Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.
The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.
कीमोटैक्सिस के रूप में जाना एक एकाग्रता ढाल की दिशा में कोशिकाओं के वरीय आंदोलन, शरीर में रोग और शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस तरह के उदाहरण त्वचा और म्यूकोसा घाव भरने 1, morphogenesis 2, सूजन 3, और ट्यूमर के विकास 4,5 हैं। यह भी कैंसर की कोशिकाओं को दोनों व्यक्तिगत और सामूहिक सेल प्रवास रणनीतियों 6 के माध्यम से विस्थापित कर सकते हैं कि दिखाया गया है। इसके अलावा, diffusional अस्थिरता तंत्र पोषक तत्वों का स्रोत की ओर से आप्रवासन और इस प्रकार व्यापक क्षेत्रों और ऊतकों 7 आक्रमण कर सकते हैं तो एक tumorous शरीर / वस्तु से एक या क्लस्टर कोशिकाओं के विभाजन के लिए प्रेरित कर सकते हैं।
इसके अलावा, यह विविध प्रवास तंत्र की वजह से आसंजन अणुओं 8 के विभिन्न भूमिकाओं के लिए, 2 डी में और 3 डी में सक्रिय हो सकता है कि दिखाया गया है। इसलिए, इन विट्रो assays में physiologically प्रासंगिक के लिए एक कदम एक measureabl में सेल गतिशीलता की जांच के लिएई और सरल तरीका सेल आंदोलन घटना 9 को समझने में महत्व का है। दुर्भाग्य से, सेल प्रवास का विश्लेषण करने में कठिनाई है, एक व्यापक मात्रात्मक कीमोटैक्सिस परख आमतौर पर निष्पक्ष सेल गतिशीलता और परिवहन घटना मॉडलों की माप पर स्थापित एक लंबे श्रमसाध्य विधि की आवश्यकता है।
सेल कीमोटैक्सिस जांच करने के लिए विगत प्रयोगात्मक दृष्टिकोण Boyden कक्ष 10 और तहत agarose परख 11 में शामिल हैं। हालांकि, इन जल्दी assays के भीतर, सेल प्रवास के प्रयोगों के समय के संबंध में आंदोलन की निगरानी नहीं की थी। अधिक महत्वपूर्ण बात, प्रयोगों के लिए इस्तेमाल एकाग्रता ढ़ाल अच्छी तरह से परिभाषित नहीं किया गया है या केवल कुछ ही घंटे से अधिक नहीं के लिए संकेत बनाए रखना है, जबकि पूरी तरह से समझ में आया। इसके अलावा, जल्दी कीमोटैक्सिस चैम्बर के प्रयास के दो आयामों को सेल प्रवास प्रतिबंधित है और एक प्रवास 12 के कैनेटीक्स नजर रखने के लिए अनुमति नहीं दी। Boyden कक्ष को देखते हुए, एक समापन बिंदु परखशोधकर्ता नेत्रहीन प्रवास का निरीक्षण करने की अनुमति नहीं होगी और सीधे chemokinesis (यादृच्छिक आंदोलन) से कीमोटैक्सिस (दिशात्मक आंदोलन) को अलग नहीं कर सका। इसके अतिरिक्त, के ध्यान में लीन होना आकार और मोटाई में कई चर-मतभेद आसानी से पुन: पेश करने के लिए बहुत मुश्किल चैम्बर झिल्ली कर दिया है, और chemokines 13,14 कोशिकाओं के प्रवासी प्रतिक्रिया छुपाया।
Microfluidics की नई समझ के साथ, नए कक्षों और सूक्ष्म उपकरणों मध्य प्रवाह शर्तों के तहत सेल हरकत की जांच के लिए एक साधन के रूप में जांच या 15,16 कीमोटैक्सिस किया गया है। इन नए उपकरणों के अंतर्गत, नया सेल मेट्रिक्स शुरू किए गए थे और एक सेल 17,18 पर कतरनी तनाव के प्रभाव की तरह, की जांच की। दुर्भाग्य से, अतीत और वर्तमान microfluidic कीमोटैक्सिस कक्षों ट्यूमर सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस, और im सहित कई जैविक प्रक्रियाओं, के बाद से 2 डी substrates के एक महत्वपूर्ण झटका करने के लिए सेल प्रवास के अध्ययन के लिए सीमितmune सेल प्रवास, 3 डी प्रवास शामिल है।
प्रत्यक्ष अवलोकन कक्षों-जहां एक chemoattractant समाधान कोशिकाओं से युक्त एक 3 डी जेल के साथ संपर्क में है भी भी 19,20 सूचना दी गई है। इन कक्षों क्षैतिज एक दूसरे के बगल में 21 या गाढ़ा छल्ले के रूप में 22 में शामिल हो गए हैं, दो डिब्बों, एक chemoattractant युक्त एक और कोशिकाओं से युक्त एक है। इन प्रणालियों को सही दिशा में इशारा कर रहे हैं, लेकिन समय की एक विस्तारित अवधि के लिए एक कीमोटैक्सिस प्रणाली नहीं रखते।
इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने यह भी डायलिसिस कोशिकाओं, साथ ही हीड्रास्टाटिक दबाव 23-25 के अधीन कोलेजन नमूने के माध्यम से दरियाफ्त अणुओं के प्रसार में कोलेजन झिल्ली के माध्यम से diffusivity की जांच की है। कोलेजन जैल में कुछ प्रसार प्रयोगों के चुंबकीय क्षेत्र और रासायनिक निगमन 26 का उपयोग कर जेल की भौतिक और रासायनिक संशोधनों पर भरोसा करते हैं। Colla में diffusivity मॉडलिंग के लिए एक लोकप्रिय तरीकाgenous ऊतकों निरंतर बिंदु photobleaching के प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर निर्भर करता है। इस विधि उन्मुख मज्जा ऊतकों में बड़े अणुओं का प्रसार गुणांक में anisotropy पता चला है। फिर भी, photobleaching से जोड़ कार्टिलेज में प्रयोग किया जाता है और न मेट्रिसेस कोलेजन किया गया है। इसी तरह एक ओर जहां आवश्यक हो, मॉडलिंग प्रयोगों के लिए विशेष रूप से कोलेजन जैल के प्रसार गुणांक को समझने के माध्यम से किया जाना चाहिए। इससे भी महत्वपूर्ण बात, सिस्टम सेल बल पीढ़ी को मापने के लिए एक विधि का उपयोग नहीं करते।
