 2 x 10 4 luciferase-uttrykkende tumorceller i 200 ul PBS i halevenen.
    2. Neutrofil overføring bør utføres fire timer etter tumorcelle-injeksjon. Derfor starter rensing av HDN fra tumor-bærende mus (protokoll 2.1) ca 2 timer før deres planlagte ivivo overføring. Resuspender neutrofiler i PBS til en sluttkonsentrasjon på 2,5 x 10 7 celler / ml.
    3. 4 timer etter innføring av tumorcellene plassere musene under en varmelampe i 5 minutter. Plasser musene i en rainer og injisere 5 x 10 6 HDN (200 ul) via halevenen. Kontrollmus ble injisert med bærer (PBS).
    4. Overvåke dannelsen av lungemetastaser på ulike tidspunkter ved hjelp av en bioluminescens in vivo imaging system eller ved immunhistokjemi.
  4. Lungemetastatisk seeding assay
    1. Injisere 0,5 til 1 x 10 6 foreldre 4T1 celler orthotopically inn i venstre lyskemelkefettpute som beskrevet i protokoll 1.
    2. På dag 10, resuspender GFP-uttrykkende 4T1 celler i PBS til en sluttkonsentrasjon på 5 x 10 5 celle / ml. Plassere musene under en varmelampe i 5 minutter.
    3. Plasser mus i en rainer og injisere 1x10 5 GFP-uttrykke 4T1 celler (200 mikroliter) intravenøst ​​til 4TEn tumorbærende mus eller naive mus.
    4. På den påfølgende dagen, avlive mus og perfuse lungene med 20 ml PBS for å fjerne gjenværende RBC.
    5. Eksisere lungene for analyse av GFP-positive celler ved immunhistokjemi.
      MERK: For å vurdere bidraget av nøytrofile metastatisk seeding, kan nøytrofile bli tømt som beskrevet i protokollen 8.1. For effektiv uttømming administrere nøytrofile nedbrytende antistoffer start på dag 7 etter svulst engraftment.

9. Undertrykkelse av T-celledeling ved Nøytrofiler fra Tumor-bærende mus.

  1. Fjern milten fra en avlives naiv BALB / c mus og plasser i 10 ml PBS.
  2. Plasser milten på en 40 mikrometer celle sil som er passe på en petriskål fylt med RPMI-1640. Ved hjelp av stempelet enden av sprøyten, mos milten gjennom cellene silen inn i petriskål. Skyll celle sil med 5 ml RPMI. Kast sil.
  3. Overfør de resuspenderte celler i et 50 ml konisk rør og sentrifuger 400 xg i 10 min.
  4. Kast supernatanten og lysere erytrocyttene ved å suspendere celler i 36 ml av rent vann i 20 sekunder, og for å justere isotonisiteten ved tilsetning av 4 ml PBS konsentrert x 10. Alternativt, lysere erytrocytter ved å suspendere cellene i 5 ml erytrocytt lyseringsbuffer (ACK), og inkuber i 5 minutter ved RT. Nøytralisere ACK ved tilsetning av 10 ml RPMI-1640 medium. Sentrifuger ved 400 xg i 10 min ved RT. Resuspender cellene i 5 ml PBS og tell cellene.
  5. Resuspender splenocytter i PBS til en endelig tetthet på 4 x 10 7 celler / 2 ml i 15 ml-rør. Tilsett 2 ml av en 2,5 pM CFSE oppløsning i PBS. Raskt snu røret og inkuber i 10 min ved 37 ° C med leilighetsvis blanding (hvert 2 min), beskyttet mot lys.
  6. Slukke skytende CFSE ved tilsetning av 4 ml forvarmet FBS (100%) og inkuberes i 1 min ved RT. Tilsett 3 ml PBS og sentrifuger ved 400 xg for 10min.
  7. Vask cellene med 30 ml PBS, og sentrifuger ved 400 xg i 10 min.
  8. Filtrer cellene gjennom et 40 um celle sil og vask en gang med PBS.
  9. Resuspender cellene i RPMI-1640 medium supplert med 10% FBS til en endelig tetthet på 2 x 10 7 celler / ml.
  10. Seed 2 x 10 6 / brønn (200 ul) i en 24-brønn vev-kulturplate.
  11. Stimulere cellene ved tilsetning av 1 ug av renset armensk hamster anti-mus-antistoff CD3ε i 500 ul RPMI-1640 med 10% FBS.
  12. Tilsett 2 x 10 6 HDN eller LDN i 300 pl RPMI-1640 med 10% FBS til CFSE-merkede splenocytter, og inkuber i 3 dager ved 37 ° C. Løse brønner nøytrofile bør få 300 mL medium. Totalt volum i hver brønn bør være 1 ml.
  13. Samle cellene og forberede dem for flowcytometri. Cellene resuspenderes i 100 pl FACS buffer (Protocol 5), og tilsett 10 ul av FcR Blokkering Reagens. Inkuber i 5 min ved RT.
  14. Tilsett 1 &# 956; l av APC-konjugert anti-CD8a-antistoff og inkuberes i 15 min ved RT.
  15. Bestem CFSE fluorescensintensiteten på CD8 + -T-celler ved flow-cytometri (figur 5). Den CFSE intensitet halveres ved hver celledeling. Således kan antall celledelinger bestemmes av intensiteten av CFSE farging.

