Cell organisering av kraniofaciale bein har lenge vært en teori, men aldri direkte visualisert. Multispektral celle merking og in vivo levende bildebehandling tillater visualisering av dynamisk celle atferd i sebrafisk underkjeven. Her, til vi detalj protokollen manipulere Zebrabow transgen fisk og direkte observere celle innskyting og morfologiske endringer av chondrocytes i Meckels brusk.
Utvikling av virveldyr kraniofaciale strukturer krever nøyaktig koordinering av celle migrasjon, spredning, heft og differensiering. Mønstring av Meckels brusk, en første svelget bue derivat, innebærer migrasjon av kranie neural crest (CNC) celler og progressive partisjonering, spredning og organisering av differensierte chondrocytes. Flere studier har beskrevet CNC migrasjon under underkjeven morphogenesis, men detaljene om hvordan kondrocyttene oppnå organisasjon i vekst og utvidelse av Meckels brusk er fortsatt uklart. Den sox10 begrenset og kjemisk indusert Cre rekombinase-mediert rekombinasjon genererer permutasjoner av ulike fluorescerende proteiner (RFP, YFP og CFP), og dermed skape en multi-spektral merking av stamceller og deres avkom, som gjenspeiler forskjellige klonale populasjoner. Ved hjelp av konfokal time-lapse fotografering, er det mulig å observere chondrocytes behavieller under utviklingen av sebrafisk Meckels brusk.
Multispektrale celle merking gjør det mulig for forskere å demonstrere forlengelse av Meckels chondrocytter. I forlengelse av Meckels brusk, som et forvarsel om kjeven, chondrocytes intercalate å gjennomføre utvidelsen som de stakk i en organisert encellede lagdelte rad. Unnlatelse av dette organisert interkalerende prosess for å megle celle forlengelse gir mobil mekanistisk forklaring for hypoplastisk kjeven at vi observerer i underkjevens misdannelser.
Kraniofaciale utvikling krever kompliserte molekylære, cellulære og vev interaksjoner å kjøre celleproliferasjon, migrasjon og differensiering 1,2, 3. Denne tett regulert og komplisert prosess er gjenstand for genetiske og miljømessige forstyrrelser, slik at kraniofaciale misdannelser er blant de vanligste medfødte misdannelser 1-9. Mens kirurgiske inngrep forbli bærebjelke i behandling for kraniofaciale anomalier, forstå utviklingen basis er avgjørende for å skape fremtidige terapier. Derfor studerer morphogenesis og mekanismene i konvergens og forlengelse og celle integrasjon gir ny innsikt i dannelsen av det kraniofaciale skjelettet 1.
Kranie neural crest migrere og fylle den første svelg bue, deretter danne sammenkoblede underkjevens prosesser som strekker seg for å danne Meckels brusk, som et forvarsel om kjeven. Morphogenesis of Meckels brusk krever kondrocytt organisasjon via retnings spredning, celle polarisering og differensiering 1,10. Men intricacy av kondrocytt organisasjon i vekst og utvidelse av Meckels brusk er fortsatt uklart. Forstå dynamisk celle atferd er avgjørende for å forstå medfødte misdannelser som påvirker mandibular størrelse, for eksempel hypoplastisk kjeven fenotyper 11.
Sebrafisk embryo tilbyr mange utviklings og genetiske fordeler for detaljert studie av Meckels brusk morphogenesis. Deres genetiske tractability, åpenhet, ex vivo og rask utvikling er kraftige fordeler utlån det godt for observasjon av celle bevegelse og organisering av levende avbildning 6. Bruke avstamning-sporing verktøy, for eksempel sox10: kaede transgen linje, har vi og andre avgrenset neural crest opprinnelsen til embryonale kraniofaciale skjelettet 1,5. USIng sox10: ERT2-Cre med Ubi: Zebrabow-M transgen linje, er det nå mulig å utforske detaljer om cellulære bevegelser under kraniofaciale utvikling. Den Zebrabow-M, er en transgen linje konstruert med ubiquitin promoter driver uttrykk for forskjellige fluorophores, hver flankert av Lox nettsider 8. Den Zebrabow-M standard fluorophore er Red, uttrykker RFP. Etter induksjon av Cre uttrykk, Zebrabow-M konstruere recombines og celler uttrykker en kombinasjon av ulike fluoroforer (RFP, CFP og YFP) skaper multispektrale uttrykk i embryoet. Alle dattercellene som deler fra de merkede cellene etter rekombinasjon arrangementet blir så clonally merket, slik at cellepopulasjoner som stammer fra ulike sidestilte stamfedre er clonally merket. Ved denne celle kloning merking, kan cellene proliferasjon og migrering med klonal oppløsning følges (figur 1 og 2).
Alcian blått og photoconvertible transgene linjer som beskrevet ovenfor utfyller hverandre for å definere innviklet prosess av brusk og bein utvikling. Imidlertid har levende cellemigrasjon og organisasjon under organ lenge vært en teori og indirekte demonstrert men aldri visualisert. Zebrabow-M transgen linje kombinert med en brusk bestemt Cre tillater samtidig levende observasjon av alle disse forskjellige arrangementer som er involvert i bein og brusk formasjon. Denne teknikken gjør det mulig å studere nedre kje…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Alex Schier for velvillig deler Zebrabow-M transgen linje, Geoffrey Burns for pDEST vektor og Renee Ethier-Daigle for godt vare på fisken anlegget og linjer.
FINANSIERING:
Vi er takknemlige for generøs finansiering støtte fra NIDCR RO3DE024490 og Shriners Hospitals for Children (ECL) og postdoktortreningsstipend fra Shriners Hospitals for Children (LR og YK).
Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
Equipments | |||
Bright field microscope | |||
Fluorescent microscope | |||
Confocal microscope | |||
Image processing software |