दुर्भाग्य से, सबसे प्रणालियों एक आदर्श व्यवस्था के लिए एक या दो प्रमुख तत्व गायब होने लगते हैं: सेल ट्रैकिंग, मैट्रिक्स, reproducibility के एक आसानी से एक अपेक्षाकृत सरल सेट अप, के न्यूनतम के माध्यम से एक chemotactic कारक के साथ एक प्रसार ढाल समझ की इजाजत दी बातचीत सेल सेल, और आयामी मात्रा का ठहराव के लिए इकाइयों (यानी, वेग, बल, विशिष्ट एकाग्रता) को मापने की क्षमता। मोघे एट अल। </eएम> 27 कोशिकाओं शुरू जेल भर में बिखरे बजाय फिल्टर सतह पर ध्यान केंद्रित किया गया है जिसमें इन आवश्यकताओं के सबसे को पूरा एक प्रणाली है कि प्रस्तावित है, लेकिन सेल उत्पन्न करता है कि सेना को मापने के लिए मुश्किल था।
इस प्रयोजन के लिए, हम एक सेल को मापने के लिए छवि विश्लेषण तकनीक के साथ युग्मित समय चूक माइक्रोस्कोपी पर आधारित है, जो मौजूदा assays, के आधुनिक प्रसार कक्ष सीमाओं को पार करने की अनुमति देता है जो एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में कीमोटैक्सिस की जांच के लिए एक planar ढाल प्रसार प्रणाली पेश एक 3 डी वातावरण में सेना। इस प्रोटोकॉल के विभिन्न कक्षों में 3 डी कीमोटैक्सिस जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक साधारण 3 डी प्रसार कक्ष बनाने का एक सरल, अभी तक अभिनव तरीका प्रदान करता है।
के साथ या कोशिकाओं के बिना सफल प्रसार प्रयोगों के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: सही ढंग से मोल्ड विधानसभा की स्थापना; हाइड्रोफोबिक coverslips की निकासी के दौरान नुकसान को रोकने के लिए आवश्यक मैनुअल निपुणता वि…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.
Silicone elastomer kit | Dow Corning Corp | 182 SIL ELAST KIT .5KG | a two-part misture with a 10:1 mix |
Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | CMB for 18mm round coverslips |
22mm Glass Coverslip | Fisher Scientific | NC0180281 | Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5 |
Machined aluminum metal cube | |||
Hobby utility knife | X-Acto | X3201 | |
3-(aminopropyl) trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778-5ML | |
Glutaraldehyde | Polysciences, Inc | 00216A-10 | Glutaraldehyde, EM Grade, 8% |
50 ml tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Standard floor model and tabletop centrifuges |
Glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm) |
Forceps | Fisher Scientific | 22-327-379 | Fine Point Forceps |
Cover glasses | Fisher Scientific | 12-518-105A | Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1 |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl | Gelest | SIT8174.0 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Acetic acid ACS reagent, ≥99.7% |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | Hexane |
anhydrous, 95% | |||
Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
High-precision diamond scribing tool | Lunzer | PV-081-3 | Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length |
Vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5C | High-Vacuum Grease |
15 ml tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface |
10X phosphate buffered solution | Fisher Scientific | BP399-500 | 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer |
1N sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 38215 | Sodium hydroxide concentrate |
Collagen I, rat tail | BD Biosciences | 354236 | Rat tail |
Micro centrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-332 | Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped |
Carboxylate-modified microspheres | Invitrogen | F-8813 | Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids |
Rhodamine | Sigma-Aldrich | 83689 | Rhodamine B for fluorescence |