10. nøytrofilmigrasjon analysen

  1. Seed 5x10 5 4T1-celler i 7 ml optimaliserte redusert serummedium supplert med 0,5% FBS i en 25 cm2 vevskulturkolbe og inkuberes 24 timer ved 37 ° C.
  2. Overfør 800 ul av supernatanten til den nederste kammer i en migrasjons plate med en porestørrelse på 5 um.
  3. Resuspender 2 x 10 5 nøytrofile i 400 ul optimalisert redusert serum medium supplert med 0,5% FBS. Påfør cellesuspensjon til den øverste kammeret og inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
  4. Ved slutten av inkubasjonen, fjerne det øverste kammer ogtelle antallet nøytrofiler som har migrert til den nedre kammer.

11. Overvåking Neutrofil Produksjon av reaktive oksygenforbindelser (ROS).

  1. Forbered 1,1 x 10 6 neutrofiler / ml i Hanks balanserte saltoppløsning uten fenolrødt. Plate 180 ul inneholdende 2 x 10 5, nøytrofile celler i hver brønn av en 96 hvit-flat-bunnbrønnplate.
  2. Sett platen i en luminescens plateleser. Tilsett 20 ul av en 500 uM Luminol-løsning i PBS til hver brønn for å få en sluttkonsentrasjon på 50 uM. Les basal kjemiluminescens for 1 sek i en tid løpet av 5 minutter med 10 sekunders intervaller.
  3. Legg til en stimulerende (f.eks PMA ved en konsentrasjon på 10 nM eller 100 nM eller fMLP i en konsentrasjon på 10 uM). Tilbered en 10x konsentrert oppløsning av hvert middel i Hanks balanserte saltoppløsning uten fenol rød og tilsett 22 ul til de respektive brønner. Å kontrollere brønner legge 22 mL kjøretøy.
  4. Målere chemiluminescence i plateleser. Har både en kort (hver 10 sek i 5 min) og en lang (hvert minutt i 1 time) tidsforløpet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en fersk studie identifiserte vi en antimetastatisk funksjon for nøytrofile 6. Neutrofiler fra tumor-bærende mus skaffe en cytotoksisk fenotype, og har kapasitet til å drepe tumorceller 6. Dette er i motsetning til neutrofiler fra naive mus som ikke har noen signifikant anti-tumor effekt 6. Flere av teknikkene beskrevet i protokollen avsnitt er blitt anvendt for å studere antitumor nøytrofil-funksjon in vitro og in vivo 6.

