Planar градиентной диффузионной системы по расследованию хемотаксис в 3D коллагеновой матрице
Summary
Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.
Abstract
The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.
Introduction
Предпочтительным движение клеток к градиенту концентрации, известный как хемотаксис, играет важную роль в патологических и физиологических процессов в организме. Такие примеры кожи и слизистой заживление ран 1, 2 морфогенез, воспаление 3 и 4,5 рост опухоли. Кроме того, было показано, что раковые клетки могут мигрировать через индивидуальных и коллективных стратегий клеточной миграции 6. Кроме того, диффузионные механизмы неустойчивости может вызвать разделение одного или кластерных клеток из опухолевого тела / объекта, а затем может иммигрировать в сторону источника питательных веществ и, таким образом, вторгнуться в более широкие области и тканей 7.
Кроме того, было показано, что различные механизмы миграции может быть активным в 2D и в 3D, из-за различных роли молекул адгезии 8. Таким образом, переход к физиологически соответствующих анализов в пробирке, чтобы исследовать подвижность клеток в measureablе и простой способ имеет значение для понимания движения клеток явления 9. К сожалению, сложность в анализе миграции клеток, комплексное количественно хемотаксиса, как правило, требует длительного трудоемкий способ, основанный на измерении беспристрастные подвижности клеток и транспортные явления моделей.
Прошедшие экспериментальные подходы к расследованию клеток хемотаксис включают камеру Бойдена 10 и нижней агарозы анализа 11. Тем не менее, в этих ранних анализов, миграции клеток эксперименты не следить за движением по отношению к времени. Более того, важно, градиенты концентрации, используемые для экспериментов не определены или полностью понял, а только поддержание сигнализации не более, чем несколько часов. Кроме того, в начале хемотаксис попытки камерные ограничено миграцию клеток к двум измерениям и не позволяют контролировать кинетику миграции 12. Глядя на камеру Бойдена, конечная точка анализане позволит исследователю наблюдать миграцию визуально и не может непосредственно различать хемотаксис (направленное движение) от хемокинез (случайной движения). Кроме того, несколько переменных-различия в размере пор и толщины мембраны производства камеру очень трудно легко воспроизводить и скрыл мигрантов реакцию клеток на хемокинов 13,14.
С нового понимания микрофлюидики, новые камеры и микро-устройства были исследованы в качестве инструмента для исследования клеток передвижения под внедренных условий потока или хемотаксис 15,16. В этих новых устройств, новые показатели клеток были введены и исследованы, как влияние напряжения сдвига на клетки 17,18. К сожалению, прошлые и нынешние микрофлюидных хемотаксис камеры ограничены исследования миграции клеток к 2D-субстратов важного неудачу, поскольку многие биологические процессы, в том числе вторжение опухолевых клеток и метастазов, и имиспольнил миграция клеток, привлекать 3D миграции.
Прямого наблюдения камеры-когда раствор хемоаттрактантной находится в контакте с 3D-гель, содержащий клетки были также также сообщил 19,20. Эти камеры имеют два отсека, один, содержащий хемоаттрактанта и один, содержащий клетки, соединены рядом друг с другом по горизонтали 21 или 22 концентрических колец. Эти системы в правильном направлении, но не держать систему хемотаксис в течение длительного периода времени.
Кроме того, исследователи также исследовали диффузии через мембраны коллагена в диализных клеток, а также диффузии молекул-меток через образцов коллагена подвергают гидростатическому давлению 23-25. Некоторые диффузии эксперименты в коллагеновых гелях полагаться на физических и химических модификаций геля с использованием магнитных полей и химических включение 26. Популярный метод для моделирования диффузии в Коллагенный ткани зависит от флуоресценции визуализации непрерывного точки фотовыцветания. Этот метод показал анизотропию коэффициентов диффузии макромолекул в ориентированных коллагеновых тканей. Тем не менее, фотообесцвечивание был использован в суставном хряще, а не коллагеновые матрицы. В то время как аналогичный, необходимые эксперименты моделирования должна осуществляться через специально понимания коэффициент диффузии коллагеновых гелей. Что еще более важно, эти системы не используют метод измерения поколение клеток силы.
К сожалению, большинство систем, кажется, не хватает одного или двух ключевых элементов для идеальной системы: позволяет отслеживания клетки, диффузионного градиента взаимопонимании с хемотаксических фактора через матрицу, относительно простого набора с легкостью воспроизводимости, минимизации межклеточных взаимодействий, а возможность измерения размерных единиц для количественной (т.е. скорость, сила, определенной концентрации). Moghe др. </eм> 27 предложил систему, которая выполнила большинство из этих требований, в которой клетки сначала диспергировали в течение всего гель, а не сконцентрированы на поверхности фильтра, но было трудно измерить силы, что клетка генерирует.
Для этой цели, мы представляем систему плоской градиент диффузии для расследования хемотаксис в коллагеновой матрице 3D, которая позволяет преодолеть ограничения современных диффузионной камеры существующих анализов, который основан на покадровой микроскопии в сочетании с методами анализа изображений для измерения клетки силы в 3D-среде. Этот протокол обеспечивает простой, но инновационный способ создания простого 3D диффузионной камеры, которые могут быть использованы для исследования 3D хемотаксис в различных клетках.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги для успешных экспериментов диффузии с или без клеток: правильно настройке сборки пресс-формы; развитие необходимой ловкость, чтобы предотвратить повреждение во время извлечения гидрофобных покровные; обеспечения, чтобы найти очень хорошую линейную стартовую лин…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.
Materials
| Silicone elastomer kit | Dow Corning Corp | 182 SIL ELAST KIT .5KG | a two-part misture with a 10:1 mix |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | CMB for 18mm round coverslips |
| 22mm Glass Coverslip | Fisher Scientific | NC0180281 | Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5 |
| Machined aluminum metal cube | |||
| Hobby utility knife | X-Acto | X3201 | |
| 3-(aminopropyl) trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778-5ML | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc | 00216A-10 | Glutaraldehyde, EM Grade, 8% |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Standard floor model and tabletop centrifuges |
| Glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm) |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327-379 | Fine Point Forceps |
| Cover glasses | Fisher Scientific | 12-518-105A | Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1 |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl | Gelest | SIT8174.0 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Acetic acid ACS reagent, ≥99.7% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | Hexane |
| anhydrous, 95% | |||
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| High-precision diamond scribing tool | Lunzer | PV-081-3 | Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length |
| Vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5C | High-Vacuum Grease |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface |
| 10X phosphate buffered solution | Fisher Scientific | BP399-500 | 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer |
| 1N sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 38215 | Sodium hydroxide concentrate |
| Collagen I, rat tail | BD Biosciences | 354236 | Rat tail |
| Micro centrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-332 | Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped |
| Carboxylate-modified microspheres | Invitrogen | F-8813 | Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich | 83689 | Rhodamine B for fluorescence |
References
- Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225 (2), 236 (1997).
- Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).
- Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).
- Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).
- Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).
- Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell’s sense of direction. Science. 284 (5415), 765-770 (1999).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).
- Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).
- Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).
- Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).
- Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).
- Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).
- Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).
- Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. d. L. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).
- Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).
- Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).
- Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
- Stephenson, F. H. . Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , (2010).
- Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
- Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).
- Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).