Tumor cytotoksiske neutrofiler kan oppnås fra tumor-bærende mus seks. For å oppnå dette målet, ble musene orthotopically injisert med 4T1 celler i venstre lyskemelkefettpute (protokoll 1). Ved dag 21 etter tumor-inokulering, den primære tumoren nådde en størrelse på 1 - 2 cm 3 (figur 3 - tumoren er tydelig i den nedre venstre del av magen). På dette tidspunkt ble musene avlivet, og 1 ml blod ble tatt (per mus)ved hjertepunktur (figur 3). Parallelt ble blod fra en naiv, ikke-tumorbærende mus trukket. HDN ble deretter renset på en densitetsgradient (Protocol 2.1 og figur 4) for å gi et meget rent (> 98%) populasjonen av nøytrofiler. Neutrofil levedyktigheten ble bestemt ved trypan blå farging (Protocol 2.1). Neutrofilene ble deretter resuspendert i optimalisert redusert serummedium inneholdende 0,5% FBS ved 2 x 10 6 neutrofiler / ml.

For å teste den utstrekning av nøytrofile cytotoksisitet, tilsatte vi 10 5 nøytrofile celler (50 pl av en 2 x 10 6 neutrofiler / ml stamoppløsning) for å luciferase som uttrykker 4T1 målceller (5000 celler / brønn i 100 ul) i en flatbunnet 96 hvitt -Vel plate (protokoll 7). Etter en O / N inkubasjon ble cellene vasket i PBS og lysert i passiv cellelyseringsbuffer, og luciferase-aktiviteten i hver prøve ble testet for å evaluere graden av nøytrofil cytotoksisitet ( (figur 2B, tumor gratis), nøytrofile renset fra tumorbærende mus viser signifikant cytotoksisitet (figur 2B, tumor peiling).

For å teste de immunsuppressive egenskaper i LDN og HDN vi brukte T-celle-proliferasjonsanalyse (protokoll 9). Vi evaluerteantall CD8 + celler i ubehandlede splenocyttene og splenocyttene i behandlet med en aCD3 antistoff, som var dyrket alene, og celler som ble dyrket i nærvær av LDN eller i nærvær av HDN (figur 5A-D). Legg merke til den dramatiske økningen i CD8 + celler etter CFSE + anti-CD3-stimulering (sammenlign øvre høyre panel i A og B) den dramatiske hemmende effekten av undertrykkende LDN (sammenlign øvre høyre panel i B og C) og mangel på inhiberende effekt av HDN (panel D). Vi evaluerte også graden av CFSE retensjon, som en indikasjon for proliferasjon. På figur 5E, presenterer den oransje kurven ubehandlede CD8 + celler, den blå kurven CD8 + celler, behandlet med aCD3 antistoffer, den røde kurven CD8 + celler stimulert med aCD3 i nærvær av LDN og den grønne kurven representerer CD8 + celler stimulert med α; CD3 i nærvær av HDN. Legg merke til bevegelse mot venstre i aCD3 behandlede celler (blå kurve) og aCD3 behandlede celler dyrket med HDN (grønn kurve), noe som indikerer CD8 + celle-proliferasjon.

Figur 1
Figur 1. Neutrofil morfologi. Lysmikroskopi bilde av høy tetthet (A) og med lav tetthet, nøytrofile celler (B) farget med hematoksylin og eosin (H & E) følgende tynne lag cellepreparat. (C) En transmisjons-elektronmikroskopi (TEM) image av en høy tetthet nøytrofile. Baren representerer 1000 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Blod nøytrofiltall øke med svulst progression og nøytrofile skaffe seg et cytotoksisk fenotype. (A) Det sirkulerende nøytrofile nummer per 1 ml ble tellet ved hjelp av FACS på forskjellige dager etter tumorcelle inokulasjon i BALB / c-mus. Antallet sirkulerende CD11b + Ly6G + nøytrofile øker kontinuerlig med 4T1 tumorprogresjon. (B) 4T1 bryst karcinomaceller var co-kultivert med høy tetthet nøytrofile fra enten naive mus (Tumor gratis) eller 4T1 tumorbærende mus (Tumor bærende) mus, eller ruges i medium i fravær av nøytrofiler (forts.) ved 37 ° C i 20 timer. Neutrofiler for tumorbærende mus, men ikke fra tumorfrie mus viser signifikant cytotoksisitet mot tumorceller 4T1. Feilfelt representerer ± SEM ** p <0,01 ved hjelp av en t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Figur Figur 3. Innsamling av murine blod via hjertestans punktering. Musen ble avlivet i en induksjonskammeret under langsom CO 2 flyt. Umiddelbart etter at mus har tatt sin terminal pust, blir den lagt på ryggen og en 1 ml heparinisert sprøyte føres inn i bunnen av sternum til n hjerte. Sakte dra i stempelet for å suge blod. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Neutrofil rensing fra fullblod. (A) 3 ml av 1,077 g / ml sukrose forsiktig lagt på toppen av 3 ml 1,119 g / ml sukrose for å danne en diskontinuerlig gradient. Hele murine blod, fortynnet i PBS-BSA (0,5%) til et endelig volum på 6 ml, blir deretter lagt på toppen av 1,077 g / ml sukrose (B) Etter en 30 minutters sentrifugering ved 700 x g uten pause, tre distinkte fraksjoner kan observeres.; R - røde blodlegemer i pellet, G - den granulocytisk fraksjon inneholdende høy tetthet neutrofiler, M -. Mononukleære fraksjon inneholdende mononukleære celler og med lav tetthet, nøytrofile celler (C) nytappet humant blod ble blandet med et likt volum av Dekstran 500 ( 3%) og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Den øverste fraksjon som inneholdt de hvite blodlegemer (buffy coat) blir så lagt lagvis på toppen av 10 ml 1,077 g / ml sukrose (D) Ved å følge en 30 min sentrifugering ved 400 x g uten avbrekk, kan to distinkte fraksjoner holdes.; R + G - pellet inneholder røde blodceller og høy tetthet nøytrofile, M -. Mononukleær fraksjons inneholder mononukleære celler og low-density nøytrofile Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 5
Figur 5. Undertrykkelse av T-celleformering. Strømningscytometri-analyser som viser antallet CFSE-merkede CD8 + celler dyrket i fravær av stimulus (A), etter stimulering med aCD3 antistoff i fravær (B) eller nærvær av LDN (C) eller HDN (D) (E) Histogram presentasjon av CFSE intensitet i CD8 + celler fra paneler A -.. D Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nøytrofiler er den mest tallrike av alle hvite blodlegemer og er de første reaksjoner i tilfeller av infeksjon og betennelse. Som sådan, er de svært følsomme for ytre signaler og blir lett aktivert. I tillegg, neutrofiler har en svært kort halveringstid, og en hurtig omsetning. Sammen utgjør disse egenskapene heve flere problemer i arbeidet med nøytrofile, slik at unike eksperimentelle strategier er nødvendig. For eksempel er det flere nøytrofile rensing strategier, hver med sine egne fordeler og ulemper.

Et viktig skritt i arbeidet med nøytrofile er deres rensing fra fullblod. Neutrofiler kan bli effektivt renset ved anvendelse av enten tetthetsgradienter eller antistoff-baserte strategier (positiv eller negativ seleksjon). Vår metode for valg er bruk av tetthetsgradienter, siden det gir et høyt antall høyrensede nøytrofiler med minimal ikke-spesifikk aktivering. Men som vi viser i en fersk studie 21, viddh tumorprogresjon neutrofiler akkumuleres i høye tall i det mononukleære lav tetthet fraksjon. Under disse betingelser ved bruk av en densitetsgradient tilveiebringer en meget ren høy tetthet nøytrofil fraksjon, gjør det ikke representerer hele sirkulerende nøytrofile repertoaret, og en lav-tetthet nøytrofil fraksjon som er sterkt forurenset med andre mononukleære celler (lymfocytter og monocytter). Under disse omstendigheter metode for valg er et antistoff-baserte rensing, fortrinnsvis negativ seleksjon. Anvendelse av antistoffer for å rense nøytrofiler gir høyrene nøytrofiler og bedre representerer hele det sirkulerende nøytrofile repertoar. Men la merke til at jo lenger de nøytrofile inkuberes med antistoffer, er sjansene for uspesifikk aktivering økning. Vi foreslår derfor at for best resultat, bør antistoffbasert nøytrofile rensing utføres så raskt som mulig. Antistoff-baserte nøytrofil rensing er også metoden for valg når purifying nøytrofile fra vev eller svulster.

Uavhengig av renseprosedyre som er valgt, renhet, levedyktighet og funksjonell integritet må strengt evalueres. Renheten av neutrofiler kan bestemmes ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av antistoffer som reagerer med nøytrofile overflatemarkører. I mus, er Ly-6G spesifikt for nøytrofile, som er preget av en CD11b + Ly-6C lav Ly-6G + F4 / 80 - fenotype. Menneskelige nøytrofile uttrykker ikke en markør analog til Ly-6G og er ofte preget av uttrykket av CD11b, CD15, CD16, og CD66b. Siden nøytrofile har Fc reseptorer, disse må blokkeres før farging. Neutrofiler kan også skilles fra de andre hvite blodlegemer ved å ha en høyere SSC. Levedyktighet bør bestemmes ved slutten av renseprosessen (trypanblått, protokoll 2.1) og bør være konsekvent større enn 98%. Funksjonell integritet bør bestemmes av purification av nøytrofile fra naive mus. Disse nøytrofile celler ikke er aktivert, og gi ikke-cytotoksiske for tumorkontroll-innesluttet neutrofiler i en innstilling ko-kultur med tumorceller (protokoll 7).

Den korte halveringstid for blodneutrofiler sammen med det lave antallet nøytrofiler (~ 3-5 x 10 5) oppnådd fra 1 ml blod fra et naivt 6 - 8 uker gamle mus, har gjort det vanskelig å utforske museblod nøytrofil-funksjon i vitro. Nøytrofile tallene øker jevnt og trutt i statene betennelse og tidvis i kreft, noe som representerer en tilstand av kronisk betennelse 7. Noen forskere har forsøkt å finne alternative kilder for nøytrofile, som for eksempel benmargen 20. Kan oppnås et høyt antall nøytrofile i mus 4-24 timer etter en intraperitoneal injeksjon av 1 ml av en 3% løsning thioglycollate kjøttkraft eller 1 ml av en 1 mg / ml Zymosan En oppløsning i saltoppløsning. Men disse fremkalt nøytrofile ikke utøve enny anti-tumorigent aktivitet (upublisert observasjon).

. Granot et al 6 observert at BALB / c mus inokulert orthotopically med mus 4T1 brystcarcinom utvikle neutrofili som forverrer ved tid (figur 2A), slik at 20-40 millioner blodneutrofiler kan lett isoleres fra 1 ml blod i 3 - 4 uker post-tumorinokulasjon. Disse nøytrofile har kjøpt anti-tumor aktivitet, og har derfor blitt kalt tumor-innblandet nøytrofile (TEN), for å skille dem fra naive nøytrofile (figur 2B). Mens høy tetthet nøytrofiler (HDN) er sterkt anti-tumorigen, lav tetthet nøytrofiler (LDN) som genereres i sammenheng med kreft har ikke 21. Høy tetthet neutrofiler fra benmarg og milt av tumorbærende mus har også antitumoraktivitet (upubliserte data). Det bør bemerkes at med tumorprogresjon milten blir gradvis forstørret (splenomegali), med ibretter mengder nøytrofile.

For å spore skjebnen til nøytrofile følge deres adoptiv overføring, disse må merkes. Nøytrofile kan merkes in vivo ved å injisere bromdeoksyuridin (BrdU) i tumorbærende eller naiv mus 2 dager før isolasjon. BrdU er en analog av DNA forløper tymidin som er inkorporert i de nylig syntetiserte DNA i prolifererende celler. I tilfelle av neutrofiler, vil BrdU bli innarbeidet i prolifererende forløperceller som beholder BrdU flekker ved å differensiere til modne post-mitotiske nøytrofiler. Den innlemmet BrdU kan farges ved hjelp av spesifikke anti-BrdU fluorescerende antistoffer. De BrdU + cellene kan deretter bli analysert ved flow-cytometri. En annen tilnærming er å merke de isolerte neutrofiler med en celle tracker fargestoff slik som 5-karboksyfluorescein N-succinimidylester (CFSE). CFSE er en esterforbindelse som kan passere gjennom levedyktige cellemembraner. Den har en amino-reaktiv suksinimidyl-gruppe som fører til den kovalente binding av fluorescein til proteiner og andre amino-grupper i cellen, og celleoverflaten. De CFSE-merkede celler kan bli analysert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av 488 nm argon laser. De to merkingsteknikker er forskjellige i det faktum at BrdU merking avhengig av prolifererende forløperceller, og ikke alle sirkulerende nøytrofiler vil bli merket, mens CFSE vil farge alle nøytrofiler. Påvisning av CFSE er mer oversiktlig enn BrdU flekker, men BrdU merking er en god måte å følge den umodne til å modne nøytrofile konvertering.

Vi har også beskrevet flere metoder for å bestemme den anti-tumor og anti-metastatisk funksjon av nøytrofiler. Disse inkluderer nøytrofile utarming, nøytrofile adoptiv overføring, tumor nøytralisasjonstest og lungemetastase seeding analysen. Hver av disse analysene oppnår et bestemt aspekt av anti-tumor nøytrofil-funksjoner. For eksempel, Granot et al. 6 observert at ved depletion av nøytrofiler, er antallet lungemetastaser i 4T1 tumorbærende mus øket, noe som tyder på en antimetastatisk rolle av nøytrofiler. Ved neutrofil adoptiv overføring, blir de tumorceller injisert intravenøst ​​4 timer før injeksjon av renset HDN. Evnen av tumorcellene til å danne lunge- og levermetastaser er fulgt i en tidsstudium ved hjelp av en optisk in vivo bildedannende system. Mus som fikk HDN viste færre metastaser enn gjorde kontrollmus 6. I tumoren nøytraliseringstest, blir de tumorceller injisert subkutant med eller uten HDN, tilstedeværelse av HDN reduserer tumorvekst 21. I metastatisk seeding analysen, er GFP-merkede tumorceller injisert intravenøst ​​i kontroll eller nøytrofil-utarmet pre-metastatiske tumor-bærende mus, og evnen til de GFP-merkede celler i frø i lungen blir bestemt. Lungene av pre-metastatiske tumor-bærende mus kjennetegnes ved høy neutrofil infiltrering som forhindrer tumorcelle seeding i den spesifikke organ 6. Dette betyr mer metastatiske foci i nøytrofil-utarmet mus sammenlignet med kontroll-tumor-bærende mus.

Protokollene beskrevet fokusere på å studere neutrofil funksjon i sammenheng med kreft og gi strategier for å evaluere kreft-relaterte nøytrofile egenskaper både in vitro og in vivo. Men den nøytrofile rensing strategier samt noen av de eksperimentelle prosedyrene som er beskrevet kan anvendes for å studere nøytrofil-funksjon i et bredt spekter av eksperimentelle omgivelser, der nøytrofile spille en avgjørende rolle (dvs. betennelse og infeksjon).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ZG er støttet med tilskudd fra I-CORE Program of The Israel Science Foundation (Grant No. 41/11), den Abisch-Frenkel Foundation, Rosetrees Trust, Israel Cancer Research Foundation (ICRF - Forskning Career Development Award) og BEKYMRING fundament. ZGF er støttet med tilskudd fra Israel Cancer Research Foundation (ICRF - Forskning Career Development Award), sjefsforsker i Israel Helsedepartementet og Israel Lung Association.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).

Tags

Immunologi Neutrophil isolasjon tumor medføres nøytrofile høy tetthet nøytrofiler low-density nøytrofiler anti-tumor cytotoksisitetstester BrdU merking CFSE merking luciferase assay nøytrofile utarming anti-metastatisk aktivitet lungemetastatisk seeding analysen nøytrofile adoptiv overføring.
Isolering og karakterisering av nøytrofiler med anti-tumor egenskaper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sionov, R. V., Assi, S.,… More

Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., Fridlender, Z. G., Granot, Z. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter